糖蜜發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸

班甲，陳駿佳，付盡國，楊李勝，陸劍華，李浩洋

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)， 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東省生物質高值化利用工程實驗室，廣東省植物纖維綜合利用工程技術研究開發(fā)中心，廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，廣東 廣州，510316)

糖蜜發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸

班甲，陳駿佳*，付盡國，楊李勝，陸劍華，李浩洋

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)， 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東省生物質高值化利用工程實驗室，廣東省植物纖維綜合利用工程技術研究開發(fā)中心，廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，廣東 廣州，510316)

對糖蜜作為碳源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid，DHA)進行了初步研究：選擇不同來源的甘蔗糖蜜與粗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)DHA，考察了糖蜜來源、糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵生物量、菌體油脂含量與DHA含量的影響。結果表明，甘蔗糖蜜中的雜質(灰分、膠體)對菌體生長與油脂積累存在明顯的抑制作用，即使大幅降低糖蜜添加比例效果也不理想，限制了其作為替代碳源在實際生產(chǎn)上的應用。在此基礎上考察了雜質含量相對較低的粗糖蜜的情況，在添加比例低于80%的情況下，其培養(yǎng)效果與對照葡萄糖非常接近，可以部分替代葡萄糖用于裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)。

裂殖壺菌；DHA；糖蜜；發(fā)酵

二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid，DHA)是一種重要的ω-3長鏈不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)[1]，具有促進大腦與視網(wǎng)膜發(fā)育，抗凝血，降低血脂，防治老年人癡呆癥與癌癥等重要功效[2-5]。人體只能利用食物中獲取的亞麻酸合成少量DHA，無法滿足身體營養(yǎng)需求，所以從飲食中獲取DHA已成為共識。因傳統(tǒng)深海魚油提取DHA存在諸多缺點[6-7]，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA已成為主流[8-9]。裂殖壺菌因其較快的生長速度和較高的油脂與DHA含量，一直以來被認為是理想的DHA生產(chǎn)菌株[10]。目前裂殖壺菌發(fā)酵原料主要為葡萄糖，生產(chǎn)成本較高，利用廉價或廢棄生物質(甜高粱汁[11]、清酒發(fā)酵廢液[12]、粗甘油[13]等)作為原料培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)DHA已見報道，為降低生產(chǎn)成本提供了新的思路。

糖蜜為制糖產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物，含有豐富的蔗糖、還原糖(葡萄糖，果糖)、氨基酸、維生素與微量元素等營養(yǎng)物質，且價格低廉，是一種優(yōu)良的發(fā)酵原料。其缺點為含有大量的膠體、灰分等雜質，不同程度地影響了發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量與質量[14-15]。

本實驗選擇了不同來源的甘蔗糖蜜與粗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)DHA，考察了糖蜜來源、糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵生物量、菌體油脂含量與DHA含量的影響，為以廉價糖蜜作為碳源工業(yè)化生產(chǎn)DHA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株

裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)，海水中分離篩選，保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2糖蜜

甘蔗糖蜜分別取自廣東、廣西8家糖廠；粗糖蜜取自廣州華僑糖廠與東莞東糖集團。

1.3培養(yǎng)基

普通種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母粉10、(NH4)2SO40.8、Na2SO45、MgSO4·7H2O 2、KH2PO40.5、KCl 0.5、CaCl2·2H2O 0.1，pH 6.0。

普通發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[16]：葡萄糖40、酵母粉10、(NH4)2SO40.8、Na2SO45、MgSO4·7H2O 2、KH2PO40.5、KCl 0.5、CaCl2·2H2O 0.1、FeSO4·7H2O 0.003、MnCl2·4H2O 0.001、ZnSO4·7H2O 0.0008、CoCl2·6H2O 0.000 02、Na2MoO4·2H2O 0.000 01、CuSO4·5H2O 0.000 6、NiSO4·6H2O 0.000 8、VB10.005、維生素VB120.014、生物素0.006，pH 6.0。

糖蜜種子與發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜處理液以培養(yǎng)基中總還原糖30 g/L或40 g/L計算加入，其余成分與普通培養(yǎng)基相同。

1.4培養(yǎng)方法

[17]提供的方法進行。

1.5糖蜜預處理

將糖蜜加蒸餾水稀釋至錘度55°BX，加入濃H2SO4調(diào)至pH2，90 ℃水浴加熱30 min，將蔗糖充分水解為還原糖，待糖液溫度降至70 ℃加NaOH調(diào)節(jié) pH 7.0，加入聚丙烯酰胺3 mg/L，保溫10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.6測定方法

生物量：按參考文獻[17]提供的方法進行。油脂含量：按參考文獻[17]提供的方法進行。DHA含量的測定：按參考文獻[17]提供的方法進行。還原糖濃度：采用DNS法測定[1]。糖蜜成分：糖蜜錘度、蔗糖、還原糖、膠體與灰分測定參照QB/T2684—2005[18]。

2 結果與分析

2.1不同來源甘蔗糖蜜灰分分析與預處理

2.1.1 甘蔗糖蜜灰分分析

甘蔗糖蜜中的灰分以鉀鹽與鈣鹽為主，其含量隨甘蔗品種、種植氣候、成熟程度、土壤條件、田間管理和制糖工藝流程等不同而變化[15]。本實驗調(diào)查了廣東翁源、廣西南寧、崇左、貴港等地共8家糖廠糖蜜中的灰分，試圖尋找到灰分含量較低的糖蜜作為發(fā)酵原料。從表1中的結果可以看出，糖蜜灰分含量與糖廠所在地區(qū)和制糖工藝存在一定聯(lián)系：廣東翁源因氣溫偏低導致蔗汁中膠體含量高，在制糖澄清過程中加入石灰量大，所以糖蜜灰分含量明顯高于廣西各地糖蜜；廣西扶南糖廠因采用碳酸法制糖，其工藝除雜效果要好于亞硫酸法，所以糖蜜灰分含量最低。根據(jù)上述結果采集廣東翁源、廣西良圻、廣西大新3家糖廠的糖蜜作為發(fā)酵實驗原料。

2.1.2 糖蜜預處理

選擇廣東翁源、廣西良圻、廣西大新3家糖廠糖蜜，對其進行了酸化、中和、絮凝、離心處理，將糖蜜中的蔗糖基本分解為還原糖，去除了糖蜜中大部分膠體及部分鉀離子、鈣離子，結果見表2。

表2 預處理后糖蜜主要成分

2.2不同來源甘蔗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌

裂殖壺菌對葡萄糖、果糖都可以很好地利用[17]，故以葡萄糖為對照，考察不同來源甘蔗糖蜜作為碳源對裂殖壺菌生物量、菌體油脂含量與DHA含量的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中糖蜜處理液以還原糖40 g/L計算加入，結合表3和表4的結果可以看出：良圻與大新2種糖蜜處理液中雜質含量接近，由于良圻糖蜜還原糖含量偏低，導致其加入量增加，使得其培養(yǎng)基中的K+、Ca2+含量高于大新糖蜜培養(yǎng)基；翁源與大新2種糖蜜處理液的加入量接近，由于翁源糖蜜中灰分含量太高，導致其培養(yǎng)基中的K+、Ca2+含量最高。圖1結果表明：與葡萄糖相比，以3種甘蔗糖蜜為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌其生物量、菌體油脂含量均有不同程度下降，說明甘蔗糖蜜處理液中殘留的雜質(灰分、膠體)對裂殖壺菌的生長與油脂積累存在明顯的抑制作用，油脂中DHA含量差異不顯著，說明甘蔗糖蜜中雜質并不會特異性抑制細胞內(nèi)DHA的合成。在膠體含量接近的情況下，3種甘蔗糖蜜培養(yǎng)基中灰分含量越低，發(fā)酵結果越好，說明甘蔗糖蜜中灰分含量對裂殖壺菌生長與油脂積累影響顯著，與預期結果相符。

表3 甘蔗糖蜜培養(yǎng)基中的雜質含量

表4 大新糖蜜培養(yǎng)基中的雜質含量

圖1 不同來源甘蔗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌對生物量、油脂含量、DHA含量的影響Fig.1 The effect of molasses from different sugar refineries on biomass, lipid and DHA production by Schizochytrium sp.

2.3不同甘蔗糖蜜添加比例培養(yǎng)裂殖壺菌的比較

根據(jù)先前的實驗結果，選擇大新糖廠糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌。以葡萄糖為對照，糖蜜處理液按照培養(yǎng)基中總還原糖的30%、60%、90%比例加入，余下部分通過葡萄糖補足，比較不同糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵的影響。圖2中的結果顯示裂殖壺菌發(fā)酵各項指標與甘蔗糖蜜添加比例成負相關，甘蔗糖蜜添加比例越高，菌體生物量與油脂含量越低，添加比例下降到30%的結果與對照相比仍存在明顯差距。

圖2 不同糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵影響Fig.2 The effect of different molasses formula on biomass, lipid and DHA production by Schizochytrium sp.

2.4粗糖蜜預處理

從上述的實驗結果可以看出，甘蔗糖蜜中雜質含量太高，即使大幅降低其添加比例對裂殖壺菌的生長與油脂合成的抑制作用仍然很顯著，進一步除雜的成本又太高，并不適合作為裂殖壺菌發(fā)酵的替代碳源。制糖工業(yè)除了以甘蔗、甜菜為原料制作成品糖外，還以原糖或砂糖為原料精煉生產(chǎn)各種精制糖，即煉糖。煉糖的生產(chǎn)過程一般包括蜜洗、清凈、脫色、結晶、分蜜和干燥等工序，在此過程中產(chǎn)生的糖蜜即為粗糖蜜[19]。粗糖蜜的總糖分與甘蔗糖蜜相當，雜質含量相對較少，更適宜作為發(fā)酵原料。故本實驗分別選取了以砂糖為原料的廣州華僑糖廠粗糖蜜(華蜜)與以原糖為原料的東莞東糖集團粗糖蜜(東蜜)，對這2種粗糖蜜進行了預處理，成分分析結果見表5。

表5 預處理后粗糖蜜主要成分

從表5中可以看出，以砂糖為原料的華蜜中的雜質要大大低于以原糖為原料的東蜜，分析原因一是砂糖中的雜質成分要大大低于原糖；二是華僑糖廠的工藝為采用壓濾糖汁除去不溶物，采用膜過濾脫色，整個煉糖過程幾乎未添加助劑；而東糖的工藝為傳統(tǒng)亞硫酸法，與普通甘蔗制糖類似，需添加石灰等大量助劑，導致糖蜜中雜質較多。

2.5粗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌

以葡萄糖與大新糖蜜為對照，考察2種粗糖蜜作為碳源對裂殖壺菌生物量、菌體油脂含量與DHA含量的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中糖蜜處理液以還原糖40g/L計算加入，結合表6和圖3的結果可以看出：因為2種粗糖蜜中灰分與膠體含量低于大新糖蜜，且其還原糖含量較高，使得在培養(yǎng)基中的添加量減少，所以2種粗糖蜜培養(yǎng)基中的灰分與膠體含量都要低于大新糖蜜培養(yǎng)基，以2種粗糖蜜為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌其生物量、菌體油脂含量均有較大幅度的提升；華僑與東糖2種糖蜜相比，因為華僑糖蜜雜質量更少，還原糖含量更高，所以培養(yǎng)結果也優(yōu)于東糖糖蜜。實驗結果再次驗證了糖蜜中的雜質(灰分，膠體)是影響發(fā)酵結果的關鍵因素，除雜工藝的高成本限制了甘蔗糖蜜的應用，選擇低雜質含量的粗糖蜜是一個更優(yōu)的選擇。

表6 粗糖蜜培養(yǎng)基中的雜質含量

圖3 不同來源粗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌對生物量、油脂含量和DHA含量的影響Fig.3 The effect of refined molasses from different sugar refineries on biomass, lipid and DHA production by Schizochytrium sp.

2.6不同粗糖蜜添加比例培養(yǎng)裂殖壺菌的比較

根據(jù)先前的實驗結果，選擇華僑糖廠粗糖蜜培養(yǎng)裂殖壺菌。以葡萄糖為對照，糖蜜處理液按照培養(yǎng)基中總還原糖的40%、60%、80%加入，余下部分通過葡萄糖補足，比較不同糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵的影響。結合表7和圖4的結果可以看出：因為華蜜的雜質含量較低，還原糖含量高，在添加比例60%的條件下其發(fā)酵結果依然良好，與對照相比差別不大，添加比例提高到80%后生物量與油脂含量有明顯下降；結合成本因素考慮，在實際生產(chǎn)中的添加比例為60%～80%。3種華蜜培養(yǎng)基中的Ca2+與膠體含量都比較低，差別不大，K+含量可能是決定發(fā)酵結果的關鍵因素。對比添加30%大新糖蜜培養(yǎng)基與添加60%華僑糖蜜培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基中K+含量接近，前者略低，膠體含量也比較接近，Ca2+含量后者遠低于前者，使得后者發(fā)酵結果要優(yōu)于前者。以上結果再次說明K+、Ca2+等灰分含量是影響糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)裂殖壺菌的關鍵因素，獲得低灰分含量，高還原糖含量的糖蜜原料是其在裂殖壺菌發(fā)酵中開展大規(guī)模應用的重點。

表7 華僑糖蜜培養(yǎng)基中的雜質含量

圖4 不同粗糖蜜添加比例對裂殖壺菌發(fā)酵影響Fig.4 The effect of different refined molasses formula on biomass, lipid and DHA production by Schizochytrium sp.

3 結論

甘蔗糖蜜價格低廉，營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)良的發(fā)酵原料。但其中含有的大量灰分和膠體是其作為發(fā)酵原料的主要限制因素。為此首先調(diào)查了廣東廣西各地8家糖廠甘蔗糖蜜的灰分情況，從中選擇了灰分含量較低的3種糖蜜經(jīng)預處理后作為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌，甘蔗糖蜜中的雜質(灰分、膠體)對菌體生長與油脂積累存在明顯的抑制作用，即使大幅降低糖蜜添加比例效果也不理想，繼續(xù)去除灰分等雜質的成本又很高，限制了其作為替代碳源在實際生產(chǎn)上的應用。在此基礎上又考察了雜質含量相對較低的粗糖蜜的情況，在添加比例低于80%的情況下，其培養(yǎng)效果與對照葡萄糖非常接近，可以部分替代葡萄糖用于裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)。

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UseofmolassesforDHAproductionbySchizochytriumsp.

BAN Jia, CHEN Jun-jia*, FU Jin-guo, YANG Li-sheng, LU Jian-hua, LI Hao-yang

(Guangdong Provincial Bioengineering Institute (Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute), Guangdong Provincial Key Laboratory of Sugarcane Improvement and Biorefinery, Guangdong Provincial Engineering Laboratory of Biomass High Value Utilization, Guangdong Provincial Engineering Technology Research and Development Center of Biomass Comprehensive Utilization, Guangzhou Key Laboratory of Biomass Comprehensive Utilization, Guangzhou 510316, China)

Docosahexaenic acid production bySchizochytriumsp. using molasses as carbon source was studied. Molasses from different sugar refineries were prepared as carbon source. Molasses sources and molasses proportion in the medium were investigated to evaluate the effect on the resultant dry cell weight, total lipid content and DHA yield. The results indicated that the colloid and excessive metal ions in the cane molasses had the noticeable negative effects on the growth ofSchizochytriumsp.. The growth was depressing even if the proportion of molasses significantly reduced. The application of the cane molasses as a substitute carbon source in the actual production was limited. On this basis the prospect of refined sugar molasses was evaluated. The result was very close between glucose and refined sugar molasses when the refined sugar molasses proportion in the medium was below 80%, refined sugar molasses might partly substitute for glucose as carbon source ofSchizochytriumsp..

Schizochytriumsp.; docosahexaenic acid(DHA); molasses; fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015075

碩士研究生(陳駿佳教授為通訊作者,E-mail：gzcsircjj@163.com )。

2017-06-30，改回日期：2017-08-03