siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞遷移與增殖的影響

劉麗敏　劉麗洲　趙娟　張麗

[摘要]目的研究siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞遷移與增殖的影響。方法采用Real Time-PCR、WesternBlot法檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后，Hela細(xì)胞中FOXF2基因mRNA、蛋白表達(dá)的變化；用劃痕試驗(yàn)檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后細(xì)胞的遷移能力，CCK8檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果Hela細(xì)胞內(nèi)FOXF2基因沉默后，Real Time-PCR、Western Blot檢測顯示siRNA沉默F(xiàn)OXF2組FOXF2基因mRNA、蛋白的表達(dá)均明顯下降（P<0.01）；劃痕試驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（P<0.01）；CCK8檢測顯示siRNA沉默F(xiàn)OXF2組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.01）。結(jié)論SiRNA沉默F(xiàn)OXF2基因促進(jìn)Hela細(xì)胞的遷移與增殖能力。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌；FOXF2；細(xì)胞遷移；細(xì)胞增殖

[中圖分類號]R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2017）03-30-04

宮頸癌是婦科最常見的生殖道惡性腫瘤之一，在全球其發(fā)病率僅次于乳腺癌。死亡率在婦科生殖道惡性腫瘤中占首位，其主要原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。當(dāng)前宮頸癌的治療方案主要是手術(shù)治療、放療、化療、生物治療及綜合治療等，多半在破壞腫瘤的同時(shí)，其對正常的細(xì)胞組織也產(chǎn)生了或多或少的損傷。該疾病的發(fā)病原因涉及致癌基因的激活和或抑癌基因的失活以及表觀遺傳學(xué)的改變等，是多階段、多因子的復(fù)雜調(diào)控過程?，F(xiàn)宮頸癌明確的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，其靶向治療是科學(xué)界較熱門的研究內(nèi)容。又頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（forkheadboxF2，F(xiàn)OXF2）蛋白是FOX家族的重要成員，它的特點(diǎn)是高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和組織特異性表達(dá)模式，它在細(xì)胞的生長和分化、調(diào)節(jié)胚胎的生成，和組織發(fā)展起著重要的作用。最近的研究表明，F(xiàn)OX基因的失調(diào)與腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展相關(guān)。有研究表明，F(xiàn)OXF2的低表達(dá)與乳腺癌患者的早發(fā)性轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。目前仍無FOXF2基因與宮頸癌的相關(guān)性報(bào)道。本研究從分子水平來闡述宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌分子靶標(biāo)治療的篩選提供有力依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，natocor），DMEM購自美國Gibco OptiMEM@I Medium和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectaminetm 3000購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Coming公司。RT-PCR試劑購自日本Takara。FOXF2 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，包含3條目的siRNA鏈，1條陰性對照siRNA鏈。Si-FOXF2 1305序列為：5GCAUCACUCUACU CCAGUGTT-3；Si-FOXF2 1415序列為：5-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3；Si-FOXF2 650序列為：5CCAGCGAGUUCAUG UUCGATT-3；陰性對照組（si-negative control）siRNA序列為：5-UUCUUCG AACGUGUCAC GUTT-3。兔抗人FOXF2 Ab、兔抗人GAPDH Ab購自美國Abcam公司。Hela細(xì)胞分為5組：Hela SNC組、Si-FOXF21305組、Si-FOXF2 1415組、Si-FOXF2 650組及未經(jīng)任何處理的Hela細(xì)胞作為對照組。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞復(fù)蘇，加入含100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素及10%FBS的DEME中培養(yǎng)，置入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)，24h內(nèi)更換培養(yǎng)液。對數(shù)生長期時(shí)，用0.25%胰酶消化、傳代、凍存。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天將Hela細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到30%一40%，PBS洗滌3遍，每孔加入900uLOptiMEM@IMedium。將3uL的Lip03000和5uL的siRNA分別與50uL的optiMEM@I Medium混懸，輕輕混勻后靜置5min。將含有Lip03000和siRNA的OptiMEM@I Medium輕輕混勻后靜置20min。將混勻的100uLDNA脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴入含有optiMEM@I Medium的細(xì)胞中。48h后提取RNA。

1.2.3 Rea]Tme-PCR檢測各組FOXF2 mRNA的表達(dá)終點(diǎn)提取RNA，采用紫外/可見光分光光度儀測量細(xì)胞樣品總RNA的濃度和純度，（A260/A280）為1.9～2.1之間提示RNA質(zhì)量良好。隨按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物序列為：GAPDH上游：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3，下游：5-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3；FOXF2上游：5TCGCTGGAGCAGAGC TACTT-3，下游：5CCCATTGAAGTI"GAGGACGA-3。最終獲得轉(zhuǎn)染率最高的si-Foxf2序列。

1.2.4蛋白印跡法檢測的3組FOXF2蛋白的表達(dá)按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為Hela SNC組、Si-FOXF2 1415組和未經(jīng)任何處理的SiHa細(xì)胞作為對照組。72h后加入適量的RIPA裂解液裂解細(xì)胞（凱基，南京1可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒（康為，北京）測蛋白濃度。GAPDH為內(nèi)參，按10%分離膠、6%濃縮膠制膠，按濃縮膠80V、分離膠120V恒壓電泳，200mA轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1～2h，1×TBST洗滌后孵一抗（兔抗人FOXF2 1：1000，兔抗人GAPDH 1：10000）4°過夜，次日1×TBST洗滌后孵二抗（羊抗兔1：2000）1h，洗滌，ECL顯影（merckmillipore）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)待轉(zhuǎn)染后取細(xì)胞融合90%時(shí)，用200uL移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕，用PBS洗滌3遍，換上DMEM培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72h在倒置顯微鏡下（10×10）測量劃痕的寬度。細(xì)胞遷移率=（1-即時(shí)劃痕寬度/原始劃痕寬度）×100%。

1.2.6 CCK8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染24h后Hela SNC組、Si-FOXF2 1415組和未處理Hela組的細(xì)胞，用10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在96孔板中加入100uL（9×103）的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h。PBS洗滌3遍，將每孔加入90uL DMEM及10uL CCK8的混合液，避光，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4h。酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞活性公式：細(xì)胞增值率（%）=（處理組OD450-空白孔OD450）/（空白對照組OD450-空白孔OD450）]×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)ela細(xì)胞FOXF2mRNA表達(dá)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示方差不齊（F=3.82，P=0.039），使用Dunnett T3進(jìn)行各組見多重比較。結(jié)果顯示：3條siRNA鏈沉默F(xiàn)OXF2后，siRNA-FOXF2mRNA較Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組明顯下降（65%～85%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），其中siRNA-FOXF2 1415鏈下降最明顯，選取其后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1，表1。

2.2 siRNA沉默F(xiàn)oxF2基因?qū)ela細(xì)胞FOXF2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因后，Hela細(xì)胞FOXF2蛋白表達(dá)水平較Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。見圖2。

2.3siR NA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)ela細(xì)胞遷移力的影響

細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示，siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因后，Hela細(xì)胞的遷移能力明顯高于Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組。見圖3。

2.4 CCK8檢測siR.NA～FOXF2基因?qū)dafi～胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：siRNA-FOXF2 1415組細(xì)胞增殖率明顯高于Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示方差齊（f=3.155，P=0.116）。見表2，圖4。

3.討論

宮頸癌跟大多數(shù)腫瘤相似，是以細(xì)胞過度增殖、無限生長為特征的疾病，體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞過度增殖，腫瘤組織的快速生長，進(jìn)而加劇惡性程度，該過程中主要的因素是癌基因的激活和或抑癌基因的失活。當(dāng)前宮頸癌的治療方案主要是手術(shù)治療、放療、化療、生物治療及綜合治療等，多半在破壞腫瘤的同時(shí)，其對正常的細(xì)胞組織也產(chǎn)生了或多或少的損傷。且宮頸癌細(xì)胞對放化療出現(xiàn)越來越多的耐受現(xiàn)象，迫切需要對腫瘤細(xì)胞特異性的靶點(diǎn)治療。RNA干擾是由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)、進(jìn)化過程高度保守、高效特異性的降解同源mRNA現(xiàn)象。將特異性siRNA轉(zhuǎn)染入生物細(xì)胞內(nèi)即可引發(fā)RNA干擾，進(jìn)而對特定基因的表達(dá)起到抑制作用。大量文獻(xiàn)表明，RNA干擾可用于治療單基因疾病和蛋白過度表達(dá)相關(guān)疾病。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖、凋亡失衡的結(jié)果，特異性靶向基因治療是提高治療效果的一個有效途徑。隨著siRNA技術(shù)的不斷進(jìn)步，多靶點(diǎn)的聯(lián)合治療在促腫瘤細(xì)胞凋亡及提高其對化療藥物的敏感性中發(fā)揮重要作用，具有良好的應(yīng)用前景。

又頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（forkhead boxF2，F(xiàn)OXF2）蛋白是FOX家族的重要成員，是間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，在與上皮相鄰的間質(zhì)中特異性表達(dá)，調(diào)控上皮間質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化維持組織穩(wěn)態(tài)。研究表明FOXF2在前列腺良性增生及正常前列腺組織中高表達(dá)，而在前列腺癌中較少表達(dá)。也有研究表明，F(xiàn)OXF2的低表達(dá)與乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移有關(guān)，且提示預(yù)后不良。在癌細(xì)胞的調(diào)查研究表明FOXF2的低表達(dá)與細(xì)胞過度增殖相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。SiRNA沉默F(xiàn)OXF2后，F(xiàn)OXF2的低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的遷移及增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，進(jìn)而加重腫瘤的惡性程度。闡明了FOXF2與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為宮頸癌的靶向治療提供理論依據(jù)。