六月雪提取物及其單體成分對(duì)LPS刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞分泌NO和IL—6的影響

郭培++柳航++朱懷軍++叢友權(quán)++葛衛(wèi)紅

[摘要] 目的 研究六月雪提取物及單體對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的抗炎作用，確定六月雪抗炎作用活性成分。 方法 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)建立調(diào)零組、對(duì)照組、給藥組，采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)終濃度為10、20、40、80、100、200、300、400 μg/mL的六月雪水提物，70%乙醇提取物及單體化合物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響；依據(jù)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥濃度，建立對(duì)照組、模型組、給藥組，采用一氧化氮（NO）試劑盒法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)六月雪提取物及其單體對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌一氧化氮（NO）以及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的影響。結(jié)果 相較于對(duì)照組，模型組RAW 264.7細(xì)胞NO表達(dá)顯著升高（P < 0.05）；與模型組相比，六月雪70%乙醇提取物及l(fā)yx-1、lyx-4～5能抑制NO、IL-6的分泌（P < 0.05）。結(jié)論 六月雪抗炎活性成分主要存在于70%乙醇提取物中，主要抗炎成分是丁香樹脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環(huán)氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環(huán)-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′，9′-二醇。

[關(guān)鍵詞] 六月雪；抗炎活性；一氧化氮；白細(xì)胞介素-6

[中圖分類號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0043-05

[Abstract] Objective To study the protective effect of extract from Serissa japonica on the lipopolysaccharides （LPS）-inflammatory response of macrophage cell line RAW 264.7 in mice， and to determine the anti-inflammatory active components from Serissa japonica. Methods In vitro cytotoxicity test， the block group， the control group and the medicine group were set up， the effect of aqueous extract， 70% ethanol extract and major monomer components （10， 20， 40， 80， 100， 200， 300， 400 μg/mL） on RAW 264.7 cell viability was examined by MTT assay. According to the results of in vitro cytotoxicity test， the control group， the model group and the medicine group were determined， the NO kit assay and the enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） were adopted to detect the NO and interleukin-6 （IL-6） release of extract and major monomer components on LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Results Compared with the control group， the expressions of NO were significantly increased in LPS-induced RAW 264.7 cells of model group （P < 0.05）. Compared with the model group， 70% ethanol extract and lyx-1， lyx-4，lyx-5 could inhibit the increase of NO and IL-6（P < 0.05）. Conclusion Active anti-inflammatory compositions of the Serissa japonica mainly exist in 70% ethanol extract， episyringaresinol， （7′S，8S，8′R）-4，4′-dihydroxy-3，3′，5，5′-tetramethoxy-7′，9-epoxylignan-9′-ol-7-one， （7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-dihydroxy-3′，3′，3′，5-tetramethoxy-7，9′：7′，9-diepoxy-4，8′-oxy-8，8′-sesquineolignan-7′，9′-diol are the major anti-inflammatory components.

[Key words] Serissa japonica； Anti-inflammatory activity； Nitric oxide； Interleukin-6

六月雪Serissa japonica （Thunb.） Thunb.是茜草科白馬骨屬植物，《安徽藥材》載：“與老母雞同煮，能治慢性腎炎水腫。”《湖南藥物志》載：“主治小兒驚風(fēng)，腹痛，目翳，齒痛，腎炎?！薄陡＝ㄋ幬镏尽份d：“主治久瀉，水腫，頸淋巴結(jié)核，腎盂腎炎?！辟F州一帶民間醫(yī)生用其治療胃腸炎、腎盂腎炎、水腫、疳積、痢疾等疾病[1-2]。南京鼓樓醫(yī)院制劑由荔枝草、車前草、六月雪、紫花地丁4味中藥組成，用于治療泌尿系統(tǒng)感染、腎盂腎炎等[3-4]。目前國內(nèi)外多研究復(fù)方六月雪藥的抗炎效果[5-7]，對(duì)單味中藥六月雪及其中單體化合物研究尚少。本研究通過LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7構(gòu)建炎癥模型[8-9]，探究六月雪水提物、70%醇提物及其單體的抗炎效果，考察單味藥六月雪及其中單體化合物的抗炎活性，為六月雪抗炎作用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（E500003）、胎牛血清FBS（E600001）、胰蛋白酶細(xì)胞消化液（E607001）、PBS（E607008）、青霉素-鏈霉素溶液（E607011）、四甲基偶氮唑鹽MTT（A100793）、二甲基亞砜DMSO（A100231）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脂多糖LPS B5：O55（Sigma 公司，110M4086V）；一氧化氮檢測(cè)試劑盒（S0021）購自碧云天生物研究所；IL-6（E0049Mo）購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2儀器

2424-2型二氧化碳培養(yǎng)箱（SHELLAB）；SH03014低溫高速離心機(jī)（美國科俊儀器公司）；CKX41SF型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化）；YXQ.SG41.280型手提式壓力蒸氣滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；ELx800光吸收酶標(biāo)儀（Bio Kit）；AG-245型1/萬電子分析天平（METTLER TOLEDO）；HY-4多用脫色搖床（江蘇金壇市正基儀器廠）；DW-86L626型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.3 藥材

六月雪購自南京藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為茜草科白馬骨屬六月雪Serissa japonica （Thunb.） Thunb.全草。樣本保存于鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，編號(hào)：gl201410002。

2 方法與結(jié)果

2.1 六月雪的提取分離

六月雪全草100 g，用70%乙醇回流2次，每次2 h，60℃減壓濃縮得到浸膏后凍干得3.0815 g[10]。取六月雪全草100 g，純水回流2次，每次2 h，60℃減壓濃縮得到浸膏后凍干得2.780 g[11]。單體化合物為70%乙醇提取物濃縮后浸膏采用高效液相提取分離，分別為丁香樹脂酚、8-羥基杜仲樹脂酚、8-羥基松脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環(huán)氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環(huán)-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′′，9′-二醇，依次記做lyx-1～5。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，將小鼠RAW 264.7細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞[12]。

2.3 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

胰酶消化細(xì)胞2 min后充分吹打混懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為6×104個(gè)/mL，200 μL/孔接種于96孔板。設(shè)置調(diào)零組（培養(yǎng)基）、對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、給藥組（終質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100、200、300、400 μg/mL），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含1 mg/mL MTT的PBS，37℃下孵化4 h，吸除MTT，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，490 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）= （藥物孔測(cè)定值-調(diào)零孔測(cè)定值）/（對(duì)照孔測(cè)定值-調(diào)零孔測(cè)定值）×100%。

2.4 一氧化氮含量測(cè)定

給藥組濃度根據(jù)“2.3”實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，以細(xì)胞80%存活率濃度為實(shí)驗(yàn)最高濃度，逐級(jí)降低，試圖得到最小有效抗炎濃度[14-16]。將RAW 264.7細(xì)胞懸液接種于48孔板，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔500 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，設(shè)對(duì)照組（只加入培養(yǎng)液），模型組（LPS終濃度為1 μg/mL），給藥組（分別為終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100、200、300 μg/mL的lyx-3；終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100、200 μg/mL的六月雪水提物、70%乙醇提取物、lyx-5；終濃度1 μg/mL的LPS+終濃度為2、10、25、50、100 μg/mL的lyx-1～2、lyx-4），每組4個(gè)復(fù)孔。將48孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后取出，吸取細(xì)胞上清液，按照NO試劑盒步驟操作，于酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算NO的含量。

2.5 IL-6含量測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞密度及加藥處理方法同“2.4”。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液上清液，ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞分泌的IL-6含量。以檢測(cè)波長為450 nm在多功能微孔板分析儀上測(cè)定吸光度值。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 提取分離化合物

從六月雪70%乙醇提取物中分離得到5種單體化合物[17]，結(jié)構(gòu)見圖1。

3.2對(duì)細(xì)胞活性的影響

考察不同濃度的六月雪水提取物、70%乙醇提取物及單體成分對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。與對(duì)照組比較，lyx-3濃度低于300 μg/mL，水提物、70%乙醇提取物、lyx-5濃度低于200 μg/mL，lyx-1～2、lyx-4濃度低于100 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著抑制或促進(jìn)作用。因而，lyx-3以濃度2、10、25、50、100、200、300 μg/mL，水提物、70%乙醇提取物、lyx-5以濃度2、10、25、50、100、200 μg/mL，lyx-1～2、lyx-4以濃度2、10、25、50、100 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

3.3六月雪提取物及單體化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞NO分泌的影響

采用Griess試劑法測(cè)定六月雪提取物及單體對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO分泌的影響。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液NO分泌增加。相較于模型組，給予六月雪70%乙醇提取物后，25、50、100、200 μg/mL劑量組均可明顯降低NO的表達(dá)（P < 0.01），六月雪水提物對(duì)NO的表達(dá)并無影響。5種單體中，僅lyx-1、lyx-4～5能抑制NO分泌，具有抗炎效果。單體化合物濃度亦會(huì)影響其抗炎效果，不同濃度各提取物及單體化合物對(duì)細(xì)胞分泌NO的影響見圖2～8。

3.4 對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞IL-6分泌的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-6分泌量顯著上調(diào)（P < 0.01）。與模型組比較，200 μg/mL六月雪70%乙醇提取物能顯著抑制IL-6分泌（P < 0.05）；而六月雪水提取物組對(duì)IL-6分泌無顯著影響；lyx-1、lyx-4～5均對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6有不同程度的抑制作用，而lyx-2、lyx-3對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6無影響。見圖9～15。

4 討論

觀察單體化合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，lyx-2～3、lyx-5基本母核一致，與lyx-1區(qū)別于8位的-OH，僅lyx-1對(duì)NO、

IL-6的分泌具有顯著的抑制作用，表明8位-OH可能對(duì)藥物與受體結(jié)合存在位阻，從而不能有效抗炎。由此發(fā)現(xiàn)取代基位置可能會(huì)直接影響單體化合物的藥理活性，可以嘗試結(jié)構(gòu)修飾達(dá)到改善藥理作用的目的。

綜上，本實(shí)驗(yàn)從六月雪70%乙醇提取物得到5種單體化合物，并借助1H-NMR，13C-NMR等解析結(jié)構(gòu)并對(duì)照文獻(xiàn)[18-20]，確定化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，對(duì)六月雪提取物及單體進(jìn)行活性篩選。結(jié)果表明，六月雪70%乙醇提取物、丁香樹脂酚、（7′S，8S，8′R）-4，4′-二羥基-3，3′，5，5′-四甲氧基-7′，9-環(huán)氧木脂烷-9′-醇-7-酮、（7R，7′R，7′R，8S，8′S，8′S）-4′，4′-二羥基-3，3′，3′，5-四甲氧基-7，9′：7′，9-雙氧環(huán)-4，8′-氧-8，8′-倍半新木脂烷-7′，9′-二醇。

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（收稿日期：2017-01-05 本文編輯：王 麗）