Folin—Ciocalteu比色法測定頭花蓼多酚含量

江楠 李瀟彬 顧曼琦 廖莉玲

摘要[目的]建立頭花蓼中多酚含量的比色測定方法。[方法]以沒食子酸為對照品，對測定頭花蓼中多酚含量的比色條件（包括檢測波長、Na2CO3用量、Folin-Ciocalteu 試劑用量、反應(yīng)溫度及時間對吸光值的影響）進行了研究。[結(jié)果]當(dāng)FC試劑用量為2.5 mL，12% Na2CO3用量為7 mL時，在35 ℃下反應(yīng)40 min為最佳反應(yīng)條件；多酚的含量與760 nm 處吸光度呈良好的線性關(guān)系；測定方法的平均回收率為98.66%，RSD為0.380%。[結(jié)論]該方法不僅操作簡單，而且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度好，能夠用于頭花蓼提取液多酚含量的測定。

關(guān)鍵詞頭花蓼；多酚；Folin-Ciocaheu 比色法；檢測條件

中圖分類號S567文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）23-0114-02

Determination of Polyphenols in Polygonum capitatum by FolinCiocalteu Colorimetry

JIANG Nan1，LI Xiaobin2，GU Manqi2，LIAO Liling2*

（1.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550025；2.School of Chemistry and Material Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550001）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a colorimetric method for the determination of polyphenols in Polygonum capitatum. [Method]To gallic acid as a reference substance，the colorimetric conditions （the effects of detection wavelength，Na2CO3 dosage，F(xiàn)olinCiocalteu reagent dosage，reaction temperature and time on the absorbance value） were studied.[Result]When FolinCiocalteu reagent was 2.5 mL and 12% sodium carbonate solution was 7 mL， reaction 40 min at 35 ℃，there was a good linearity between the absorbance and gallic acid concentration in 760 nm，the average recovery was 98.66%and RSD was 0.380%.[Conclusion]This method is simple，accurate，repeatable and stable.It can be used for the determination of polyphenol content in Polygonum capitatum.

Key wordsPolygonum capitatum；Polyphenol；FolinCiocaileu colorimetry；Detecting condition

基金項目貴州省科技廳_2014 年度貴州省科技廳與貴州師范大學(xué)聯(lián)合基金計劃項目（黔科合LH字[2014]7064號）。

作者簡介江楠（1962—），女，貴州遵義人，副教授，從事食品化學(xué)、藥物化學(xué)方向研究。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物研究。

收稿日期2017-05-31

頭花蓼（Polygonum capitatum）為蓼科 （Polygonaceae） 蓼屬（Polygonum L.）多年生植物，又名小紅要、小紅藤等，主要分布在貴州、云南等地，現(xiàn)廣泛用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[1] 。目前從頭花蓼中分離和鑒定的主要化合物為黃酮類、酚酸類、有機酸、醇、酯、醛類等[2-3]。方煒等[4]用高速逆流色譜法同時分離制備得到頭花蓼中沒食子酸和原兒茶酸；劉躍等[5]建立了頭花蓼藥材中沒食子酸、 原兒茶酸、 陸地棉苷、 槲皮苷、 兒茶素、槲皮素- 3- O- （2″- 沒食子酰基）- 鼠李糖苷及槲皮素的 UPLC- MRM- MS 檢測方法；李占彬等[6]利用HPLC - MS/MS 同時測定頭花蓼中6種酚酸類有效成分。這些檢測方法雖然結(jié)果精確，但所需要的儀器價格高昂，操作也復(fù)雜。Folin-Ciocalteu 比色法由于操作簡單、成本低， 已廣泛用于測定植物中多酚的含量[7-10]。筆者探討了Folin-Ciocalteu 比色法測定頭花蓼總多酚的條件。

1材料與方法

1.1儀器101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），A200S型電子天平（Made in Germany），循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司），UV2300分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)Z102型微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）[7]。

1.2試材頭花蓼（施秉三元威門公司），沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（貴州迪大生物科技有限公司），F(xiàn)olin-Ciocalteu （分析純）。

1.3方法

1.3.1對照品溶液的制備。

精密稱取沒食子酸0.025 0 g，精確配制成0.025 0 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2頭花蓼樣液制備。

在70 ℃下將2.0 g頭花蓼粉末用100 mL水回流提取2次，每次1 h。將提取液稀釋于500 mL即得到待測試樣。

1.3.3Folin-Ciocalteu 法檢測條件。

1.3.3.1比色波長的測定。

分別移取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液，加入2.0 mL FC試劑及6.0 mL 12% 的Na2CO3 后稀釋至25 mL，30 ℃顯色1 h后，在 400～ 900 nm 波長范圍內(nèi)掃描，確定最佳檢測波長。

1.3.3.2FC試劑用量的研究。

取1 mL樣品液、6 mL 12% Na2CO3 溶液，然后分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0 mL的 FC試劑，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下 顯色 1 h后以試劑空白作參比， 在760 nm 下測定吸光度 。

1.3.3.3Na2CO3用量的研究。

取1 mL樣品液、2.5 mL FC試劑，12% Na2CO3溶液的用量分別為3、4、5、6、7、8 mL，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下 顯色 1 h后以試劑空白作參比， 在760 nm 下測定吸光度。

1.3.3.4顯色時間和溫度的確定。

取1 mL 樣品液、2.5 mL FC試劑、7 mL Na2CO3溶液，均定容至 25 mL棕色容量瓶中。分別在 20、25、30、35、40 ℃下顯色10、20、30、40、 50、60 min 后以試劑空白作參比，在 760 nm 下測定吸光度。

1.3.4方法評價

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL棕色容量瓶中，用最適宜的條件顯色后測吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2穩(wěn)定性試驗。

分別測定頭花蓼樣液顯色反應(yīng)完全（40 min） 后 0、20、 40、 60、80、100 min 的吸光度，該比色法的穩(wěn)定性根據(jù)吸光度的變化來評價。

1.3.4.3精密度試驗。

精密量取頭花蓼樣液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定吸光度，重復(fù)測定5次，以吸光度分析結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評價該儀器精密度。

1.3.4.4重現(xiàn)性試驗。

同一批頭花蓼樣品取5份提取樣液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進行檢測，以吸光度分析結(jié)果的RSD評價該比色法的重現(xiàn)性。

1.3.4.5加標(biāo)回收試驗。

分別測定提取液中加入不同量的沒食子酸后的多酚含量，并計算其回收率和RSD，以此評價該比色方法的準(zhǔn)確度和可靠性。

2結(jié)果與分析

2.1比色條件的測定

2.1.1最佳吸收波長。

從圖1可以看出，樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液在760 nm處有最大吸光度，因此確定最佳吸收波長為760 nm。

2.1.2最佳FC試劑用量。

當(dāng)FC試劑用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL時，吸光度分別為0.346、0.384、0.401、0429、0.461、0.460。由此可見，F(xiàn)C試劑用量在0.5～2.0 mL隨著用量的增加吸光度也在增加，在2.5 mL時達到最大值，之后吸光度開始穩(wěn)定，因此選擇2.5 mL為最佳用量。

2.1.3最佳Na2CO3用量。

當(dāng)Na2CO3用量為3、4、5、6、7、8 mL時，吸光度分別為0.414、0.434、0.457、0.461、0.464、0464。由此可見，從7 mL開始吸光度隨著Na2CO3用量的增加而穩(wěn)定開始趨于平緩，因此選擇7 mL為最佳用量。

2.1.4最佳顯色溫度和時間。

從表1 可以看出，溫度較低時，顯色反應(yīng)緩慢且吸光度較小；當(dāng)溫度升高時，顯色反應(yīng)加快且吸光度增大；但溫度升至40 ℃吸光度反而降低，表明顯色溫度不能太高。因此選擇最佳反應(yīng)溫度和時間為35 ℃、40 min。

2.2比色方法評價

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線。以沒食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，

得出線性回歸方程y=0.131 3x+0.005 3（R2=0.999 3），線性關(guān)系良好，該方程可用于頭花蓼多酚的定量測定。

2.2.2穩(wěn)定性試驗。在完全反應(yīng)后0、20、40、60、80、100 min時的吸光度分別為0466、0.465、0.466、0.464、0.463、0.463，RSD為0.297%。由此可見，溶液在100 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3精密度試驗。溶液重復(fù)測定5次的吸光度分別為0464、0.464、0.465、0.464、0.463，RSD為0.152%。表明儀器精密度良好。

2.2.4重復(fù)性試驗。

同一批頭花蓼分別提取5次。5份溶液的吸光度分別為0.466、0.466、0.464、0.464、0.465，RSD為0.215%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加標(biāo)回收試驗。由表2可知，4次加標(biāo)回收率在98.33%～98.98%，平均回收率為98.66%，RSD為0.380%。表明該研究所建立的 Folin-Ciocaheu 檢測法準(zhǔn)確可靠，完全可用于頭花蓼多酚含量的測定。

3結(jié)論

（1）該研究采用 Folin-Ciocalteu比色法測頭花蓼多酚含量，確定最佳的顯色條件為：2.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑、7 mL 12% Na2CO3、顯色溫度35 ℃、顯色時間40 min、測定波長760 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.131 3x+0.005 3（R2= 0.999 3）。

（2）該方法的穩(wěn)定性試驗、精密度試驗、重現(xiàn)性試驗、回收率試驗的RSD分別0.297%、 0.152%、0.215%、 0.380%，表明該研究建立起的 Folin-Ciocalteu 法測定頭花蓼多酚含量可信、可靠。

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