堿性成纖維細胞生長因子團聚體對糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變的治療作用

李銳，鄒雙，高征征，劉彥隆，張宏宇，肖健

（溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江省生物技術(shù)制藥工程重點實驗室，浙江溫州325035）

·論著·

堿性成纖維細胞生長因子團聚體對糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變的治療作用

李銳，鄒雙，高征征，劉彥隆，張宏宇，肖健

（溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江省生物技術(shù)制藥工程重點實驗室，浙江溫州325035）

目的探究新型生物材料堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）團聚體對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)病變的治療作用。方法將聚乙烯精氨酸天冬氨酸甘油二酯（PEAD）、肝素和bFGF按50∶10∶1（m/m/m）的比例混合，制備成bFGF團聚體。Western蛋白印跡法檢測該團聚體中bFGF含量，ELISA法檢測團聚體中bFGF釋放速率。雄性SD大鼠ip給予鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，繼續(xù)飼養(yǎng)8周使之發(fā)生外周神經(jīng)病變，隨機分為空載體組、bFGF治療組和bFGF團聚體治療組。bFGF治療組每天im給予bFGF 200μg·kg-1，連續(xù)3 d；bFGF團聚體治療組一次性im給予含等量bFGF的團聚體12.2 mg·kg-1；空載體組給予等體積的空載體（PEAD+肝素）。每周測量后肢足步印跡進行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）的行為學評分。給藥后第30天處死大鼠，收集兩側(cè)坐骨神經(jīng)，HE染色進行病理學觀察，DAPI熒光染色檢測神經(jīng)組織內(nèi)細胞凋亡，Western蛋白印跡法檢測細胞增殖標志物Ki67和增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白水平。結(jié)果PEAD、肝素和bFGF按50∶ 10∶1配比制備的bFGF團聚體結(jié)合bFGF良好；ELISA釋放曲線結(jié)果表明，該團聚體可緩釋bFGF。大鼠行為學評價和病理指標檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，空載體組大鼠SFI顯著減?。≒＜0.01），神經(jīng)纖維排列紊亂且內(nèi)部脫髓鞘情況嚴重，而且組織內(nèi)部細胞凋亡明顯，Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01）。與空載體組比較，bFGF治療組和bFGF團聚體治療組SFI升高（P＜0.05，P＜0.01），神經(jīng)纖維排列紊亂和內(nèi)部脫髓鞘現(xiàn)象改善，組織內(nèi)部細胞凋亡減少，且Ki67和PCNA蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。與bFGF治療組相比，bFGF團聚體治療組SFI在治療后第28天升高更加明顯（P＜0.05），神經(jīng)纖維排列規(guī)整，脫髓鞘現(xiàn)象基本消失，組織內(nèi)部細胞核的熒光強度與形態(tài)基本接近正常，Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論新型生物材料PEAD能有效地結(jié)合bFGF并緩控其釋放。該團聚體治療糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)病變效果可能優(yōu)于單純bFGF給藥。

堿性成纖維細胞生長因子；糖尿病；外周神經(jīng)病變；團聚體；肝素

糖尿病外周神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）并發(fā)癥中的一種最常見且難治愈的慢性疾病，約50%的DM患者伴有不同程度的DPN并嚴重影響其生活質(zhì)量［1-2］。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）是由146個氨基酸組成的多肽，具有刺激血管生成及神經(jīng)再生的雙重作用［3-4］，在治療腦缺血、心肌梗死和促進骨再生等方面療效顯著［5-7］。但由于bFGF的半衰期短，常溫下易失活變性以及體內(nèi)易受多種蛋白酶的降解［8］，故限制其臨床應用。本研究通過離子間的相互作用將聚乙烯精氨酸天冬氨酸甘油二酯〔poly（eth?ylene argininylaspartate diglyceride），PEAD〕［9-10］、肝素和bFGF混合，制備成新型生物材料團聚體（PEAD+肝素+bFGF，以下稱為bFGF團聚體），其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征能有效地結(jié)合bFGF并緩控其釋放。同時本研究以DPN大鼠的坐骨神經(jīng)病變作為外周神經(jīng)病變模型，探究bFGF團聚體對其的改善作用，為此藥應用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

bFGF購自浙江格魯斯特生物科技有限公司。PEAD由匹斯堡大學化學工程系提供；肝素和鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司；山羊抗大鼠Ki67、增殖細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen，PCNA）和β肌動蛋白單抗（一抗）購自英國Abcam公司；生物素標記的山羊抗大鼠IgG抗體（二抗）購自美國Bioworld Technology公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸（4′，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）購自中國Beyotime Biotechnology公司；ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。小型組織研磨儀（北京昊諾斯科技有限公司），電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），高速臺式冷凍離心機（美國Thermo Forma公司），正置光學顯微鏡（日本Nikon公司），數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)、Model-680型酶標儀和蛋白電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司），石蠟包埋機和石蠟切片機（德國Fecia公司），脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），高溫高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 bFGF團聚體的制備

用生理鹽水將PEAD、肝素及bFGF均配成30 g·L-1的溶液，按PEAD∶肝素∶bFGF為50∶10∶1（m/m/m）的比例，在超凈臺中將bFGF加入肝素溶液并充分混勻，隨后加入PEAD，混勻，制備為bFGF團聚體，放入4℃冰箱保存。制備過程嚴格按照無菌操作規(guī)范進行。

1.3 bFGF裝載率和釋放率的檢測

bFGF團聚體中bFGF裝載率和釋放率的檢測均參照Chu等［11］的方法。bFGF裝載率測試加入bFGF 10μg，bFGF釋放率檢測加入bFGF 1μg。制備過程如1.2所述，將制備好的bFGF團聚體于4℃，12 000×g離心10 min后，用移液槍吸取上清液至另外的EP管中，同時加入等體積的生理鹽水補充，分別進行裝載率和釋放率測試。①bFGF裝載率測試：將上清液、沉淀液和總液均加入1/4體積的5×上樣緩沖液并水煮10 min，Western蛋白印跡法檢測三者中bFGF含量。②bFGF團聚體釋放率檢測：于第1，4，7，14，19，28和35天將收集的上清液用ELISA法檢測bFGF含量，并繪制釋放曲線。

1.4 動物、分組和模型制備

8周齡雄性SD大鼠由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證：SCXK（浙）2015-0001。動物實驗遵守溫州醫(yī)科大學實驗動物中心管理規(guī)范。大鼠飼養(yǎng)條件為溫度23～25℃，濕度40%～60%，晝夜12/12 h，在整個實驗過程中均自由進食及飲水。待實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，禁食12 h，用檸檬酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 4.4）避光配置10 g·L-1STZ，大鼠ip給予STZ 65 mg·kg-1。于給STZ后的第1，3和7天，大鼠尾靜脈取血測血糖，3次血糖水平均≥16.7 mmol·L-1視為造模成功的DM大鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)8周，待其自行發(fā)生外周神經(jīng)病變［12］。其間每周檢測1次血糖，每2周測量1次體質(zhì)量，以挑選血糖水平穩(wěn)定、狀態(tài)較好的DPN大鼠。選取其中30只隨機分為空載體組、bFGF治療組及bFGF團聚體治療組，每組10只。bFGF治療組DPN大鼠每天im給予bFGF 200μg·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d。bFGF團聚體治療組DPN大鼠（按體質(zhì)量200 g計）僅一次性im給予含等量bFGF的團聚體（PEAD 6 mg，肝素1.2 mg，bFGF 120μg）244μL，空載體組給予等體積空載體（PEAD+肝素）244μL。在給藥后的第0，7，14，21和28天分別進行后肢足步印跡評價，并在第30天處死各組大鼠，收集各鼠兩側(cè)坐骨神經(jīng)，進行石蠟包埋、切片及HE染色和DAPI熒光染色。

1.5 大鼠后肢足步印跡測量［13］

用標準直尺測量各組DPN大鼠后肢在白紙上爬行留下的足印，包括足印長度（即足跟到足尖的距離，PL）、中間足趾距離（即第2～第4趾連線距離，IT）和足趾寬度（即第1～第5趾連線距離，TS）3個參數(shù)，每大鼠測量3個足印。將上述變量運用Bain公式計算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic function index，SFI）［14］。SFI=-38.3×（EPL-NPL）/NPL+109.5×（ETS-NTS）/NTS+13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8。式中E代表DPN大鼠，N代表正常大鼠。

1.6 坐骨神經(jīng)的病理學觀察［13］

將4%多聚甲醛固定的坐骨神經(jīng)放入梯度乙醇中逐級脫水并于二甲苯中透明，將透明完全的神經(jīng)組織浸入融化的軟蠟和硬蠟各1.5 h后，對各組織進行石蠟包埋并切成5.0μm的石蠟切片，于37℃水浴鍋中展平并附著于黏附載玻片上烘干4 h。將烘干的坐骨神經(jīng)石蠟切片先放入二甲苯中透明，隨后再將其放入梯度遞減的乙醇溶液中水化，將水化完全的切片擦干周圍水分，HE染色，再次進入梯度乙醇脫水并放入二甲苯透明，最后將切片取出，用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察拍照。

1.7 DAPI細胞核熒光染色檢測坐骨神經(jīng)組織細胞的凋亡

大鼠坐骨神經(jīng)切片于二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化完成后，避光條件下滴加DAPI100μL染色8 min，隨后放入PBS緩沖液浸泡3次，每次5 min，最終滴加抗熒光猝滅劑并進行封片，將切片置于激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長460 nm的熒光顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織內(nèi)細胞核的亮度和形態(tài)并拍照。

1.8 Western蛋白印跡法檢測Ki67和PCNA蛋白水平

將收集的坐骨神經(jīng)加入400μL組織裂解液并靜置30 min，使其充分裂解，考馬斯亮藍法測定大鼠坐骨神經(jīng)組織的蛋白質(zhì)濃度。加入80μg蛋白質(zhì)樣品至12%分離膠，在80 V條件下電泳1 h，300 mA條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉1.5 h后加入抗Ki67，PCNA或β肌動蛋白一抗過夜，次日加入對應的二抗孵育1 h，TBST洗凈后加入Beyo ECL Plus顯色液于凝膠成像儀中曝光。采用Image Lab圖像處理軟件（Bio-Rad）分析Ki67和PCNA蛋白的積分吸光度（integrated absorbance，IA），計算IAKi67/IAβ肌動蛋白和IAPCNA/IAβ肌動蛋白比值，表示Ki67和PCNA蛋白的相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為，運用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間各指標的比較采用單因素方差分析，兩組間樣本差異采用LSD檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF團聚體的特性

Fig.1 Photographs of basic fibroblast growth factor（bFGF）-coacervates well dissolved in saline.A：poly（ethylene argininylaspartate diglyceride）（PEAD）；B：the solution turns cloudy after PEAD mixing bFGF and heparin together；C：upon standing for 24 h，the bFGF coacervates aggregates to the bottom ofthe tube.

將PEAD溶于生理鹽水中得到澄清透明的溶液，加入肝素和bFGF溶液后，EP管內(nèi)的溶液迅速變成白色絮狀樣，靜置24 h后，白色絮凝物以油狀的形式沉于管底（圖1）。將PEAD 500μg，肝素100μg和bFGF 10μg充分混合，在高速臺式冷凍離心機中12 000×g離心10 min，Western蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，bFGF存在于管底，上清液中僅檢出微量bFGF，管底的bFGF含量與團聚體溶液中bFGF的總量基本保持一致（圖2），說明PEAD 500μg和肝素100μg可以結(jié)合bFGF 10μg。ELISA檢測結(jié)果表明，前期團聚體中bFGF釋放迅速，后期平穩(wěn)，至35 d仍有約60%bFGF存留于團聚體中（圖3）表明bFGF團聚體能夠緩控釋放bFGF。。

Fig.2 Loading efficacy of bFGF from bFGF-coacer?vates.A：after standing for 24 h，bFGF coacervates were centri?fuged，and the distribution of bFGF was determined by Western blotting；B：the quantitative results（integrated absorbance）of A.S：bFGF in the supernatant after centrifugation；C：bFGF in the settled coacervates；L：total amount of bFGF in the loading solution

Fig.3 Release profile of bFGF from bFGF-coacervates. bFGF was released from the coacervate into saline at 37°C.The percentage of release over 35 d was quantified by ELISA.x±s，n=3.

2.2 bFGF團聚體治療對DPN大鼠坐骨神經(jīng)功能的影響

DPN大鼠在給藥第0，7，14，21和28天測量足印計算SFI（圖4）。由第4周各組大鼠留下的足跡（圖4A）可見，空載體對照組大鼠的足印模糊，各足趾伸展不開；經(jīng)bFGF治療后，足印的清晰度及各足趾的伸展程度出現(xiàn)好轉(zhuǎn)；bFGF團聚體治療組大鼠的足印進一步改善。由各周各組計算SFI的統(tǒng)計分析結(jié)果（圖4B）可知，治療前各組DPN大鼠SFI基本一致，無統(tǒng)計學差異。隨后4周，空載體組大鼠SFI持續(xù)下降（P＜0.01）。bFGF治療組與空載體組比較，其SFI在第1周顯著升高（P＜0.01），隨后3周SFI基本保持平穩(wěn)，說明bFGF對DPN大鼠運動功能具有一定的改善作用。給予bFGF團聚體治療后，其SFI在治療后第28天與bFGF治療組相比也顯著升高（P＜0.05），說明一次性給予bFGF團聚體治療對DPN大鼠的神經(jīng)功能有持續(xù)的改善作用，其效果可能優(yōu)于單用等劑量的bFGF。

Fig.4 Effect of bFGF-coacervates on motor function in diabetic peripheral neuropathy（DPN）rats.All diabetic rats were maintained in the animal house for 8 weeks to allow stabilization of their neuropathic process.Then，DPN rats in bFGF group were im given bFGF 200μg·kg-1，once daily for 3 d.DPN rats in bFGF-coacervate group were im given bFGF-coacervate solution（244μL）equal to bFGF 200μg·kg-1only once.DPN rats in free-coacervate group were im given the same volume of vehicle（PEAD+heparin）only once.A：repre?sentative footprints obtained on the 28thday；B：analysis of sciatic function index（SFI）value of DPN rats in each week after drug treatment.n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with free-coacervate group；△P＜0.05，compared with bFGF group.

2.3 bFGF團聚體治療對DPN大鼠坐骨神經(jīng)病理結(jié)構(gòu)的影響

治療后第30天檢查DPN大鼠坐骨神經(jīng)的病理變化。低倍鏡下觀察可見（圖5A），空載體組DPN大鼠坐骨神經(jīng)纖維排列紊亂，發(fā)生多處神經(jīng)纖維堆積及變性。給予bFGF治療后，坐骨神經(jīng)纖維排列規(guī)整，堆積及變性情況顯著改善。高倍鏡下觀察可見（圖5B），空載體組坐骨神經(jīng)纖維內(nèi)脫髓鞘嚴重且出現(xiàn)不同程度的腫脹（黑色箭頭指示）。給予bFGF治療后，坐骨神經(jīng)纖維內(nèi)脫髓鞘和水腫得以改善。而bFGF團聚體的治療效果更加顯著，坐骨神經(jīng)內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)分布均勻且排列整齊，基本無脫髓鞘和腫脹現(xiàn)象（紅色箭頭指示），并可見半月形許旺細胞，說明經(jīng)bFGF團聚體治療后DPN大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)的病理改變恢復迅速，基本接近正常。

2.4 bFGF團聚體抑制DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞的凋亡

坐骨神經(jīng)主要由神經(jīng)元及其軸突周圍包裹的許旺細胞組成。DAPI染色結(jié)果（圖6A）顯示，空載體組坐骨神經(jīng)細胞核亮度明顯，且破裂形成碎片發(fā)生解體，說明坐骨神經(jīng)組織內(nèi)部的細胞發(fā)生凋亡；bFGF治療組細胞核亮度變?nèi)酰旧|(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化；bFGF團聚體治療組細胞核形完整，核亮度明顯低于bFGF治療組，染色質(zhì)均勻。凋亡細胞計數(shù)結(jié)果（圖6B）顯示，與正常對照組比較，空載體組細胞發(fā)生大量凋亡（P＜0.01），給予bFGF治療后凋亡細胞減少（P＜0.01），bFGF團聚體的治療后凋亡細胞進一步減少（P＜0.05）。說明DPN大鼠經(jīng)bFGF團聚體治療后，坐骨神經(jīng)內(nèi)部凋亡細胞被抑制，效果較bFGF更明顯。

2.5 bFGF團聚體促進DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞增殖

由圖7結(jié)果可知，空載體組坐骨神經(jīng)組織中Ki67和PCNA蛋白水平較正常對照組明顯降低（P＜0.01）；給予bFGF治療后，其Ki67和PCNA蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；bFGF團聚體治療組坐骨神經(jīng)組織中Ki67和PCNA蛋白水平增加最為明顯（P＜0.05）。說明bFGF團聚體能顯著促進DPN大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)元和許旺細胞的增殖，對DPN大鼠坐骨神經(jīng)具有良好的促再生作用，效果優(yōu)于單用bFGF。

Fig.5 Effect of bFGF-coacervates on histological improvement of sciatic fibers in DPN rats by HE staining.See Fig.4 for the rat treatment.On the 30thday after treatment，both sides of sciatic nerves were taken，and pathological structure of sciatic fibers was assessed.A：cross-sectionaltissue slices in low-power field，the accumulation and irregular arrangement of nerve fibers are indicated by black arrowheads，and the red arrowheads represent clear and regular nerve fibers；B：cross-sectionaltissue slic?es in high-power field，and the black arrows indicate demyelination and the red arrows representremyelination.

Fig.6 Effect of bFGF-coacervates on high glucoseinduced apoptosis in DPN rats.See Fig.4 for the rat treat?ment.A：DAPIapoptosis assay of sciatic nerve in DPN rats；B：the analysis of apoptosis nuclei on the 30thday after drug administration.The number of dead nuclei was calculated from 3 random 1 mm×1 mm areas.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normalcontrolgroup；##P＜0.01，compared with free-coacer?vate group；△P＜0.05，compared with bFGF group.

Fig.7 Effect of bFGF-coacervates on proliferation in sciat?ic nerve of DPN rats.See Fig.4 for the rat treatment.A：sci?atic nerve tissue samples were analyzed with Western blotting for Ki67 and proilferating cell nuclear antigen（PCNA）protien levels；B：the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normalcontrolgroup；##P＜0.01，compared with freecoacervate group；△P＜0.05，compared with bFGF group.

3 討論

DPN的治療一直是困擾著世界的醫(yī)學難題。由于DPN的發(fā)病原因主要由高血糖所致，故目前治療DPN的最基本措施是控制血糖。但血糖的控制只能延緩DPN的發(fā)生發(fā)展，并不能治愈DPN。在10年的隨訪研究中，嚴格控制無臨床DPN的1型DM患者的血糖，仍有約40%患者發(fā)生不同程度的DPN［15-16］。故DM患者除嚴格控制血糖外，給予一定劑量的神經(jīng)類藥物治療必不可少。神經(jīng)營養(yǎng)因子是由組織和膠質(zhì)細胞產(chǎn)生且能夠刺激神經(jīng)細胞和軸突生長的一類蛋白質(zhì)分子。其中bFGF是這類家族中治療DPN效果較好的生長因子之一。bFGF廣泛分布于人體各組織器官中，是人體內(nèi)含有的一種微量活性蛋白。在體外，bFGF是重要的促有絲分裂因子，能夠延長多種中樞和外周神經(jīng)元的存活，刺激膽堿乙?；傅暮铣杉拜S突的生長。在體內(nèi)，bFGF除了作為神經(jīng)營養(yǎng)因子能擴大軸突直徑、增加相關(guān)的大直徑軸突的數(shù)量外，還具有促進血管新生的作用［17］。故在創(chuàng)傷修復和神經(jīng)再生領(lǐng)域均有廣泛的應用。但由于bFGF進入體內(nèi)易被酶解及在體液中快速擴散，導致其臨床應用受限。故設計或合成一種能高效結(jié)合bFGF并在體內(nèi)緩控其釋放又安全無副作用的載體成為科研工作者研究的焦點。

本課題組采用的新型生物材料PEAD是通過精氨酸與賴氨酸的縮合反應而得，具有原料價廉、合成簡單、在體內(nèi)易降解、安全無副作用且能結(jié)合多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的特點［11，18］。本研究將PEAD與bFGF通過肝素的離子間相互作用，組裝形成bFGF團聚體（PEAD+肝素+bFGF）。bFGF裝載率與釋放率檢測表明，該團聚體能夠大量結(jié)合bFGF并緩控其釋放。

本研究動物實驗結(jié)果表明，bFGF團聚體能持續(xù)地改善DPN大鼠外周運動神經(jīng)的功能。病理觀察可見bFGF團聚體治療后30 d，坐骨神經(jīng)內(nèi)排布紊亂的神經(jīng)纖維及脫髓鞘情況得到明顯改善，坐骨神經(jīng)的變性與斷裂顯著減少。該團聚體改善DPN大鼠坐骨神經(jīng)病理改變可能與其抑制坐骨神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)元和許旺細胞凋亡并促進其再生密切相關(guān)。由DAPI熒光染色的檢測結(jié)果可知，bFGF團聚體治療組DPN大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)的細胞核亮度和形態(tài)趨于正常，說明神經(jīng)組織內(nèi)細胞凋亡減少。

Ki67是一種由MKI-67基因編碼的核蛋白，其水平提示細胞增殖的活躍程度。PCNA與細胞DNA的合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用。為進一步探究bFGF團聚體對DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞的保護作用，運用Western蛋白印跡法檢測神經(jīng)組織內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA的表達水平。Western蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，bFGF團聚體治療組神經(jīng)內(nèi)部Ki67和PCNA蛋白表達水平高于空載體組和bFGF治療組，說明該團聚體可顯著地促進DPN大鼠受損神經(jīng)元的再生。本研究結(jié)果提示，bFGF團聚體對DPN大鼠的治療效果可能優(yōu)于單純的bFGF治療，同時減少給藥次數(shù)，延長藥物作用時間，為臨床治療DPN提供了新方法。

綜上，載體（PEAD+肝素）能很好地結(jié)合bFGF，相比目前在研的膠原支架或水凝膠等合成材料可能具有明顯的成本及療效優(yōu)勢。

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Effectofbasic fibroblastgrowth factor coacervates on experimentalneuropathy in diabetic rats

LIRui,ZOU Shuang,GAO Zheng-zheng,LIU Yan-long,ZHANG Hong-yu,XIAO Jian
(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biotechnology Pharmaceutical Engineering,College of Pharmacy of Wenzhou MedicalUniversity,Wenzhou 325035,China)

OBJECTIVETo explore the therapeutic effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) coacervates on diabetic peripheralneuropathy(DPN)in diabetic rats.METHODSPoly(ethylene argini?nylaspartate diglyceride)(PEAD),heparin and bFGF were dissolved in saline at the mass ratio of 50:10:1 to obtain bFGF coacervates.The loading efficiency ofbFGF in the coacervates was analyzed by Western blotting.The release profile ofbFGF from the coacevates was detected by ELISA.Male SD rats were ip injected with streptozotocin 65 mg·kg-1to establish a diabetic model,and DPN occurred 8 weeks later.The DPN rats were randomly divided into free-coacervate group,bFGF group and bFGF-coacervate group.For bFGF group,bFGF 200μg·kg-1was im injected once daily for 3 d.In bFGF-coac?ervate group,bFGF coacervate solution(244μL)equalto bFGF 200μg·kg-1,was im given only once. DPN rats in free-coacervate group were im given the same volume of vehicle(PEAD+heparin)only once.Ten normalage peer rats were taken as normalcontrolgroup.Footprintanalysis was conducted each week to evaluate motor function.On the 30thday after treatment,the rats were sacrificed,and sciatic nerves of both sides were harvested for pathological observation through HE staining.Apoptosis in nerve tissue was detected by DAPIstaining,and Ki67 and proliferating cellnuclear antigen(PCNA)protein levels were detected by Western blotting.RESULTSWestern blotting and ELISA analysis indicated that bFGF-coacervates were wellprepared ata mass ratio of 50∶10∶1,and controlled bFGF release for atleast 35 d.The result of rat behavior evaluation and pathologicalindex test indicated that,compared with normalcontrolgroup,the sciatic function index(SFI)in free-coacervate group decreased significantly (P＜0.01),the internal nerve fibers were accompanied by irregularity and serious demyelination,and there was a large number ofapoptotic nucleiand low expressions of Ki67 and PCNA proteins(P＜0.01). After injection with bFGF or bFGF-coacervates,the SFI increased progressively(P＜0.05,P＜0.01),and the proportion of fibers with myelin abnormalities and apoptotic cells was significantly reversed.More?over,the levels of Ki67 and PCNA was evidently enhanced on the 30thday post-operation(P＜0.05,P＜0.01).Compared with bFGF group,the results of those detection indicators in bFGF-coacervate group were better(P＜0.05,P＜0.01).CONCLUSIONPEAD and heparin complex can load bFGF with high efficiency,and controlits release in a steady manner.For DPN rats,treatmentwith bFGF-coacervates is more effective than bFGF alone.

basic fibroblastgrowth factors;diabetes;peripheralneuropathy;coacervates;heparin

ZHANG Hong-yu,E-mail:st_hyz@126.com;XIAO Jian,E-mail:xfxj20000@126.com

R971，R965.1

：A

：1000-3002-（2017）04-0295-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.001

Foundation item:The projectsupported by National NaturalScience Foundation of China(81372112)

2016-08-02接受日期：2017-04-10）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81372112）

李銳，碩士研究生，主要從事糖尿病外周神經(jīng)病變研究。

張宏宇，E-mail：st_hyz@126.com；肖健，E-mail：xfxj20000@126.com