苦苣菜水提物抗急性炎癥活性及其機(jī)制研究

王振苗++董麗榮++賈評(píng)++田慧

[摘要] 目的 分析苦苣菜水提物對(duì)機(jī)體炎癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行研究。方法 取雄性健康昆明種小鼠100只進(jìn)行耳腫和足腫實(shí)驗(yàn)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為每組10例，分別為模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽性藥物組（陽性對(duì)照組）、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組（高劑量組）、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組（中劑量組）、苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組（低劑量組）。檢測不同組間血清及炎性組織液中環(huán)氧化酶（COX-2）、p38絲裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）水平。結(jié)果 不同劑量組間小鼠耳廓腫脹與足跖腫脹度均存在差異（P < 0.05）；與模型組相比，不同劑量組小鼠耳廓腫脹與足跖腫脹度均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大效果逐漸增強(qiáng)。陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組相比存在顯著性差異（P < 0.05）。陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量血清中的COX-2、p38 MAPK水平與模型組相比存在顯著性差異（P < 0.05）；陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組血清中的TNF-α、IL-6水平與模型組相比存在顯著性差異（P < 0.05）。結(jié)論 苦苣菜水提物的抗炎機(jī)制涉及到炎癥發(fā)生過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)和炎癥因子，有望研發(fā)成為有效的抗炎新藥，為防治炎癥性疾病提供新的藥用和食療資源。

[關(guān)鍵詞] COX-2；p38 MAPK；TNF-α；IL-6

[中圖分類號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0031-04

[Abstract] Objective To analysis the regulation effect of water extract of Sonchus oleraceus on inflammation related pathways and further investigate the mechanism. Methods 100 healthy male Kunming mice were selected for ear swelling and foot swelling test， which were randomly divided into model group by random number table method： dexamethasone（2 mg/kg） positive drug group（positive control group）， the water extract of Sonchus oleraceus 0.26 g/10 g dose group （high dose group）， the water extract of Sonchus oleraceus 0.13 g/10 g dose group （middle dose group）， Sonchus oleraceus 0.065 g/10 g dose group （low dose group）， with 10 mice in each group. Cyclooxygenase （COX-2）， p38 mitogen activated protein kinase（p38 MAPK）， tumor necrosis factor alpha（TNF-α） and interleukin-6（IL-6） levels of serum and inflammatory tissue fluid were detected in the different groups. Results There were significant differences in ear swelling and paw swelling in mice between different dose groups（P < 0.05）； compared with the model group， ear swelling and paw swelling in the different dose groups were inhibited to varying degrees， and the effect was increased with the increase of dose. COX-2， p38 MAPK， TNF-α， IL-6 levels of tissue fluid in the positive control group， middle dose group and high dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. COX-2 and p38 MAPK levels of serum in the positive control group， middle dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. TNF-α and IL-6 levels of serum in the positive control group， middle dose group and high dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. Conclusion The anti-inflammatory mechanism of water extract of Sonchus oleraceus involves several aspects and inflammatory factors in the process of inflammation， it is expected to be developed into new anti-inflammatory effective drugs， to provide new medicinal and therapeutic resources for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

[Key words] COX-2； p38 MAPK； TNF-α； IL-6

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）又名苦菜、滇苦菜、苦荬菜等，屬菊科，苦苣菜屬?？嘬牟藢僦参锏闹饕钚猿煞质潜栋胼祁惡忘S酮類，此外，還有香豆素類、甘油酸酯苷類、木脂素類等?？嘬牟思疤崛∥锞哂薪笛?、降壓、降脂、利尿、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。近年來，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦苣菜屬植物可明顯抑制動(dòng)物耳腫、足腫，并能抑制腹腔毛細(xì)血管通透性的增加，證明其具有抗菌、抗炎作用[2]。在臨床也常與其他中藥配伍用于治療腸胃炎、肺熱咳嗽、咽喉腫痛等多種炎癥性疾病。抗炎機(jī)制涉及到抗氧化、減少一氧化氮（NO）生成、抑制凋亡等多方面內(nèi)容，機(jī)制復(fù)雜，因此目前尚缺乏系統(tǒng)的闡明[3]。本課題旨在通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠后足跖腫脹建立急性炎癥模型，研究苦苣菜水提物對(duì)多種急性炎癥的拮抗作用，并通過檢測小鼠炎性組織液和血清中環(huán)氧化酶-2（COX-2）、p38 絲裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等多種炎癥相關(guān)因子的含量變化，進(jìn)一步探討苦苣菜水提物對(duì)這些細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的影響，對(duì)機(jī)體炎癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，初步分析苦苣菜水提物抗炎免疫活性的有關(guān)機(jī)制，為防治炎癥性疾病提供新的思路。

1儀器與材料

1.1主要儀器

Sigma4-15高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），Tecan Safire2酶標(biāo)儀（意大利Tecan公司），LE225D電子天平（德國Sartorius公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）等。

1.2主要試藥

二甲苯分析純（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110707），角叉菜膠（德國Sigma公司，批號(hào)127H1227），COX-2酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試劑盒、p38 MAPK（ELISA）試劑盒、TNF-α（ELISA）試劑盒、IL-6（ELISA）試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司）?？嘬牟瞬勺詢?nèi)蒙古土默特左旗田間，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室青梅、龐秀生教授鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康昆明種小鼠100只，體重20～22 g，2～3月齡，由中國食品藥品檢定研究院提供，均為無特殊病原體動(dòng)物（SPF），合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于室溫（23.0±2.0）℃、濕度40%動(dòng)物室內(nèi)，自由攝食，飲水，1周后用于實(shí)驗(yàn)，至實(shí)驗(yàn)時(shí)體重為30～35 g。該研究經(jīng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.4苦苣菜水提物的制備

取苦苣菜全草，陰干，剪碎，稱取原生藥130 g，加適量水浸泡30 min，按照1∶10固液比加水，煎煮60 min，收集濾液Ⅰ，濾渣加適量水煎煮45 min，得濾液Ⅱ，合并濾液Ⅰ、Ⅱ，經(jīng)減壓濃縮，得1.3 g/mL濃縮液100 mL，冷卻，置于4℃冰箱中備用。

1.5 分組與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分成10組（n=10），5組進(jìn)行耳腫實(shí)驗(yàn)，5組進(jìn)行足腫實(shí)驗(yàn)。兩組實(shí)驗(yàn)中均根據(jù)用藥不同設(shè)置模型組、地塞米松（2 mg/kg）陽性藥物組（陽性對(duì)照組）、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組（高劑量組）、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組（中劑量組）和苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組（低劑量組）。各組均采用灌胃（ig）給藥，給藥前夜禁食不禁水，給藥容量按體重計(jì)算0.2 mL/10 g，連續(xù)給藥5 d?？嘬牟怂嵛锔鲃┝拷M分別給予相應(yīng)濃度的苦苣菜水提物，陽性對(duì)照組給予地塞米松磷酸鈉溶液2mg/kg，模型組則分別給予等量生理鹽水。

1.6 急性炎癥模型的制備方法

二甲苯致耳腫脹模型：末次給藥30 min后，于每只小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)各均勻涂抹 100%二甲苯0.02 mL。致炎30 min后，脫頸椎處死小鼠，剪下小鼠左右耳，并用打孔器（直徑 9 mm）分別在左、右耳同一部位打下等大的圓形耳片，稱重，求左右耳片重量之差作為腫脹度。

角叉菜膠致足跖腫脹模型：末次給藥 30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL致炎，5 h后斷頭處死小鼠，取血，并從跟骨水平（踝關(guān)節(jié)中線以下）對(duì)稱剪下鼠足，稱重，以左右足重量差作為鼠足腫脹度。

腫脹抑制率（%） =（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）/模型組腫脹度×100%。

1.7 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的含量測定

血清：室溫血液自然凝固10～20 min，3000 r/min。收集上清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，可再次離心。

炎性組織液：整個(gè)致炎小鼠足爪稱重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理鹽水中，充分浸泡。在-4℃下以3000 r/min離心20 min，制得炎性組織液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。依?jù) ELISA試劑盒說明，應(yīng)用雙抗體夾心法，檢測血清及炎性組織液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，組內(nèi)多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 苦苣菜水提物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫的影響

不同劑量組間小鼠耳廓腫脹度存在差異，高劑量組腫脹度明顯低于中劑量組，中劑量組腫脹度明顯低于低劑量組（P < 0.05）；與模型組相比，苦苣菜水提物不同劑量組小鼠耳廓腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。見表1。

2.2 苦苣菜水提物對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫的影響

不同劑量組間小鼠足跖腫脹度存在差異，高劑量組腫脹度明顯低于中劑量組，中劑量組腫脹度明顯低于低劑量組（P < 0.05）；苦苣菜水提物不同劑量組小鼠足跖腫脹均受到不同程度的抑制，且隨著給藥劑量的增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。見表2。

2.3 苦苣菜水提物對(duì)小鼠炎性組織液中炎癥相關(guān)因子的影響

陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量、高劑量組的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平與模型組相比均存在顯著性差異（P < 0.05）。見表3。

2.4 苦苣菜水提物對(duì)小鼠血清中炎癥相關(guān)因子的影響

陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量的COX-2、p38 MAPK水平與模型組相比存在顯著性差異（P < 0.05）；陽性對(duì)照組、苦苣菜水提物中劑量與高劑量組的TNF-α、IL-6水平與模型組相比存在顯著性差異（P < 0.05）。見表4。

3 討論

在我國歷史上很早就有苦苣菜被當(dāng)作藥物使用的記載，在藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中都詳細(xì)記載了苦苣菜的藥理作用，由于藥性偏寒，味道較苦，被認(rèn)為具有清熱解毒、涼血止血等功效，在腸炎、痢疾、吐血等病癥的治療方面取得顯著效果[4]?？嘬牟撕卸喾N活性成分，除槲皮素、槲皮黃苷、吡喃葡萄糖苷等黃酮類成分外，還含有多種人體必需的微量元素，被認(rèn)為是具有多靶點(diǎn)抗炎作用的傳統(tǒng)中藥[5]。本研究主要選取COX-2、p38 MAPK通路及相關(guān)因子TNF-α、IL-6 進(jìn)行研究，探討苦苣菜水提物的抗炎作用。

通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠后足跖腫脹建立急性炎癥模型，結(jié)果顯示，苦苣菜水提物可明顯改善二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹與角叉菜膠所致小鼠的足跖腫脹，且在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著苦苣菜水提物含量的增加，COX-2、p38 MAPK水平明顯降低，且TNF-α以及IL-6因子水平明顯下降，提示苦苣菜水提物具有明顯的抗炎作用，與之前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6-7]。

COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成過程中一個(gè)重要的限速酶，可以將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。在多種炎癥性疾病的滲出液中均可檢測到COX-2mRNA 和COX-2蛋白的高表達(dá)[10]。因此，近年來COX-2被作為新型非甾體抗炎藥的作用靶點(diǎn)，從天然藥物中篩選有效的COX-2抑制劑成為研發(fā)新型抗炎藥物的有效途徑。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究證實(shí)，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等[11]。目前均已發(fā)現(xiàn)存在著多條并行的MAPKs信號(hào)通路，哺乳類細(xì)胞主要存在以下三條并行的MAPKs信號(hào)通路：ERK（extracellular signal-regulated kinase）信號(hào)通路，JNK（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/SAPK（stress-activated protein kinase，SAPK）通路與p38 MAPK通路。其中p38 MAPK通路在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與了炎癥介質(zhì)的合成調(diào)控，被認(rèn)為是抗炎藥物的重要靶點(diǎn)[12]。TNF-α是一種由內(nèi)毒素激活的淋巴細(xì)胞所分泌的具有多活性的細(xì)胞因子，具有雙重生物學(xué)作用，一方面是機(jī)體免疫防護(hù)的重要介質(zhì)，另一方面也可參與機(jī)體的免疫病理損傷。TNF-α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤和炎癥作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，同時(shí)還能刺激其他細(xì)胞因子如IL-4和IL-6的釋放，擴(kuò)大后者的生物效應(yīng)，作為一種重要炎癥介質(zhì)為人們所重視[13]。IL-6被稱為細(xì)胞因子的核心成員，是機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。已證明在多種自身免疫及腫瘤性疾病中均有異常，并與這些疾病的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。IL-6可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的分化，刺激肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白，后者可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化與聚集，催化和放大炎性反應(yīng)，對(duì)組織細(xì)胞帶來損害，因此被當(dāng)作反映機(jī)體炎癥和組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。IL-6不能刺激相應(yīng)細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其他細(xì)胞因子的效果。許多研究表明，IL-6是某些自身免疫性疾病中的關(guān)鍵炎性因子，疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，苦苣菜水提物可不同程度抑制COX-2、p38 MAPK的生成，對(duì)炎癥介質(zhì)的合成起到有效的調(diào)控作用，進(jìn)而緩解炎癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，苦苣菜水提物的抗炎機(jī)制涉及到炎癥發(fā)生過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)和炎癥因子，具有多靶點(diǎn)作用抗炎藥物的特點(diǎn)，符合目前抗炎有效藥物的研究方向，有望研發(fā)成為有效的抗炎新藥，為防治炎癥性疾病提供新的藥用和食療資源。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 周延萌，張小敏，范文巖，等.苦苣菜水提物的鎮(zhèn)咳祛痰及抗炎作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（4）：1027-1028.

[2] 王振霖，李鵬，李源，等.p38 絲裂原激活蛋白激酶通路對(duì)變應(yīng)性鼻炎中黏蛋白5AC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制初探[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25（20）：943-946.

[3] 周桂芬，張涵，呂圭源.苦苣菜中黃酮類化合物的含量測定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（1）：218-220.

[4] 吳曉寧，余陳歡，包啟年.杭白菊總黃酮抗炎作用及其機(jī)制初探[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（9）：1000-1004.

[5] 盧新華，唐偉軍，謝應(yīng)桂，等.苦菜提取物抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2006，13（4）：240-241.

[6] 崔碧姍，泰民堅(jiān). 苦苣菜屬植物化學(xué)成分與藥理作用[J].國外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，2008，23（5）：203-208.

[7] 張春霞，鄒存華，宋冬冬，等. P38MAPK信號(hào)通路對(duì)卵巢癌中尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，54（2）：68-74.

[8] 聶犇，余陳歡，王芳芳.石薺苧總黃酮抗炎作用及其機(jī)制研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（1）：65-66.

[9] 郭晴，何振華.p38MAPK信號(hào)通路與肺纖維化[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2016，44（4）：58-64.

[10] 梁統(tǒng)，覃燕梅，梁念慈.側(cè)柏總黃酮的抗炎作用及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（12）：1407-1410.

[11] 趙曉霞，王夢亮. 苦菜的營養(yǎng)成分及開發(fā)[J].現(xiàn)代園藝，2014（12）：40-41.

[12] 延衛(wèi)東，王瑞君，伺琰，等.黃芩苷藥理作用研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)，2002，23（12）：1127-1129.

[13] 王曉琳，周元麗，孫偉，等.p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá) [J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，54（8）：1-6.

[14] 李姿慧，王鍵，蔡榮林，等.參苓白術(shù)散通過ERK/p38 MAPK信號(hào)通路干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4的表達(dá) [J]. 中成藥，2015，37（9）：1883-1888.

（收稿日期：2016-12-25 本文編輯：王 麗）