鈣調(diào)磷酸酶抑制劑篩選方法的研究進(jìn)展

徐翔，崔志峰，丁東棟，朱廷恒

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑篩選方法的研究進(jìn)展

徐翔，崔志峰，丁東棟，朱廷恒

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

篩選和開(kāi)發(fā)新型低毒的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（CNI）宜揚(yáng)長(zhǎng)避短，充分利用各方法的優(yōu)勢(shì)。本文綜述了酵母“正篩選”模型，酵母報(bào)告基因高通量CNI篩選模型和鈣調(diào)磷酸酶（CaN）活性檢測(cè)法3種常用的篩選方法的適用范圍、優(yōu)缺點(diǎn)以及多方法聯(lián)合。其中，酵母“正篩選”模型利用生長(zhǎng)圈來(lái)代替抑菌圈，有效避免了抑菌化合物造成的“假陽(yáng)性”；酵母報(bào)告基因的高通量篩選模型有較高的篩選效率，適合于大量樣品的初步篩選；CaN活性檢測(cè)法具有作用靶點(diǎn)明確和抑制效率直觀準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。本文旨在為篩選和開(kāi)發(fā)新型、低毒的CNI提供參考。

鈣調(diào)磷酸酶；抑制劑；篩選方法

鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN），又稱蛋白磷酸酶2B（protein phosphatase 2B，PP2B），是一種在真核生物中高度保守、Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。CaN作為一種Ca2+信號(hào)調(diào)控途徑的關(guān)鍵酶，在多種細(xì)胞功能中扮演關(guān)鍵角色，包括T細(xì)胞的活化、肌肉量的調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶的形成、以及阿爾茨海默病與帕金森病的發(fā)生［1-2］。

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）是一類以CaN為作用靶點(diǎn)的免疫抑制劑，如環(huán)孢素A（ciclosporin A，CsA）和他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）是目前臨床中廣泛使用的CNI。在免疫細(xì)胞中，CsA和FK506分別與親環(huán)蛋白（cyclophilin）和12 ku FK506結(jié)合蛋白（12 ku FK506 binding protein，F(xiàn)KBP12）結(jié)合形成復(fù)合物，并以復(fù)合物形式結(jié)合至CaN，從而抑制CaN催化蛋白脫磷酸化的活性，即在T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞中抑制NFATc脫磷酸，發(fā)揮免疫抑制劑的作用［3-4］。盡管CsA和FK506以其高抑制率和強(qiáng)特異性在器官移植和自身免疫病的臨床治療中廣泛應(yīng)用，但長(zhǎng)期使用CsA和FK506會(huì)產(chǎn)生一些副作用，包括神經(jīng)毒性、腎毒性、高血壓、高膽固醇、糖尿病和顫抖［5-6］。因此，開(kāi)發(fā)新型免疫抑制劑有重要意義。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的大部分具有抑制CaN活性的化合物均源于對(duì)自然界中大量微生物代謝產(chǎn)物或植物提取物的篩選，也有少部分篩選自小分子化合物庫(kù)。如目前臨床應(yīng)用最廣泛的CsA與FK506，均源自于微生物的代謝產(chǎn)物。因此，通過(guò)對(duì)自然界的大量天然化合物或小分子化合物庫(kù)進(jìn)行篩選從而獲得CaN活性抑制物質(zhì)，已成為開(kāi)發(fā)新型CNI的主要方式。本文中列舉了酵母“正篩選”模型、酵母報(bào)告基因高通量篩選模型以及CaN活性檢測(cè)法3種應(yīng)用較多的篩選方法。迄今，CNI篩選方法已有諸多報(bào)道，但目前還未有利用這些方法篩選到的CaN活性抑制物質(zhì)應(yīng)用于臨床治療。因此，在進(jìn)一步擴(kuò)大原有的篩選范圍的同時(shí)，有必要分析目前的CNI篩選方法的優(yōu)勢(shì)與不足，合理利用多種方法提高篩選新型CNI的效率和準(zhǔn)確性。

1 酵母“正篩選”模型

在酵母細(xì)胞中，Ca2+信號(hào)調(diào)控細(xì)胞周期是通過(guò)激活CaN通路和Mpk1絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）信號(hào)通路這2條信號(hào)通路協(xié)同激活Swe1［7］。Shitamukai等［8］發(fā)現(xiàn)，在Δzds1酵母中Swe1是被Ca2+信號(hào)高度誘導(dǎo)的，增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度對(duì)Δzds1酵母生長(zhǎng)的抑制現(xiàn)象尤為明顯。據(jù)此，他們開(kāi)發(fā)了用Δzds1酵母篩選Ca2+信號(hào)通路抑制劑的“正篩選”方法，即能解除高Ca2+濃度對(duì)Δzds1酵母生長(zhǎng)抑制的物質(zhì)為Ca2+信號(hào)通路抑制劑。用此方法既可篩選到CaN抑制劑，也可篩選到Mpk1 MAPK激酶抑制劑。

Boonkerd等［9］利用酵母“正篩選”模型從69種泰國(guó)藥用植物中篩選出穿心蓮、提琴形凹唇姜以及小白花地榆的提取物中含有較高的CaN活性抑制物質(zhì)，并已分離鑒定出小白花地榆中4種黃酮類化合物是CaN活性抑制物質(zhì)［10］。這4種黃酮物質(zhì)分別為5-羥基3，7-二甲氧基黃酮和5-羥基-7-甲氧基黃酮，5-羥基-3，7，4’-三甲氧基黃酮，5，7-二甲氧基黃酮。由于天然植物提取物中可能含有一些抑菌抗菌化合物，因此利用“正篩選”模型的生長(zhǎng)圈作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，能夠順利將抑菌抗菌化合物排除，提高篩選的針對(duì)性。

Suauam等［11］也通過(guò)酵母“正篩選”模型篩選到萜類化合物香豆素具有抑制CaN活性的能力，由于許多香豆素類化合物具有抗菌活性，因此利用“正篩選”模型篩選可以有效避免因?yàn)樵摶衔锟赡艽嬖诳咕钚远斐杉訇?yáng)性。隨后，他們又通過(guò)酵母敲除菌株Δcnb1（缺少編碼CaN的基因）和Δmpk1（缺少編碼Mpk1 MAPK的基因）對(duì)該香豆素化合物進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，并驗(yàn)證了該物質(zhì)作用于CaN通路而非Mpk1 MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。最近，有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)上述“正篩選”模型進(jìn)行了改進(jìn)。Uesugi等［12］利用對(duì)釀酒酵母中RSP5基因編碼的E3泛素連接酶的401位氨基酸進(jìn)行了突變，使得該酵母突變株（rsp5A401E）對(duì)高溫非常敏感，在37℃下，能夠產(chǎn)生明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了抑制CaN通路能夠使得rsp5A401E菌株對(duì)高溫具有一定的耐受性而恢復(fù)生長(zhǎng)。根據(jù)該方法，他們篩選了近800種自然界來(lái)源的甲醇提取物，并最終鑒定出了2種雙萜類化合物，脫氫樅酸和海松酸具有抑制CaN的活性。Kume等［13］通過(guò)敲除VRP1基因，使得Δvrp1酵母菌株對(duì)高溫極其敏感。該基因編碼與肌動(dòng)蛋白組織和內(nèi)吞作用有關(guān)的富脯蛋白。Δvrp1菌株在35.5℃下就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制，而FK506能夠完全消除該菌株在高溫下的生長(zhǎng)抑制，而FK506本身則對(duì)該菌株在常溫下的生長(zhǎng)無(wú)影響。

酵母突變株rsp5A401E與酵母敲除株Δvrp1與Δzds1都利用了酵母生長(zhǎng)圈作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。而后兩種方法相較于第一種“正篩選”方法，省去了在培養(yǎng)基中加入高濃度Ca2+，使得操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化。

2 基于酵母報(bào)告基因的高通量篩選

在哺乳動(dòng)物中，CaN最重要的底物是轉(zhuǎn)錄因子NFATc［14］，而在酵母細(xì)胞中，CaN的重要靶標(biāo)是轉(zhuǎn)錄因子Crz1。Stathopoulos等［15］發(fā)現(xiàn)，在酵母中由Ca2+誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄的基因（如FKS2），其啟動(dòng)子序列中均存在一個(gè)24 bp區(qū)域，被稱為CaN依賴性反應(yīng)元件（calcineurin-dependent response element，CDRE），是轉(zhuǎn)錄因子Crz1的結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子Crz1一般以磷酸化狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，一旦CaN被Ca2+和鈣調(diào)素激活，則催化Crz1去磷酸化。脫磷酸化的Crz1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與CDRE序列結(jié)合以激活下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。由于CaN在真核生物中具有高度保守性，Margassery等［16］構(gòu)建了基于酵母報(bào)告基因（CDRE∶∶LacZ）的高通量篩選CaN抑制劑模型。該方法的優(yōu)點(diǎn)是在96孔板中進(jìn)行檢測(cè)，能快速檢測(cè)出具有抑制CaN活性的化合物，可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選。但是由于該方法需要利用酵母活菌表達(dá)半乳糖苷酶，因此若遇能夠抑制酵母生長(zhǎng)的物質(zhì)，則該方法亦會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。他們用該模型對(duì)海綿共棲菌提取物庫(kù)中的81種化合物進(jìn)行了篩選，得到3種化合物具有CaN活性抑制活性。

Prescott等［17］也應(yīng)用上述酵母報(bào)告基因模型篩選了360種植物提取物，篩選出石生屈曲花來(lái)源的化合物3，4，5-三甲氧基芐基異硫氰酸酯（3，4，5-trimethoxybenzylisothiocyanate，TMBITC）具有抑制酵母CaN活性的作用，并通過(guò)人體CaN活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)確定了該物質(zhì)直接作用于人CaN，且不需要額外的結(jié)合蛋白。

吳鵬飛等［18］也應(yīng)用酵母報(bào)告基因模型從杭州的土樣中篩選出一株鏈霉菌CZW-15，其發(fā)酵液稀釋100倍后仍具有較強(qiáng)的抑制CaN活性（抑制率約80%）。目前，本實(shí)驗(yàn)室仍在對(duì)CZW-15發(fā)酵液的抑制CaN活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

3 CaN活性檢測(cè)法

直接檢測(cè)重組人CaN的酶活可以精準(zhǔn)地鑒定出待測(cè)物質(zhì)是否作用于CaN，常用于檢測(cè)和鑒定潛在的CaN活性抑制物質(zhì)，也可以用于CaN活性抑制物質(zhì)的篩選。

3.1 利用磷同位素標(biāo)記CaN底物

Fruman等［19］利用［32P］標(biāo)記磷酸化的RII肽作為CaN的底物，CaN催化底物脫磷酸化產(chǎn)生游離的［32P］磷酸鹽和去磷酸化的肽鏈，將反應(yīng)液通過(guò)陽(yáng)離子交換柱，未被脫磷酸化的肽鏈將被吸附于柱上，而具有放射性的［32P］磷酸鹽則被收集，根據(jù)放射性強(qiáng)度，利用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)收集液中的放射強(qiáng)度，從而確定被CaN脫磷酸化的底物的量，以此來(lái)檢測(cè)CaN的酶活。該方法檢測(cè)靈敏度高，且結(jié)果準(zhǔn)確，但由于陽(yáng)離子交換柱的使用步驟繁瑣，降低了實(shí)驗(yàn)的可靠性，很難應(yīng)用于大規(guī)模高通量篩選。隨后，Martin等［20］在原來(lái)篩選方法的基礎(chǔ)上，將陽(yáng)離子交換柱，改為使用聚偏二氟乙烯（PVDF）疏水濾膜過(guò)濾除去未被水解的磷酸肽，并將反應(yīng)、過(guò)濾以及檢測(cè)等過(guò)程均置于96孔板中。該方法既適合用于高通量篩選，又有利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，對(duì)提高篩選效率有極大的幫助。

Aramburu等［21］利用［32P］標(biāo)記CaN底物磷酸RII肽，篩選和鑒定了合成短肽SPRIEIT具有抑制CaN酶活的性質(zhì)。該合成短肽的序列與NFATc1用于結(jié)合CaN的保守序列110SPRIEITPS118極為相似，使得該合成短肽能夠與NFATc1競(jìng)爭(zhēng)CaN的結(jié)合位點(diǎn)，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制CaN催化NFATc1脫磷酸化，而不影響CaN本身的磷酸酶活性。

Baumgrass等［22］利用［33P］標(biāo)記CaN底物磷酸RII肽，從小分子化合物庫(kù)篩選出棉子酚具有抑制CaN活性的能力。棉子酚不同于他克莫司和CsA，直接結(jié)合于CaN上，不需要與額外的免疫親和蛋白結(jié)合，其在CaN上的結(jié)合位點(diǎn)與親環(huán)素-CsA復(fù)合物抑制CaN的結(jié)合位點(diǎn)相同，以非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制的方式抑制CaN活性。

Wang等［23］利用［32P］標(biāo)記CaN底物磷酸RII肽，篩選到一種具有抑制CaN酶活能力的天然黃酮類化合物山奈酚。山奈酚不同于他克莫司和CsA，不需要與額外的免疫親和蛋白結(jié)合，而是直接以非競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制CaN。山奈酚直接作用于CaNA的催化域，并且在CaM和CaNB存在的情況下，能夠提高山奈酚對(duì)CaN的抑制作用。

Wang等［24］還利用［32P］標(biāo)記CaN底物磷酸RII肽，篩選出另一種天然黃酮類化合物槲皮素，它能夠抑制CaN活性。槲皮素以非競(jìng)爭(zhēng)性的方式抑制CaN的磷酸酶活性，同樣不需要與免疫親和蛋白結(jié)合，直接作用于CaN的催化域，并且在CaNB存在的情況下，能夠提高槲皮素對(duì)CaN的抑制作用。

Erdmann等［25］利用［32P］標(biāo)記CaN底物磷酸RII肽，通過(guò)篩選化合物庫(kù)，得到具有CaN活性抑制能力的有機(jī)小分子化合物6-（3，4-二氯苯基）-4-（N，N-二甲基氨基乙?guī)€基）-2-苯基嘧啶（CN585）。CN585能夠通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性的方式可逆抑制CaN活性，且具有很高的特異性；在抑制CaN的同時(shí)，不會(huì)影響其他絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶或肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶的活性。此外，CN585在有效濃度下并不顯示細(xì)胞毒性，有利于其作為CaN抑制劑應(yīng)用于臨床治療。

由于在該篩選方法的生化反應(yīng)體系中，未加入任何免疫親和蛋白，因此上述報(bào)道的CaN活性抑制化合物不需要與額外的免疫親和蛋白結(jié)合，均可以直接作用于CaN，從而抑制其活性，相比于FK506與CsA，對(duì)CaN具有更高的特異性。

3.2 利用綠色熒光標(biāo)記CaN底物磷酸肽

由于前一種方法需要使用具有放射性的同位素，所以在應(yīng)用上具有一定的局限性，且對(duì)環(huán)境有不利影響。因此，Roberts等［26］在CaN的底物磷酸肽的氨基酸殘基上添加熒光標(biāo)記，在CaN與底物反應(yīng)后，用氧化鈦（TiO4）吸附未被脫磷酸的底物，從而通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)被脫磷酸化的底物數(shù)量，即可確定CaN酶活。

Qian等［27］利用熒光標(biāo)記CaN底物的方法，驗(yàn)證了人工合成的ZIZIT-cisPro小肽具有CaN活性抑制作用。該合成小肽能夠與NFAT競(jìng)爭(zhēng)CaN上的結(jié)合位點(diǎn)，并且合成小肽本身對(duì)CaN具有更高的親和度，能夠高效抑制CaN催化NFAT脫磷酸化。且該合成小肽末尾增加的反式脯氨酸殘基能夠有效抵御蛋白酶的水解，進(jìn)一步延長(zhǎng)了該合成小肽的抑制有效期。

3.3 利用CaN酶解產(chǎn)物顯色反應(yīng)

Sellar等［28］基于孔雀綠和游離磷酸鹽之間可以形成一個(gè)在620～640 nm處吸光的復(fù)合物的原理，在CaN與底物磷酸肽的反應(yīng)液中加入孔雀綠，使其中的游離磷酸鹽與孔雀綠形成復(fù)合物，隨后在620 nm下檢測(cè)吸光度，從而通過(guò)檢測(cè)被CaN脫磷酸化的底物的量來(lái)確定CaN活性。Harish等［29］利用孔雀綠顯色定磷法鑒定了來(lái)自CaN自抑制域的一段多肽鏈具有抑制CaN活性的能力。該法來(lái)源于在生化反應(yīng)中常用的孔雀綠定磷法，本身并非專用于篩選新型CaN抑制劑，但是借助該方法能夠準(zhǔn)確定量測(cè)定溶液中的游離無(wú)機(jī)磷，因此可以方便快速地檢測(cè)CaN的活性。

Prescott等［30］利用對(duì)硝基苯磷酸鹽（p-NPP）被磷酸酶水解后，產(chǎn)生黃色末端產(chǎn)物，利用吸光度定量檢測(cè)磷酸酶活性。CaN水解p-NPP后，可以通過(guò)檢測(cè)其酶解產(chǎn)物，確定CaN活性，從而鑒定出矮探春植株的根和葉提取物中含有抑制人CaN活性的物質(zhì)，且葉提取物的抑制效果高于根提取物。

Cen等［31］也利用CaN水解p-NPP的方法，從一系列來(lái)自山竹子植株的天然化合物，并從中篩選出異藤黃酚（isogarcinol）具有抑制CaN活性的能力。該化合物的抑制活性在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)，且在有效濃度下，對(duì)細(xì)胞毒性相當(dāng)?shù)?。該化合物在小鼠急性毒性試?yàn)中比CsA毒性更低，且長(zhǎng)期使用能明顯延長(zhǎng)皮膚移植小鼠的存活時(shí)間。這些結(jié)果表明，異藤黃酚用于臨床治療自身免疫病的潛力極大，且更適于長(zhǎng)期用藥。

3.4 利用CaN產(chǎn)物熒光淬滅現(xiàn)象

在上述孔雀綠檢測(cè)游離磷酸鹽以測(cè)定CaN活性方法的基礎(chǔ)上，Mukherjee等［32］利用熒光384孔板本身被激發(fā)出的熒光能被孔雀綠磷酸鹽復(fù)合物淬滅，進(jìn)而通過(guò)熒光強(qiáng)度測(cè)定CaN活性，使CaN活性與熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。該方法較之借助吸光度檢測(cè)法，需要的檢測(cè)樣品體積更小，在檢測(cè)體積＜10μL時(shí)依然可以準(zhǔn)確檢測(cè)，且對(duì)熒光變化很敏感。他們亦利用自動(dòng)移液工作站成功將該方法實(shí)現(xiàn)機(jī)械化高通量篩選，極大地減少了工作量，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率，并提高了篩選的效率。隨后他們用該方法篩選了包含1400多種小分子物質(zhì)的化合物庫(kù)，最終篩選出鹽酸氟桂利嗪（LDN-0013905）和鹽酸三氟拉嗪（LDN0013906）2種具有抑制CaN活性的化合物。

表1總結(jié)了本文中提及的部分被篩選出的CaN活性抑制物質(zhì)及其篩選方法。

4 展望

由于目前臨床上廣泛應(yīng)用的CNI具有諸多不足之處，因此，有必要開(kāi)發(fā)新型、低毒的CNI。采取適宜的方法，對(duì)大量化合物進(jìn)行篩選，尋找具有CaN活性抑制能力的化合物，應(yīng)成為開(kāi)發(fā)新型CNI的主要工作。

續(xù)表1

本文列舉的篩選方法中，酵母“正篩選”模型使用生長(zhǎng)圈而非抑菌圈作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，有效避免了待篩選物質(zhì)中可能包含具有抑菌活性物質(zhì)而造成“假陽(yáng)性”。對(duì)于篩選天然植物或藥用植物提取物時(shí)，可以避免提取物中含有抑菌化合物而對(duì)篩選結(jié)果造成干擾。該篩選方法使用活酵母作為篩選模型，篩選到的活性物質(zhì)具有透過(guò)細(xì)胞膜的特性，從而避免了某些生化檢測(cè)方法篩選到的活性物質(zhì)無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜的缺陷。但受酵母生長(zhǎng)周期限制，檢測(cè)周期一般需要2～3 d，且較難實(shí)現(xiàn)高通量篩選，因此該方法比較適合于較少數(shù)樣品的篩選工作。

而基于酵母報(bào)告基因（CDRE∶∶LacZ）高通量篩選模型利用LacZ表達(dá)量與CaN活性呈正相關(guān)，巧妙地將CaN活性檢測(cè)轉(zhuǎn)化為可通過(guò)儀器方便和準(zhǔn)確量化的LacZ表達(dá)量，且該反應(yīng)可以置于96孔板中實(shí)現(xiàn)高通量篩選。然而該方法若遇抑菌物質(zhì)或能夠殺滅酵母的毒性物質(zhì)，極有可能造成“假陽(yáng)性”，因此篩選到的潛在的CaN抑制物質(zhì)仍需要利用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。該方法適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行初篩。

CaN活性檢測(cè)法通過(guò)直接檢測(cè)CaN酶活來(lái)確定待測(cè)物質(zhì)是否對(duì)CaN有抑制作用，若有抑制作用，則該化合物的作用靶點(diǎn)必定為CaN，避免了篩選到作用靶點(diǎn)非CaN的免疫抑制化合物。但是該方法篩選出的化合物可能無(wú)法透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜，因而在實(shí)際應(yīng)用中亦可能無(wú)法進(jìn)入胞質(zhì)，無(wú)法抑制CaN的酶活。所以該方法篩選的化合物需要聯(lián)合其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證，才能最終確定被篩選出的化合物是否有應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，若只采用單種方法，很難準(zhǔn)確、高效地篩選到具有CaN抑制活性的化合物。因此，采用多種方法聯(lián)合篩選，既能夠充分利用其優(yōu)勢(shì)，又可以相互彌補(bǔ)各自的不足之處，即提高效率，又能保證篩選的準(zhǔn)確性。

首先，酵母報(bào)告基因檢測(cè)模型與CaN活性檢測(cè)法均可實(shí)現(xiàn)高通量篩選，適合于對(duì)大量候選化合物進(jìn)行篩選。但是由于CaN活性檢測(cè)法采用重組人CaN參與反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)成本較高，且部分檢測(cè)手段較為復(fù)雜。因此，宜采用酵母報(bào)告基因檢測(cè)模型對(duì)大量候選化合物進(jìn)行初步篩選。

其次，由于酵母“正篩選”模型利用CaN活性抑制物質(zhì)對(duì)該酵母有“生長(zhǎng)挽救”的特性，通過(guò)生長(zhǎng)圈作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)一步驗(yàn)證酵母報(bào)告基因篩選模型的篩選結(jié)果中，是否含有本身具有抑菌或殺菌能力的化合物，除去初步篩選中可能出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”，提高篩選的準(zhǔn)確性。也同時(shí)驗(yàn)證了篩選出的化合物能夠順利通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)。

最后，CaN活性檢測(cè)法由于其為生化反應(yīng)的特性，較適宜檢測(cè)已初篩出的化合物對(duì)CaN活性的抑制率。亦可用于目標(biāo)靶點(diǎn)為CaN的人工合成小分子化合物。

本實(shí)驗(yàn)室就聯(lián)合采用了酵母報(bào)告基因高通量篩選模型與酵母“正篩選”模型，利用酵母報(bào)告基因模型對(duì)大量土壤微生物進(jìn)行初步篩選，以期獲得其代謝產(chǎn)物對(duì)CaN活性具有抑制作用的菌株，并進(jìn)一步利用酵母“正篩選”模型驗(yàn)證其作用位點(diǎn)，并取得了初步成效。

篩選并開(kāi)發(fā)新型低毒的CNI，對(duì)推動(dòng)器官移植與自身免疫病的治療都將具有重大意義。合理利用多種篩選方法，能夠更高效，準(zhǔn)確地篩選出目標(biāo)化合物，達(dá)到事半功倍的效果。

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Resevrch progress in screening methods ofcalcineurin inhibitors

XU Xiang,CUIZhi-feng,DING Dong-dong,ZHU Ting-heng
(College ofBiotechnology and Bioengineering,Zhejiang University ofTechnology,Hangzhou 310014,China)

Calcineurin inhibitor screening should benefit from the strengths of each method.This paper reviews three calcineurin inhibitor screening methods：yeast"positive screening"model,yeast reporter gene high through-put screening model and calcineurin activity detection method.We have compared the range of application,advantages and disadvantages of each method,and combined effect of multiple methods.The yeast"positive screening"model can prevent the false positiveness caused by bacteriostat by using growth zooms instead of inhibition zooms.The yeast reporter gene high through-putscreening modelis suitable for pilotscreening among a wide range ofsamples and is more efficientthan the other methods.The calcineurin activity detection method can directly report the inhibitory ratio to a specific target.This review is expected provide a model-selection reference for the developmentofnovellow-toxic calcineurin inhibitors.

calcineurin;inhibitor;screening methods

ZHU Ting-heng,Tel:(0571)88320741,E-mail:thzhu@zjut.edu.cn

R965.1

：A

：1000-3002-（2017）04-0367-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.011

2017-01-13接受日期：2017-03-31）

（本文編輯：賀云霞）

徐翔，男，碩士研究生，主要從事酶抑制劑的分離純化研究。

朱廷恒,Tel:(0571)88320741,E-mail:thzhu@zjut. edu.cn