加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟保護(hù)及自噬水平的調(diào)控作用?

于子凱，楊 斌，張 昱，王金虎，張 秋，郝 偉，趙晉寧

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

【實(shí)驗(yàn)研究】

加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟保護(hù)及自噬水平的調(diào)控作用?

于子凱，楊 斌，張 昱△，王金虎，張 秋，郝 偉，趙晉寧

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

目的：觀察加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)的影響。方法：設(shè)立空白、模型、替米沙坦及加味黃芪赤風(fēng)湯組，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)FN、LN、LC3和Beclin-1的表達(dá)及分布。結(jié)果：加味黃芪赤風(fēng)湯可保護(hù)阿霉素腎病大鼠腎臟，顯著抑制腎組織中的FN、LN，顯著拮抗自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的過度表達(dá)。結(jié)論：加味黃芪赤風(fēng)湯通過調(diào)控自噬水平對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

加味黃芪赤風(fēng)湯；自噬；阿霉素腎?。坏鞍啄?/p>

蛋白尿是慢性腎臟病的主要臨床表現(xiàn)，長(zhǎng)期蛋白尿可加速腎臟病的進(jìn)展，是慢性腎臟病發(fā)展為腎衰竭的重要因素[1]。自噬( autophagy) 是在環(huán)境壓力條件下細(xì)胞保持存活高度保守的體內(nèi)平衡機(jī)制，是細(xì)胞依賴溶酶體途徑對(duì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程，為細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)[2-3]。Fougeray S等研究表明，在腎臟病防治方面，自噬可作為新的作用靶點(diǎn)[4]。從中醫(yī)藥治療角度對(duì)自噬進(jìn)行相關(guān)研究可為腎臟病蛋白尿的防治提供全新的線索及思路。加味黃芪赤風(fēng)湯是張昱主任醫(yī)師創(chuàng)制的治療慢性腎臟病蛋白尿的有效方劑。前期研究表明，加味黃芪赤風(fēng)湯能夠明顯改善阿霉素腎病大鼠蛋白尿，保護(hù)腎功能，提高抗自由基能力，改善腎臟自由基損傷，并能夠提高血清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，降低血清內(nèi)皮素(endothelin-1,ET-1)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth Factor-β1,TGF-β1)含量，對(duì)延緩腎小球硬化及腎臟纖維化的發(fā)展有積極意義[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以阿霉素腎病大鼠為研究對(duì)象，研究加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)腎臟組織的保護(hù)作用及其對(duì)自噬相關(guān)蛋白(light chain 3，LC3)和Beclin-1的影響，為加味黃芪赤風(fēng)湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(220±18)g，月齡2～3個(gè)月，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 藥品與試劑

加味黃芪赤風(fēng)湯組成：生黃芪30 g, 芡實(shí)、金櫻子各20 g, 赤芍、防風(fēng)、地龍、白花蛇舌草各10 g，生藥飲片由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科鑒定。替米沙坦，即美卡素Boehringer Ingelheim International GmbH生產(chǎn)(進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20090416，H20090417)，注射用鹽酸多柔比星(速溶性)PfizerItalia s.r.l.生產(chǎn)(進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)H20080278，進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)Jx20000016)，免疫組化抗體由abcam公司生產(chǎn)(貨號(hào)分別為ab52167，ab32351)，二抗(PV-6000)通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ES-1100型電子天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司)，TB-718型生物組織包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)，RM2235型組織切片機(jī)(德國(guó)Leica)，HI1220型烤片機(jī)(德國(guó)Leica)，ST5020型全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica)，Olympus-bx51型顯微鏡(日本)，Anymicro DSSTM型圖像分析儀(北京裕天世紀(jì)偉業(yè)科技有限公司)，轉(zhuǎn)移電泳槽(BIO-RAD公司)，垂直板電泳槽(BIO-RAD公司)，PowerPacTM通用型電源(BIO-RAD公司)，脫色搖床(TS-1型，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，電子分析天平(AE240型，METTLER公司)，37℃水浴箱(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，冷凍離心機(jī)(MIKRO022R，LABWAY science公司)，制冰機(jī) (F100，LABWAY science公司)，ChemicDocTM XRS+ Image LabTM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，-70℃超低溫冰箱(Jauan VxE 380)。

2 方法

2.1 造模與分組

實(shí)驗(yàn)第1天，將SD大鼠隨機(jī)分為空白組10只與阿霉素腎病組30只。空白組尾靜脈一次性注射等量生理鹽水，并每日灌服等體積生理鹽水；阿霉素腎病組采用尾靜脈一次性注射阿霉素6.2 mg/kg的方法造模[7]，2周后用干化學(xué)法測(cè)定大鼠小便中的尿蛋白。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠尿蛋白呈(++++)為造模成功，經(jīng)過檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)造模成功，再將阿霉素腎病大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各10只。其中模型組10只，每日灌服等體積生理鹽水；正常劑量加味黃芪赤風(fēng)湯組10只，每日按生藥11.46 g/kg以水煎劑灌服；替米沙坦組10只，每日按8.33 mg/kg灌服替米沙坦混懸液。各組灌服均從造模后第2周末開始，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第8周末結(jié)束。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 光鏡檢測(cè)腎組織病理結(jié)構(gòu)變化 在第8周末處死大鼠后迅速手術(shù)剝離腎臟取腎皮質(zhì)，用10%甲醛固定、石蠟包埋，HE、PASM及Masson分別染色，制成薄切片用于光鏡檢查，其余腎皮質(zhì)保存于-70℃冰箱。

2.2.2 免疫組化染色法 檢測(cè)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層黏連蛋白(laminin，LN)、LC3及Beclin-1的定位及分布。二甲苯脫蠟，高壓熱修復(fù)，降至室溫，PBS洗后滴加一抗，4℃冰箱過夜，室溫放置30 min后PBS洗滴加二抗，室溫放置30 min，PBS洗后室溫DAB顯色，顯微鏡下觀察目標(biāo)出現(xiàn)陽性后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，氨水返藍(lán)，中性樹膠封片，圖像采集并分析，以免疫組織化學(xué)染色陽性信號(hào)累積光密度(IOD)作為組織表達(dá)的定量標(biāo)準(zhǔn)。IOD=平均光密度(AOD)× 陽性面積(A)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腎組織病理結(jié)構(gòu)改變

圖1顯示，空白組腎組織經(jīng)HE、PAS、MASSON染色后光鏡下可見，腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整，球囊比例正常，小球內(nèi)未見系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，腎小管排列有序，小管上皮細(xì)胞如常。模型組則出現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管球擴(kuò)張，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)明顯增多，局部毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)塌陷；腎小管排列紊亂，囊性擴(kuò)張，小管上皮細(xì)胞變性，基底膜增厚。加味黃芪赤風(fēng)湯組及替米沙坦組腎小球和腎小管病變均有不同程度的減輕。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化

3.2 腎組織中FN、LN、Beclin-1及LC3的表達(dá)與分布

圖2表1顯示，F(xiàn)N、LN均為漿表達(dá)，表達(dá)于腎小球系膜基質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞周圍基底膜。與空白組比較，模型組腎組織中FN、LN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，加味黃芪赤風(fēng)湯組腎組織中FN、LN蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；LC3為漿、核表達(dá)，表達(dá)于腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中，Beclin-1為漿表達(dá)，主要表達(dá)于腎小球，與空白組比較，模型組腎組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加味黃芪赤風(fēng)湯組及替米沙坦組腎組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組大鼠腎臟組織中FN、LN、Beclin-1及LC3免疫組化染色分布圖

組 別鼠數(shù)FNLNLC3Beclin?1空白組10880 30±65 56970 60±39 871200 35±65 30950 23±65 30模型組101800 35±43 80▲1700 50±61 30▲2500 63±60 86▲1800 29±40 32▲加味黃芪赤風(fēng)湯組101200 28±68 00△1288 76±39 67△1535 65±39 87△1105 36±60 95△替米沙坦組101288 76±43 96△1360 36±58 97△1596 80±60 56△1196 76±63 70△

注:與空白組比較:▲P<0.05；與模型組比較:△P<0.05

4 討論

加味黃芪赤風(fēng)湯出自清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中的黃芪赤風(fēng)湯，是張昱主任醫(yī)師在對(duì)慢性腎臟病蛋白尿“虛、瘀、毒、風(fēng)”復(fù)雜病機(jī)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上將其加減化裁而成。方中重用生黃芪健脾益氣，赤芍活血化瘀，芡實(shí)、金櫻子健脾升清、補(bǔ)腎固精，穿山龍、防風(fēng)祛除腎絡(luò)風(fēng)邪，白花蛇舌草清熱解毒，全方共奏補(bǔ)腎健脾、祛風(fēng)解毒、活血化瘀之功，臨床應(yīng)用加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎臟病蛋白尿療效顯著[8]。

FN及LN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，F(xiàn)N可以同時(shí)與細(xì)胞外基質(zhì)各類成分相結(jié)合，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)其他成分沉積，LN可以引起細(xì)胞黏附并影響基底膜的電荷選擇性[9]，二者在纖維化的早期即可形成并廣泛沉積，是觀察組織纖維化的常用指標(biāo)[10]。本研究觀察到，加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟病理有明顯改善及保護(hù)作用，同時(shí)通過抑制FN及LN蛋白的表達(dá)抗腎小球硬化。

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，自噬通過清除長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，在腎臟處理各種應(yīng)急的病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵保護(hù)作用，但是自噬的過度表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器的受損[11]。研究顯示[12]，通過特異性敲除足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5，模擬構(gòu)建了自噬缺乏的衰老足細(xì)胞的模型，高齡小鼠自噬功能被過度抑制，導(dǎo)致體內(nèi)氧化蛋白蓄積，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并表現(xiàn)蛋白尿，最終導(dǎo)致足細(xì)胞損傷丟失及腎小球硬化。一旦自噬活性持續(xù)亢奮，可加劇腎臟損傷，可見自噬是一把雙刃劍，過度表達(dá)或高度抑制均可對(duì)腎臟造成病理損傷[13-14]。Beclin-1[15]在細(xì)胞自噬途徑相互交流和協(xié)調(diào)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可通過將自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡中，參與到自噬體形成的整個(gè)過程中，在自噬體的成熟過程中，Beclin-1同樣扮演著重要角色。LC3可作為自噬體形成的標(biāo)志一直存在于自噬體中。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠腎臟組織中Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平較顯著升高。該結(jié)果表明，阿霉素誘導(dǎo)大鼠腎臟過度自噬從而引起腎臟病理損傷，而加味黃芪赤風(fēng)湯與替米沙坦也能不同程度地提高Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)。但是與模型組比較，加味黃芪赤風(fēng)湯與替米沙坦均能不同程度地拮抗Beclin-1、LC3蛋白的過度表達(dá)?？梢?，在一定程度上調(diào)Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)，減少腎臟病理損傷，但是Beclin-1、LC3蛋白的過度表達(dá)可加重腎臟病理損傷。本研究結(jié)果表明，加味黃芪赤風(fēng)湯可提高自噬基礎(chǔ)活性并維持自噬活性處于平衡狀態(tài)，進(jìn)而保護(hù)腎臟組織，減少腎臟病理損傷。

[1] CHITRA PS，SWATHI T，SAHAY R，et al. Growth hormone induces transforming growth factor-beta-induced protein inpodocytes：implications for podocyte depletion and protein-uria[J]. J Cell Biochem，2015，116(9)：1947-1956.

[2] 于子凱,李劉生,張昱. 自噬與PI3K-AKT/mTOR信號(hào)通路在足細(xì)胞損傷中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,13(9):84-87.

[3] JEREMY S，LEVENTHAL，JOHN C，et al． Autophagy and Immune Re-sponse in Kidneys[J]．Seminars in Nephrology，2014，34 ( 1 ) : 53-61．

[4] FOUGERAY S,PALLET N.Mechanisms and biological functions of autophagy in diseased and aging kidneys[J].Nat rev Nephrol，2015,11(1)：34-35.

[5] 王允亮,張昱,王洪霞,等.加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿及腎臟皮質(zhì)SOD、MDA 的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(5):505-506.

[6] 王允亮,張昱,王洪霞,等.加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿及血清NO、ET-1和TGF-β1的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(10):852-854.

[7] 張勇,張蓓,寧華英,等. 單次尾靜脈注射法阿霉素大鼠腎病模型的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,219(1):1-4.

[8] 張昱.加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎炎蛋白尿 50 例臨床觀察[J].中醫(yī)中藥,2007,4(36) :137．

[9] 李夢(mèng),李鳳婷,耿建國(guó). 消渴康對(duì)DN大鼠腎臟FN、LN、Ⅳ膠原表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2012,1:53-54.

[10] EISMANN U，SOMMER M，KOSMEHI H，et al.Fibronectin splice variants-prognostic marker for the stage of renal interstitial fibrosis in the rat[J].Nephron，2002，92 ( 2 ) :379-388．

[11] 譚進(jìn),劉華鋒,陳孝文. 自噬與腎臟固有細(xì)胞損傷[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,9:836-838.

[12] HARTLEBEN B，GODEL M，MEYER-SCHWESINGER C，et al．Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podo-cyte homeostasis in aging mice[J]．J Clin Invest，2010，120 (4):1084-1096．

[13] INOUE K,KUWANA H,SHIMAMURA Y,et al.Cisplatin-induced macroautophagy occurs prior to appotosis in proximal tubulars in vivo[J].Clin Exp Nephrol,2010,14(2):112-122.

[14] SANASANWAL P,YEN B,GAHL WA,et al.Mitochoondrial autophagy promotes cellular injury in nephrophathic cystinosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(2):271-283.

[15] FU LL，CHENG Y，LIU B.Beclin-1: autophagic regulator and therapeutictarget in canceInt[J]. J Biochem Cell Biol，2013，45(5) : 921-924.

Protective Effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on Adriamycin Nephrosis(AN) Rats kidney and Its Regulated Effect on Its Autophagy level

YU Zi-kai, YANG Bin, ZHANG Yu△,WANG Jin-hu,ZHANG Qiu,HAO Wei,ZHAO Jin-ning
(XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Objective:To explore the effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on adriamycin nephrosis(AN) rats and its effect on the expression of LC3 and Beclin-1.Methods：To set up blank、model、Telmisartan and Modified Huangqi Chifeng Decoetion group.The changes of kidney tissue pathology were detected after light microscopy. The localization and distribution of FN、LN、LC3 and Beclin-1were detected by Immunohistochemical staining.Results:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology，significantly restrain the expression of FN and LN，significantly restrain the expression of the autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1. Conclusion:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology through regulating the autophagy level.

Modified HuangqiChifeng Decoction;Autophagy;Adriamycin nephrosis;Proteinuria

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(ZZ0708105)-加味黃芪赤風(fēng)顆粒治療慢性腎臟病(1-2期)蛋白尿的療效及其機(jī)理研究

于子凱(1990-)，男，河南鄭州人，在讀碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合慢性腎臟病的防治與研究。

△通訊作者：張 昱(1965-)，男，北京人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士(后)，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail：zhangyu8225@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0477-03

2016-10-21