廣西境內(nèi)馬褂木天然群體遺傳多樣性的ISSR分析

李龍梅　石曉蒙　蔣維昕　白天道　蒙奕奕　譚飛燕　黃壽先

摘要： 為弄清廣西境內(nèi)馬褂木（Liriodendron chinense）天然群體的遺傳多樣性及分布情況，該研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記，對廣西境內(nèi)現(xiàn)存的6個(gè)野生馬褂木種群進(jìn)行遺傳多樣性分析及評價(jià)。結(jié)果表明：廣西馬褂木群體具有較豐富的遺傳多樣性，6個(gè)參試群體的平均（及總體）有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis 基因多樣度（H）和Shannon信息指數(shù)（I）分別為1.454 1（1.633 7）、0.257 6（0.363 3）和0.378 6（0.529 3）；群體間存在基因流動但水平有限（Nm=1.218 4），使群體間存在較高遺傳分化（Gst =0.291 0）；聚類分析（UPGMA）將6個(gè)天然群體分為東部（全州QZ、資源ZY及融水老堡RSL）、西部（融水安太RSA、環(huán)江HJ及樂業(yè)LY）兩組，其中東部組具有較低遺傳多樣性及較高的遺傳分化，可能受到較強(qiáng)的人為干擾；Mantel檢驗(yàn)表明群體間符合距離隔離模式（R=0.545， P=0.043），表明人為破壞導(dǎo)致的生境碎片化是造成廣西馬褂木天然群體遺傳分化的重要原因。針對廣西馬褂木天然群體較豐富的遺傳多樣性及較高的遺傳分化，除了考慮對遺傳多樣性較高群體（如RSA及HJ）進(jìn)行原地保護(hù)外，宜對各群體采集種子或穗條，統(tǒng)一營建基因資源收集區(qū)，以供后續(xù)育種及生產(chǎn)利用。

關(guān)鍵詞： 馬褂木， 天然種群， ISSR標(biāo)記， 遺傳多樣性， 遺傳分化

中圖分類號： Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01002207

Abstract： In order to understand the genetic diversity and distribution model of Liriodendron chinense natural population in Guangxi Zhuang Autonomous Region， the genetic diversity and structure of six natural populations were analyzed by using ten ISSR markers. The results showed that there were abundant genetic diversity in six Liriodendron chinense natural populations. The average （or total） effective number of alleles （Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannon information index （I） of six populations were 1.454 1 （1.633 7）， 0.257 6 （0.363 3） and 0.378 6 （0.529 3）. A limited gene flow （Nm=1.218 4） resulted in a high genetic differentiation （Gst=0.291 0） among populations. The six populations were divided into two groups depending on cluster analysis （UPGMA method）. One group （west group） contains the populations near the west （RSA， HJ and LY） and the other （east group） included the populations near the east （QZ， ZY and RSL）. The east group had a lower genetic diversity and higher differentiation than the west one， which probably implied that populations in east group were strongly disturbed by human activities. Mantel test （R=0.545， P=0.041） displayed a significant isolation by distance model among populations， which also implied that habitat fragmentation due to human activities was an important factor for a highly genetic differentiation among populations. In the light of abundant genetic diversity and highly genetic differentiation on L. chinense populations in Guangxi， not only in situ conservation for the populations with abundant genetic diversity （e.g. RSA， HJ） is critical， but also ex situ conservation by seeds or cuttings collecting for all populations is also essential for further breeding and propagation.

Key words： Liriodendron chinense， natural population， ISSR marker， genetic diversity， genetic differentiation

馬褂木（Liriodendron chinense）系木蘭科（Magnoliaceae）鵝掌楸屬（Liriodendron）高大喬木，是國家公布的Ⅱ級瀕危保護(hù)植物（王章榮，2005）。馬褂木干形直、生長快，是優(yōu)良的用材樹種；葉形奇特，形似馬褂，花大而美，是優(yōu)良的園林觀賞樹種（李周歧和王章榮，2000）；也是一個(gè)很古老的孑遺樹種，對古植物系統(tǒng)學(xué)研究具有重要的科研價(jià)值（惠利省，2010）。馬褂木在我國分布范圍較廣（22°37′～32°38′ N，103°15′～120°17′ E），分布于11個(gè)省區(qū)的84個(gè)縣（郝日明等，1995）。但隨著生境變化及人為破壞，其天然分布及群體數(shù)量越來越稀少（賀善安和郝日明，1999）。在廣西，現(xiàn)有馬褂木天然分布區(qū)主要位于桂北與黔、湘交界區(qū)域，呈片段狀分布。作為廣西北部重要的樹種之一，其天然種群的遺傳多樣性如何，群體間遺傳差異有多大，目前尚不得而知。

ISSR是一種比較理想的分子標(biāo)記（Reddy et al，2002；王建波，2002；趙謙等，2008）。已被用于許多樹種的遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定、遺傳作圖、基因定位等研究中（張博，2005；Feyissa et al，2007；汪瓊等，2013；林樂靜等，2015；劉春英等，2013）。遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)反映了一個(gè)物種生存和發(fā)展的重要特征。一些學(xué)者對中國馬褂木種源或野生群體進(jìn)行了遺傳多樣性研究，部分研究認(rèn)為中國馬褂木的遺傳多樣性處于較低水平（惠利省，2010；占志勇，2010），但亦有研究認(rèn)為其具有較高的遺傳多樣性（Li et al，2014）。但在遺傳分化上均一致認(rèn)為群體間分化較大，彼此基因交流較少，認(rèn)為馬褂木天然群體生境已嚴(yán)重碎片化（李建民和周志春，2002；惠利省，2010；Li et al，2014）。以往研究主要從大尺度上（全國范圍）對馬褂木的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，采樣地點(diǎn)涉及全國諸多省區(qū)。但對廣西區(qū)內(nèi)天然馬褂木群體的分布現(xiàn)狀及遺傳多樣性水平鮮有涉及，僅少數(shù)文獻(xiàn)在研究中涉及到了廣西資源貓兒山群體（朱曉琴等，1997；Li et al，2014）。

雖然這些研究從整體上對中國馬褂木的分布格局和遺傳資源的保護(hù)和利用提供了非常有價(jià)值的信息，但對局部范圍內(nèi)馬褂木天然種群進(jìn)行遺傳多樣性及區(qū)域遺傳結(jié)構(gòu)研究可以更清楚地揭示小尺度水平上馬褂木遺傳多樣性水平及變化規(guī)律，剖析其產(chǎn)生原因，進(jìn)而為該地區(qū)天然馬褂木遺傳資源的合理保存和利用提供理論依據(jù)。同時(shí)也作為馬褂木大尺度研究的有效補(bǔ)充，完善中國馬褂木遺傳資源的保存策略?；诖?，本研究利用ISSR分子標(biāo)記，分析了廣西境內(nèi)馬褂木天然群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，力求為廣西現(xiàn)有馬褂木天然群體的合理保存、收集與利用提供參考。

1材料與方法

1.1 研究材料及采樣策略

研究材料為廣西境內(nèi)的6個(gè)馬褂木野生群體（表1），采樣地分別位于廣西全州安和（QZ）、資源兩水（ZY）、融水老堡（RSL）及安太（RSA）、環(huán)江明倫（HJ）及樂業(yè)雅長（LY） 6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)。

采樣策略為每個(gè)群體隨機(jī)挑選30個(gè)植株，盡量保證群體內(nèi)采樣株間距在30 m以上（其中LY群體由于株數(shù)太少（9株）而對群體內(nèi)所有植株進(jìn)行了采集），樣本共計(jì)159個(gè)。分別采集3～5片嫩葉裝入塑料自封袋，編號后置于冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取與檢測馬褂木葉片總DNA采用試劑盒（杭州博日）提取。然后取5 μL DNA樣品，利用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測（DYY12型高壓電泳儀，北京六一）。利用NanoDrop ND1000（Themo scientific，美國）檢測DNA的濃度與純度，并根據(jù)測定結(jié)果將濃度稀釋至60 ng·μL1。

1.2.2 ISSR引物篩選ISSR引物源于加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia）公布的序列（Set No.9， No.801900）。經(jīng)引物合成（上海捷瑞）、篩選，選取了擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的10條引物作為標(biāo)記引物（表2），進(jìn)行群體檢測。

1.2.3 ISSRPCR擴(kuò)增條件與檢測ISSRPCR擴(kuò)增體系：總體積20 μL，其中含10×buffer為2.0 μL、MgCl2濃度為1.8 mmol·L1、dNTPs終濃度為0.2 mmol·L1、引物終濃度為0.5 μmol·L1、 Taq DNA 聚合酶1 U、DNA模板60 ng。于Biometra TGradient 96 PCR儀（德國）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50～56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)，72 ℃完全延伸7 min，4 ℃保存（石曉蒙等，2013）。PCR產(chǎn)物檢測：取8 μL PCR產(chǎn)物，用水平電泳分離條帶（1%瓊脂糖凝膠）。電壓100 v，電泳時(shí)間1 h ，以100 bp ladder DNA為參照。電泳完成進(jìn)行凝膠成像（Biosens SC750凝膠成像系統(tǒng)）（其中，10×buffer、dNTPs、Taq DNA 聚合酶均購自捷瑞生物工程有限公司。）

1.2.4 數(shù)據(jù)分析能清晰擴(kuò)增的位點(diǎn)進(jìn)行記錄（有條帶記為1，無條帶記為0，構(gòu)建各群體的0、1矩陣）。利用POPGENE1.32（Yeh et al，1999）計(jì)算群體遺傳多樣性指標(biāo)，包括有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣度（H）、Shannon信息指數(shù)（I）及多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）等、群體間Neis遺傳距離（D）及基因分化系數(shù)（Gst）；利用GenAlEx 6.5進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)（Peakall & Smouse，2012）；利用MEGA 5繪制系統(tǒng)聚類圖（UPGMA法）（Tamura et al，2011）。

2結(jié)果與分析

2.1 參試ISSR標(biāo)記擴(kuò)增多態(tài)性分析

對ZY、QZ、RSA、RSL、HJ及LY共6個(gè)自然群體進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：每個(gè)標(biāo)記在參試群體中擴(kuò)增出的條帶數(shù)不等，在10～16條之間（平均12.5條）。10個(gè)標(biāo)記的多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）在92.86%～100%之間（平均97.95%）；擴(kuò)增位點(diǎn)的片段大小在200～2 200 bp之間；其中擴(kuò)增位點(diǎn)最多的為UBC881（16個(gè)），最少為UBC889及UBC890 （10個(gè)）（表2，圖1）。

2.2 群體遺傳多樣性分析

總體來看，6個(gè)參試群體的有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣度（H）、Shannon信息指數(shù)（I）及多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）分別在1.383～1.546、0.213～0.309、0.312～0.455及57.6～81.6之間。RSA群體在參試群體中遺傳多樣性水平相對最高（N=1.546，H=0.309，I=0.455，PPB=81.6），而RSL群體各遺傳多樣性指標(biāo)均最低（N=1.383，H=0.213，I=0.312，PPB=57.6）， 6個(gè)群體中有3個(gè)群體（ZY、 RSL、LY）的遺傳多樣性指標(biāo)均低于平均值（表3）。

2.3 群體遺傳分化分析

經(jīng)過計(jì)算，發(fā)現(xiàn)有29.1%的遺傳變異發(fā)生在6個(gè)群體間（Gst=0.291）（表4），而種群內(nèi)遺傳變異為70.9 %；AMOVA分析亦獲得類似結(jié)果，6個(gè)參試群體間的遺傳變異約為31.5%（ФST=0.315）。這接近于以往馬褂木大尺度水平上的研究結(jié)果（李建民等，2002；惠利省，2010）。群體間的基因流Nm為1.218，稍高于Wright（1931）提出的可以有效阻止因遺傳漂變而引起的群體間遺傳分化的臨界值（Nm>1）。說明參試種群間雖存在基因交流，但群體間在遺傳上仍然有不小的分化，這意味著該基因流水平未能有效阻止參試群體間在遺傳上的分化。

2.4 群體的遺傳距離及聚類分析

6個(gè)馬褂木野生群體的遺傳距離的變化在0.101 4～0.232 8之間（平均0.1742） （表5）。其中LY群體與其他幾個(gè)群體的遺傳差異相對較大?；谌后w間遺傳距離，構(gòu)建了6個(gè)馬褂木自然群體的親緣關(guān)系圖（圖2）。6個(gè)群體主要分為兩大類，一類是由處于東部的QZ、RSL及ZY群體構(gòu)成；另一類由靠近西部的HJ、RSA及LY群體組成?？傮w上距離較近的群體聚為一類。

Mantel檢驗(yàn)表明參試群體間在遺傳距離和地理距離上存在顯著的正相關(guān)性（R=0.545，P=0.043）（圖3），遺傳距離隨地理距離的增大而增大，說明地理隔離是導(dǎo)致群體間遺傳分化的原因之一。

3討論與結(jié)論

3.1 廣西現(xiàn)存馬褂木自然群體的遺傳多樣性

該研究利用ISSR標(biāo)記對廣西境內(nèi)現(xiàn)存的6個(gè)馬褂木自然群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，廣西現(xiàn)存馬褂木自然群體具有較豐富的遺傳多樣性。廣西馬褂木天然群體平均Neis基因多樣度（H）為0.257 6，總H為0.358 9。與前人研究利用等位酶（0.265 0）（朱曉琴等，1997）、RAPD（0.256 8）（李建民等，2002）及SRAP（0.252 1）（趙亞琦等，2014）標(biāo)記研究的馬褂木天然群體（或種源試驗(yàn)林）的多樣性水平相當(dāng)。與其他樹種比較，廣西馬褂木ISSR遺傳多樣性高于銀杏（Ginkgo biloba）（葛永奇等，2003）、楓香（Liquidambar formosana）（畢泉鑫等，2010）、錐栗（Castanea henryi）（龔榜初和劉國彬，2013）等樹種。在群體規(guī)模較小、其生境碎片化情況下，各群體仍能維持較高的遺傳多樣性，這一方面很可能與馬褂木高度異交的繁殖策略有關(guān)（Li et al，2014），另一方面，有效種群大小小于20個(gè)，不存在選擇和基因流時(shí)，遺傳漂變和近交對群體遺傳變異大小的影響才會凸顯（陳小勇，2000）。而本研究中，除LY群體外，其他群體大小均在30個(gè)以上，且大多為成年樹，同時(shí)群體間或多或少存在一定程度的基因流動（Nm=1.218 4），因此，群體的遺傳多樣性水平能夠在一定程度上得以維持。

3.2 廣西馬褂木自然群體的遺傳分化及原因

與其他從大尺度（全國范圍）上研究馬褂木遺傳分化的結(jié)果類似（惠利省，2010），廣西馬褂木天然群體間存在較高的遺傳分化（Gst=0.291 0）。雖然群體間基因流動（Nm=1.218 4）稍高于大尺度水平上的研究結(jié)果（朱曉琴等，1997；惠利省，2010；Li et al，2014），但與其他一些遺傳分化較低的樹種比較，該基因流水平仍然偏低（郎萍和黃宏文，1999；徐小林等，2005；畢泉鑫等，2010），不能有效阻止群體間的分化。Mantel 檢驗(yàn)（R=0.545，p=0.041）表明，群體間符合距離隔離模式，群體間分化程度大小與地理距離大小呈顯著正相關(guān)。這與以往馬褂木自然群體的研究結(jié)果一致（惠利省，2010；Li et al，2014）。馬褂木作為蟲媒植物（王章榮，1997），昆蟲對花粉傳播能力會顯著受到地理隔離的影響。

需要指出的是，盡管6個(gè)參試群體總體上符合距離隔離模式，但群體間現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)顯然還受到其他一些因素的影響。從遺傳距離聚類結(jié)果可知（圖3），群體間的遺傳距離大小與地理距離變化并不完全一致，從組間來看，RSA和RSL群體間的地理距離并不大，卻各自聚類到不同組中。主要原因可能是兩個(gè)群體受到的人為影響不同，RSL群體相對更靠近人類聚居區(qū)，受到的人為干擾和破壞更大。兩個(gè)群體截然不同的遺傳多樣性水平（RSL各項(xiàng)指標(biāo)均最?。┮矀?cè)面證實(shí)了這一點(diǎn)；此外，另一可能原因是位于兩個(gè)采樣群體間的元寶山對傳粉媒介起到了一定的阻隔作用，降低了基因流。從兩個(gè)組的遺傳多樣性及聚類圖可知，西部組群體具有相對較高的遺傳多樣性（其中LY群體因規(guī)模較小除外，可能近年幾十年來遭受較大強(qiáng)度的采伐破壞），群體間遺傳距離較小，據(jù)此可以推測，東部組群體演化過程受到人為干擾要遠(yuǎn)大于西部組。這可能歸因于東部組群體位于桂東北交通要道，人為活動頻繁，使群體規(guī)模劇減，群體間分化加大。

3.3 廣西現(xiàn)有馬褂木自然資源的收集與保存

在國內(nèi)野生馬褂木資源日漸稀少，遺傳多樣性急劇下降情況下，廣西境內(nèi)現(xiàn)有馬褂木野生群體仍具有較高的遺傳多樣性，這使得廣西現(xiàn)有馬褂木資源的保護(hù)、收集和保存具有重要意義。尤其對于遺傳多樣性較高的RSA及HJ群體，應(yīng)加強(qiáng)其現(xiàn)有棲息地的保護(hù)，減少人為破壞，通過結(jié)合自然保護(hù)區(qū)或生態(tài)防護(hù)林的方式，對其進(jìn)行就地保存。同時(shí)，針對廣西馬褂木群體間較高的遺傳分化現(xiàn)狀，應(yīng)考慮對各群體采集種子及穗條等，采用有性及無性繁殖方式，摸索適宜的配套繁育措施，在合適區(qū)域統(tǒng)一營建基因保存林，并結(jié)合種源試驗(yàn)，篩選出優(yōu)良種源及個(gè)體，在后續(xù)育種及生產(chǎn)中加以利用。

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