微生物絮凝劑產(chǎn)生菌篩選和廉價(jià)培養(yǎng)

秦國鳳 鄧冬梅

摘 要：微生物絮凝劑具有安全高效的特點(diǎn)，具有巨大應(yīng)用潛力.為開發(fā)更多微生物絮凝劑，本研究從活性污泥中分離純化高效絮凝劑產(chǎn)生菌株，初步確定其活性成分分布，并探討利用糖蜜廢液對其廉價(jià)培養(yǎng)的可行性.研究結(jié)果表明，16株能產(chǎn)生微生物絮凝劑的菌株中，呈革蘭氏陰性的Y3和S1菌株的微生物絮凝特性最好，對高嶺土懸濁液絮凝率分別達(dá)到98.9%和99.5%，其絮凝有效成分多為細(xì)胞外產(chǎn)物.稀釋20倍、40倍和60倍的廢糖蜜中菌株Y3和S1均可生長，在稀釋40倍的廢糖蜜中兩種菌生長量均最大，且在廢糖蜜中均保持了絮凝特性，表明糖蜜廢液可用于Y3和S1菌株的廉價(jià)培養(yǎng).

關(guān)鍵詞：微生物絮凝劑；廉價(jià)培養(yǎng)；絮凝率；糖蜜

中圖分類號(hào)：X703 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引言

目前絮凝沉降技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于給水、廢水處理[1-2]和污泥脫水[3]，其中的絮凝劑是一種可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒凝聚沉降的物質(zhì)[4]，主要有微生物絮凝劑，無機(jī)絮凝劑和有機(jī)合成高分子絮凝劑等.微生物絮凝劑，是由微生物產(chǎn)生或代謝的具有絮凝活性的天然生物高分子絮凝劑；無機(jī)絮凝劑有鋁鹽，鐵鹽等；有機(jī)合成高分子絮凝劑如聚丙烯酰胺.研究表明[5]：長期使用以鋁鹽為絮凝劑的水會(huì)引起老年癡呆癥；鐵鹽類對金屬設(shè)備具有腐蝕性；聚丙烯酰胺類單體物質(zhì)具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，且有較強(qiáng)的“三致”效應(yīng)，許多領(lǐng)域已被禁止或限量使用.而微生物絮凝劑化學(xué)成份主要為多糖，蛋白質(zhì)，糖蛋白，纖維素和DNA，是具有生物分解性和安全性的高效、無毒、無二次污染的綠色水處理劑，可以克服傳統(tǒng)型絮凝劑本身固有的缺陷，因此，成為當(dāng)今世界絮凝劑方面研究的重要課題[6-8].但由于其培養(yǎng)費(fèi)用高，發(fā)酵生產(chǎn)工藝不成熟，且絮凝效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，使得微生物絮凝劑還未廣泛生產(chǎn)和應(yīng)用.至今發(fā)現(xiàn)并鑒定出的絮凝劑產(chǎn)生菌已經(jīng)數(shù)十種，其種類繁多，包括霉菌、細(xì)菌、放線菌和酵母菌等[9].我國是制糖大國，糖蜜廢液是甘蔗制糖副產(chǎn)品，若能作為微生物的培養(yǎng)基，既可節(jié)省培養(yǎng)成本，又可廢物利用.本實(shí)驗(yàn)分別通過3種培養(yǎng)基對不同菌種進(jìn)行篩選，最后選用絮凝率高的菌株進(jìn)一步研究其生長情況，并對其進(jìn)行初步鑒定，確定其活性成分分布，探討用糖蜜廢液做廉價(jià)培養(yǎng)的可行性.

1 材料與方法

1.1 菌株篩選

實(shí)驗(yàn)分別采用察氏培養(yǎng)基篩選霉菌，用高氏一號(hào)培養(yǎng)基篩選放線菌，用酵母菌培養(yǎng)基篩選酵母菌，培養(yǎng)基配方如表1所示.

按表1中試劑的量進(jìn)行稱取混合，并調(diào)好pH后，經(jīng)121℃滅菌30 min.

在10 mL純水中加入脫水污泥1 g，180 r/min振蕩15 min后，將0.2 mL菌種稀釋液接種于60 mL的富集培養(yǎng)基中，在固體培養(yǎng)基上（在表1相對應(yīng)的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加15 g～20 g瓊脂粉即可制成對應(yīng)的固體培養(yǎng)基）對培養(yǎng)3 d后稀釋為l0-5，10-6，10-7的菌液進(jìn)行劃線分離培養(yǎng).選擇優(yōu)秀菌落進(jìn)行劃線分離（8次～10次），把純化的菌株在28 ℃，180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，2 d后進(jìn)行絮凝率測定.

1.2 絮凝率

2 mL菌液加入100 mL 5 g/L高嶺土懸濁液中，快攪2 min，慢拌5 min，靜沉5 min后，在550 nm波長處測上清液吸光度（K），同時(shí)以2 mL純水代替菌液作為對照（M）.絮凝率=（K-M）/M.

1.3 生長曲線和活性成分分布

分別在24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，測定在28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)環(huán)境下，接種有純化菌株2 mL的50 mL發(fā)酵液中菌株生長情況和絮凝率.生長情況以在波長660 nm處的OD值表示.活性成分測試：取菌液5 mL，3 000 r/min冷凍離心15 min，分離出的上清液和沉淀分別用純水補(bǔ)充到5 mL，加進(jìn)高嶺土懸濁液中測其上清液絮凝率.

1.4 糖蜜廢液廉價(jià)培養(yǎng)

分別在100 mL稀釋40倍、60倍、80倍的糖蜜廢液（稀釋后調(diào)至pH 5，在121 ℃滅菌30 min）中各加入所篩選出的菌株發(fā)酵液2 mL，180 r/min，28 ℃環(huán)境下?lián)u床培養(yǎng)，測生長曲線及絮凝率.

1.5 菌種初步鑒定

通過觀察菌株生長形態(tài)，并對單菌落觀察和載片培養(yǎng)、革蘭氏染色，最后在油鏡下觀察形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌篩選

通過平板分離純化培養(yǎng)，從活性污泥獲取16個(gè)菌株，將所獲取的菌株進(jìn)行6次～7次的純化分離后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，2 d后用高嶺土懸濁液測定絮凝率.結(jié)果如表2所示.

從表2中可看出，所獲得的菌株中，酵母培養(yǎng)基所培養(yǎng)篩選得的菌株絮凝率普遍較高，都大于90%，從中選取絮凝率最高的菌株Y3，S1做為下步實(shí)驗(yàn)菌株.

2.2 所篩選菌株的初步鑒定

圖1為Y3與S1菌落細(xì)胞經(jīng)過革蘭氏染色后的形態(tài)，從中可看出Y3細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色后顯紅紫色，是革蘭氏陰性菌；在10×100高倍顯微鏡下呈短棒狀.S1細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色后顯紅紫色，是革蘭氏陰性菌；在10×100高倍顯微鏡下呈橢圓形，晶瑩透亮，一端或兩端著紅色.

2.3 Y3與S1菌株的生長及絮凝特性

2.3.1 生長曲線 由圖2曲線可知：兩種菌株的絮凝率與生長情況都有很好的對應(yīng)關(guān)系，在Y3菌體量迅速增加的生長早期，絮凝率隨之上升，發(fā)酵液的絮凝率隨著細(xì)胞增長量的增加而同步上升的現(xiàn)象與李旭等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.第2 d，第3 d，第4 d菌體量穩(wěn)定，絮凝能力維持不變；第4 d后細(xì)胞開始衰亡，絮凝率跟著迅速下降，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)告的隨時(shí)間的延長，菌體生長變慢，絮凝活性有所下降的結(jié)論相吻合.S1與Y3相似，但S1產(chǎn)生絮凝物質(zhì)比較遲緩，平穩(wěn)期稍短.由此推斷：絮凝物質(zhì)隨著菌株的增長而產(chǎn)生，隨體系中解絮凝活性酶的產(chǎn)生或營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡不再產(chǎn)生，Y3和S1有效絮凝活性成分可能與細(xì)胞分泌物有關(guān).實(shí)驗(yàn)表明，最好是在對數(shù)生長期或穩(wěn)定早期收獲微生物絮凝劑，此時(shí)，絮凝活性最高.

2.3.2 絮凝活性成分分布 由圖3可知，菌株Y3，S1上清液的絮凝率都高于沉淀的絮凝率，由實(shí)驗(yàn)得到Y(jié)3和S1全菌液、離心后上清液、和沉淀（菌懸液）的最高絮凝率分別為90.2%，85.4%，70%和85.9%，73.3%，30.2%.由此可見，在離心后的Y3和S1上清液和發(fā)酵液中都存在絮凝活性成分，上清液中絮凝活性高，沉淀（菌懸液）中的絮凝活性較低.結(jié)果可見：絮凝劑是由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的代謝產(chǎn)物，和馬放等[12]的研究報(bào)道結(jié)果類似.

2.4 Y3和S1菌株在糖蜜廢液中的廉價(jià)培養(yǎng)

由圖4可知：菌株Y3與S1在40，60，80三個(gè)不同稀釋倍數(shù)的糖蜜廢液中生長情況類似，第1 d，第2 d增長迅速，最大增長都出現(xiàn)在第3 d，兩個(gè)菌株在糖蜜廢液稀釋倍數(shù)40 倍的情況下，OD值都達(dá)到最大，稀釋倍數(shù)為80倍的情況下，OD值最低.Y3與S1對比：Y3菌株在被稀釋的糖蜜廢液中生長情況比S1菌株明顯旺盛，相同接種量情況下，S1菌株在3個(gè)不同稀釋倍數(shù)的糖蜜廢液中的OD值均是Y3菌株的1/2，所以：糖蜜廢液中的物質(zhì)更易被Y3菌株所吸收利用，更適合Y3菌株生長.

結(jié)果表明：可以用稀釋后的糖蜜廢液對絮凝劑產(chǎn)生菌進(jìn)行培養(yǎng)，但不同的菌株培養(yǎng)效果存在差異.

2.5 Y3和S1菌株在糖蜜廢液中的絮凝率

由圖4～圖5可知：Y3菌株在第1 d～第3 d， OD值明顯增長，但絮凝率增長平緩；S1菌株的生長趨勢與絮凝率呈現(xiàn)出一定的對應(yīng)關(guān)系.兩個(gè)菌株都在第3 d出現(xiàn)最大OD值和絮凝率，第4 d，第5 d OD值和絮凝率都迅速下降.

由圖5可見，在稀釋倍數(shù)相同的糖蜜廢液中，兩個(gè)菌株的絮凝率不同，在稀釋40倍，60倍，80倍的糖密廢液中第1 d～第3 d，Y3菌株絮凝率增長平緩，S1菌株絮凝率增長明顯，但兩菌株都在第3 d達(dá)到最大絮凝率.Y3和S1菌株在稀釋40倍的糖蜜廢液中絮凝率達(dá)到最大分別為90.5%和 75.6%，在富集培養(yǎng)條件下的Y3和S1全菌液最大絮凝分別為：90.2%和85.9%，兩者相比，S1菌株的絮凝率稍有下降.與劉杏等[13]嘗試以糖蜜廢液作為絮凝劑產(chǎn)生菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似.本試驗(yàn)用糖蜜稀釋液做為培養(yǎng)基培養(yǎng)Y3和S1菌株，絮凝率最大可達(dá)到90.5%和75.6%，說明所篩選的菌株用糖蜜廢液作為替代培養(yǎng)基是適合的，且Y3菌株比S1菌株更為適合.

3 討論

1）其它相關(guān)微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及優(yōu)化[14-15]通過優(yōu)化培養(yǎng)條件（pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間等）和培養(yǎng)基組分來提高菌株絮凝率，本試驗(yàn)則是在培養(yǎng)條件固定的情況下試驗(yàn)糖蜜廢液是否適合作為其培養(yǎng)基.兩者相比：本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢在于降低微生物培養(yǎng)成本；不足之處是固定培養(yǎng)條件，限制了不同菌株達(dá)到自身最佳的絮凝效果，所以在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上需要進(jìn)一步優(yōu)化各菌株的培養(yǎng)條件以達(dá)到各自的最佳絮凝效果.

2）本實(shí)驗(yàn)中只以高嶺土懸濁液做為絮凝的主要實(shí)驗(yàn)對象，實(shí)際應(yīng)用中，還需進(jìn)一步用所篩選的菌種對其它廢水進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)，研究其實(shí)際應(yīng)用的潛力.對于同時(shí)含有色度和濁度的廢水，可以參照化學(xué)混凝與活性炭吸附聯(lián)用處理水源水研究[16]，用所篩選的菌種與其它技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行處理研究.

3）本實(shí)驗(yàn)中絮凝率測試中固定了絮凝時(shí)投加菌種的量，因而在做絮凝實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩個(gè)菌株所投加的最佳菌液量需要進(jìn)一步驗(yàn)證.

4）可通過16S rDNA序列分析法對菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從活性污泥中篩選所得的菌株Y3和S1是相對高效的絮凝劑產(chǎn)生菌株，絮凝劑的活性成分由微生物體產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外形成具有絮凝活性的物質(zhì).用糖蜜廢液對Y3和S1菌株進(jìn)行培養(yǎng)，Y3和S1菌株都能保持相對穩(wěn)定的生長和絮凝活性，說明糖蜜廢液中碳源、氮源等營養(yǎng)因子能較好地被Y3和S1所利用，糖蜜廢液能用于Y3和S1的廉價(jià)替代培養(yǎng)基.

參考文獻(xiàn)

[1] 魏旭.試論微生物絮凝劑在污水處理中的應(yīng)用[J].企業(yè)技術(shù)開發(fā)，2009，28（10）：16，20.

[2] 王宗華，曹邦卿，趙玉彬.生物絮凝在校園生活污水處理中的應(yīng)用研究[J].環(huán)境科技，2009，22（3）：47-51.

[3] 張娜，尹華，秦華明，等.微生物絮凝劑改善城市污水廠濃縮污泥脫水性能的研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3（3）：525-528.

[4] 袁宗宣，鄭懷禮，舒型武.絮凝科學(xué)與技術(shù)的進(jìn)展[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，24（2）：143-147.

[5] 張本蘭. 新型高效、無毒水處理劑-微生物絮凝劑的開發(fā)與應(yīng)用[J].工業(yè)水處理，1996，16（1）：7-8.

[6] 彭輝，尹華，梁郁強(qiáng)，等. 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)及其化學(xué)特征初探[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2002，25（1）：6-8.

[7] 劉紫鵑，徐桂云，劉志培，等. 絮凝劑BP25的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2001，41（3）：348-351.

[8] 王春梅，胡嘯林，章忠秀.有機(jī)高分子絮凝劑的合成及其應(yīng)用[J].工業(yè)用水與廢水，2002，33（1）：33-35.

[9] 劉立凡，聶錦旭. 中國微生物絮凝劑的生產(chǎn)研究現(xiàn)狀[J].環(huán)境污染與防治，2007，29（4）：276-279.

[10] 李旭，李小明，楊麒，等. 一株絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及其絮凝特性研究[J].生物技術(shù)，2007，17（1）：33-37.

[11] 陶然，楊朝暉，曾光明，等.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J].中國生物工程雜志，2005，25（8）：76-81.

[12] 馬放，李淑更，金文標(biāo)，等. 微生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].工業(yè)用水與廢水，2002，33（1）：7-9.

[13] 劉杏，邵林廣，張麗芳.生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 孝感學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（6）：39-42.

[14] 楊延梅.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及其培養(yǎng)條件研究[C]//中國生態(tài)學(xué)會(huì)微生物生態(tài)專業(yè)委員會(huì)年會(huì)論文集.新鄉(xiāng)：中國生態(tài)學(xué)會(huì)微生物生態(tài)專業(yè)委員會(huì)暨國際研討會(huì)，2007.

[15] 朱丹，蘇鴻雁，岳玉春.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)（綜合版），2010，9（4）：73-75.

[16] 鄧冬梅，肖林成，孫宇飛，等. 化學(xué)混凝與活性炭吸附聯(lián)用處理水源水研究[J].廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，24（3）：1-4.

Abstract：As microbial flocculant is safe and efficient， it has an extensive development and application potentiality. To find more microbial flocculant， this research screened strains producing microbial flocculants from sludge， explored the distribution of the active ingredient， and discussed the feasibility of using molasses wastewater as its cheap nutrient medium. The results showed that two gram-negative strains， named Y3 and S1 had the highest flocculating activity among the 16 strains isolated， and the flocculating rate of Y3 and S1 reached 98.9% and 99.5% respectively when using their fermentation liquid to treat kaoline soliquoid. Moreover， the flocculation effective components of the two strains were both extracellular products. Y3 and S1 both could grow in the 20， 40 and 60 times diluted molasses， and the growth of the two bacteria were best in 40 times diluted molasses growth were the biggest. Furthermore， the flocculation characteristics of the two strains both maintained in diluted molasses. The results suggested that molasses waste liquids can be served as cheap culture medium for the propagation of Y3 and S1.

Key words： microbial flocculant； cheap culture； flocculation rate； molasses

（學(xué)科編輯：黎 婭）