基于灰色關(guān)聯(lián)的苗藥紅禾麻總黃酮含量影響因子分析

鄒淑涵 陳胤睿 徐文芬 黃仕清 趙麗婷 齊維娜

摘 要：采用AlCl3比色法對(duì)苗藥紅禾麻42個(gè)居群中的總黃酮含量進(jìn)行分析測(cè)定，并用土壤養(yǎng)分測(cè)定儀測(cè)定對(duì)應(yīng)產(chǎn)地土壤中的銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀、pH值和水分，通過(guò)向距產(chǎn)地較近的氣象部門(mén)查詢(xún)和以全球衛(wèi)星定位系統(tǒng)GPS、海拔表等測(cè)定地理氣候因子，結(jié)合42個(gè)居群紅禾麻ISSR遺傳多樣性分析結(jié)果，運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材中總黃酮的含量與各影響因子進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：42個(gè)紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材總黃酮含量為0.42%～2.16%，平均加樣回收率為97.86%，RSD為1.5%；環(huán)境因子和遺傳因子中與總黃酮含量關(guān)聯(lián)度較大的因素分別為無(wú)霜期和Shannon信息指數(shù)I，而各影響因子與總黃酮含量的關(guān)聯(lián)度中，以Shannon信息指數(shù)I（r = 1.03）最大，土壤pH（r = 0.49）最小，表明遺傳因子對(duì)紅禾麻藥材總黃酮含量的影響大于環(huán)境因子。該研究結(jié)果為紅禾麻藥材優(yōu)良種質(zhì)資源篩選及野生變家種研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅禾麻種質(zhì)資源， 總黃酮， 遺傳因子， 環(huán)境因子， 灰色關(guān)聯(lián)度分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2017）04-0461-10

Abstract：The total flavonoids content of 42 groups of Guizhou miao medicine Laportea bulbifera were analyzed and determinated by AlCl3 colorimetric. The ammonium nitrogen， available phosphorus， available potassium， pH and water were determinated in the soil by soil nutrients tester and the origin of geographical climatic factors of L. bulbifera from different producing areas were consulted. In order to analyze the total flavonoids contents of different germplasm resources and impact factors by grey correlation degree analysis， geographical climate factors were determinated by the closed meteorogical department who had been inquired data and GPS， combined with the ISSR results of genetic diversity of 42 groups with the above measured data. The result revealed that the flavonoid contents of L. bulbifera in 42 groups of different germplasm resources was at 0.42%-2.16%， the average recovery rate was 97.86% and RSD was 1.5%， respectively. Frostfree period and the Shannon information index I were the biggest factors with the flavonoid contents in the environment factors and genetic factors. And the biggest correlation degree was Shannon information index I（r=1.03） and the smallest was the soil pH（r=0.49） in all of correlation degrees. It could be judged that genetic factor had more influence on the quality of medicinal materials L. bulbifera than environmental factor. The results provide the reference for choosing good germplasm resources and change the wild to the domestic.

Key words：Laportea bulbifera germplasm resources， total flavonoids， genetic factors，environmental factors， grey correlation degree analysis

紅禾麻系蕁麻科（Urticaceae）艾麻屬（Laportea）植物珠芽艾麻 （L. bulbifera）的新鮮或干燥全草，又名紅合麻（國(guó)家中醫(yī)藥管理局，2005）。紅禾麻為貴州重要的苗族藥物，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003），苗藥名為Uabdetdend 蛙斗等，性味辛、溫，有小毒，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕，活血化瘀之功效，用于治療風(fēng)濕麻木，跌撲損傷，骨折等疾?。_迎春和孫慶文，2013）。該藥材為貴州同濟(jì)堂有限公司民族藥“潤(rùn)燥止癢膠囊”的主要原料藥材，對(duì)治療老年血虛引起的皮膚瘙癢有獨(dú)特療效，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力較強(qiáng)。一直以來(lái)，紅禾麻的原材料供給主要依靠采挖野生資源，隨著市場(chǎng)需求量逐年增加，野生資源逐年銳減，藥材質(zhì)量良莠不齊，已不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要，目前亟需篩選優(yōu)良紅禾麻種質(zhì)資源進(jìn)行野生馴化研究。

種質(zhì)資源是提高中藥材質(zhì)量的關(guān)鍵和源頭，種質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)中藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量有決定性的作用，是進(jìn)行中藥材規(guī)范化基地建設(shè)的先決條件。紅禾麻種質(zhì)資源藥材質(zhì)量是由不同生境中的某種環(huán)境因子造成，還是不同居群的遺傳背景不同造成？它們與環(huán)境因子或遺傳背景之間是否存在某些關(guān)聯(lián)？這對(duì)篩選紅禾麻優(yōu)良種源非常重要。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)紅禾麻的研究報(bào)道，紅禾麻主要含有黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)化合物，黃酮類(lèi)具有較強(qiáng)抗氧化活性（Mincheol et al，2003），香豆素類(lèi)具有較好的鎮(zhèn)痛抗炎和免疫抑制作用（向明等，2006，2009；蘇志強(qiáng)等，2009；侯文睿等，2010；馬琳等，2012）。因此，本文采用比色法，以總黃酮為測(cè)定指標(biāo)，建立含量測(cè)定方法，分析測(cè)定紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材中總黃酮含量，并與對(duì)應(yīng)種源ISSR遺傳多樣性分析結(jié)果（內(nèi)因）和環(huán)境因素（外因），通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材總黃酮含量與各影響因子的關(guān)聯(lián)度，探討內(nèi)因和外因?qū)t禾麻藥材總黃酮含量的影響，為紅禾麻藥材優(yōu)良種質(zhì)資源篩選及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

UV1800紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；TPY-6型土壤測(cè)試儀（浙江托普儀器儀有限公司）；etrex venture手持GPS基準(zhǔn)定位儀（中國(guó)臺(tái)灣）等。蘆丁對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-200707，供UV測(cè)定的含量為92.5%），三氯化鋁、甲醇、乙醇等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

所有供試樣品均為課題組于各分布點(diǎn)采集，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻（L. bulbifera）的地上部分，憑證標(biāo)本存放于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)以深度約20 cm、對(duì)角線布點(diǎn)采集相應(yīng)產(chǎn)地土壤。藥材置于40 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎過(guò)3號(hào)篩，置干燥器中備測(cè)。土壤樣品自然風(fēng)干，粉碎過(guò)2號(hào)篩，置干燥器中。藥材樣品信息詳見(jiàn)表1，土壤樣品信息詳見(jiàn)表2。

1.2 紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材中總黃酮含量測(cè)定方法的建立

1.2.1 對(duì)照品溶液及顯色劑制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品30.80 mg，置于100 mL的容量瓶中，加70%乙醇溶解制成0.284 9 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液。稱(chēng)取AlCl3 25 g，加水溶解，制成10% AlCl3溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱(chēng)定重量， 置于水浴中加熱回流1 h， 放冷至室溫，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，分別等量加入石油醚（30～60 ℃）萃取4～5次，至石油醚層無(wú)明顯變化后，取下層萃取液，即得供試品溶液，精密量取該溶液0.5 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，自“加入10%AlCl3”起，依法測(cè)定其吸光度值。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取“1.2.1”下蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，各加入10% AlCl3溶液2 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，于40 ℃水浴中顯色反應(yīng)30 min，取出，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，于406 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度，以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，計(jì)算其回歸方程。

1.2.4 樣品測(cè)定 分別稱(chēng)取42個(gè)不同種質(zhì)資源紅禾麻藥材樣品粉末約1 g，精密稱(chēng)定，分別按“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，自“加入10%AlCl3”起，依法測(cè)定其吸光度值，將測(cè)得的吸光度值代入上述回歸方程，分別計(jì)算其以蘆丁計(jì)總黃酮的含量。

1.3 紅禾麻不同種質(zhì)資源產(chǎn)地的環(huán)境因子采集及測(cè)定

1.3.1 地理氣候因子的采集及查詢(xún) 采用手持GPS基準(zhǔn)定位儀，測(cè)定紅禾麻不同種質(zhì)資源產(chǎn)地的海拔、經(jīng)度及緯度，并通過(guò)當(dāng)?shù)貧庀蟛块T(mén)查詢(xún)氣象資料，獲取年平均溫度、7月平均溫度、年均降水量、年均日照時(shí)數(shù)以及無(wú)霜期等數(shù)據(jù)。

1.3.2 土壤養(yǎng)分測(cè)定 采用土壤養(yǎng)分速測(cè)儀，測(cè)定42個(gè)居群紅禾麻產(chǎn)地土壤樣品中銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀的含量以pH值；依照《中國(guó)藥典》2015年版四部0832水分測(cè)定第二法（ 烘干法）測(cè)定其水分含量（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）。

1.4 紅禾麻不同種質(zhì)資源遺傳多樣性測(cè)定分析

1.4.1 總DNA的提取及ISSR引物的合成與篩選 采用CTAB法提取紅禾麻總DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)DNA質(zhì)量，核酸定量分析儀檢測(cè)DNA純度， -20 ℃保存?zhèn)溆?。ISSR引物設(shè)計(jì)參照加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的序列（No.801-900），由上海生工生物工程股份有限公司合成。從70條ISSR引物中篩選出10條多態(tài)性好，條帶分布均勻，清晰易辨的引物來(lái)擴(kuò)增。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 反應(yīng)體系為25 μL的體系中包含模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 13 μL，引物（10 μmol·L-1）1 μL，用滅菌超純水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；52～58.2 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min，40次循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。PCR產(chǎn)物7 μL于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳1.0 h左右， 溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。同一引物擴(kuò)增的電泳遷移率一致的條帶有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，形成0/1矩陣。采用Popgene 32軟件計(jì)算42個(gè)居群紅禾麻的多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）、Neis遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannons多態(tài)性信息指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm），分析其遺傳多樣性水平。

1.5 紅禾麻總黃酮含量與影響因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)度分析法，是對(duì)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化系統(tǒng)發(fā)展態(tài)勢(shì)的量化比較。本研究以42批紅禾麻藥材中總黃酮含量作為母序列，對(duì)應(yīng)產(chǎn)地的環(huán)境因子（外因）及遺傳因子（內(nèi)因）為子序列，先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)下述公式計(jì)算出紅禾麻藥材中總黃酮含量與各影響因子的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。其中，分辨系數(shù)ρ為0.5。

再根據(jù)下述公式計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度：

2 結(jié)果與分析

2.1 紅禾麻種質(zhì)資源藥材中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，計(jì)算得回歸方程和相關(guān)系數(shù)為A=28.03C+0.028 3，r=0.999 5，表明蘆丁對(duì)照品溶液濃度在5.698～28.49 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。其方法學(xué)考察結(jié)果：精密度，計(jì)算相應(yīng)蘆丁對(duì)照品溶液吸光度值的RSD值為0.15%，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性，計(jì)算以蘆丁計(jì)總黃酮含量的RSD值為1.1%，表明本法測(cè)定的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性，計(jì)算相應(yīng)供試品溶液吸光度值的RSD值為0.19%，表明供試品溶液顯色在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定；加樣回收率，計(jì)算以蘆丁計(jì)總黃酮含量的平均回收率為97.86%，RSD值為1.5%，表明該方法測(cè)定的準(zhǔn)確度較高。42個(gè)紅禾麻種質(zhì)資源藥材中總黃酮含量為0.42%～2.16%，含量差異較大（表3）。

2.2 紅禾麻不同種質(zhì)資源產(chǎn)地的環(huán)境因子采集及測(cè)定結(jié)果

紅禾麻種質(zhì)資源不同產(chǎn)地地理氣候因子數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，土壤樣品中銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀、土壤pH值及水分含量結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 紅禾麻不同種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析結(jié)果

多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（PPB）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL，%）、等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、Neis基因多樣性H、Shannon信息指數(shù)I等6個(gè)指標(biāo)均可用于評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平，它們的值越大，說(shuō)明遺傳多樣性水平越高（表4）。

2.4 紅禾麻總黃酮含量與環(huán)境因子及遺傳因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析

紅禾麻藥材中總黃酮含量與各影響因子的灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果見(jiàn)表5。表5結(jié)果顯示，各影響因子對(duì)紅禾麻藥材中總黃酮含量影響為Shannon信息指數(shù)I（r=1.03）>經(jīng)度（r=0.97）>無(wú)霜期（r=0.95）>Neis指數(shù)H（r=0.91）> 7月均溫（r=0.84）>年均氣溫（r=0.82）>土壤有效鉀（r=0.81）>土壤銨態(tài)氮（r=0.77）>年均日照數(shù)（r=0.75）>土壤水分（r=0.72）>土壤速效磷（r=0.71）>年均降水量（r=0.69）>海拔（r=0.64）>緯度（r=0.63）>土壤pH值（r=0.49），環(huán)境因子中無(wú)霜期和經(jīng)度與總黃酮含量關(guān)聯(lián)度較大，其中總黃酮含量較高的產(chǎn)地貴州省赫章縣羅布石林（8號(hào)居群）、貴州省梵凈山蘑菇石（22號(hào)居群）、貴州省梵凈山拜佛臺(tái)（24號(hào)居群）、貴州省松桃縣烏羅鎮(zhèn)（29號(hào)居群），這四個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度較大無(wú)霜期較長(zhǎng)，研究結(jié)果提示可以通過(guò)大棚培育調(diào)整無(wú)霜期天數(shù)以增加有效成分積累，可提高紅禾麻藥材總黃酮含量。而在所以影響因子中Shannon信息指數(shù)I和Neis指數(shù)H與紅禾麻總黃酮含量關(guān)聯(lián)度最大，表明遺傳因子是影響紅禾麻藥材總黃酮含量的主導(dǎo)因子，結(jié)果顯示Shannon信息指數(shù)I和Neis指數(shù)H越大，即遺傳多樣性水平越高的居群，總黃酮平均含量較大，如：居群貴州省赫章縣羅布石林（4號(hào)居群）、貴州省赫章縣羅布石林（8號(hào)居群）、貴州省赫章縣韭菜坪（9號(hào)居群）、貴州省梵凈山拜佛臺(tái)（24號(hào)居群）遺傳多樣性水平較高（Shannon信息指數(shù)I （0.302 8～0.441 9），而其總黃酮含量也較高（1.43%～2.16%）。

3 討論

灰色關(guān)聯(lián)度分析是一種根據(jù)因素間發(fā)展趨勢(shì)的相似或相異程度，利用各子因素間的數(shù)值關(guān)系對(duì)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)進(jìn)行量化分析的方法。該方法簡(jiǎn)單易行，克服了回歸、相關(guān)性等分析方法的局限性。李倩等（2010）運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法確定了影響丹參品質(zhì)的主導(dǎo)氣候因子，王宗權(quán)等（2010）運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法確定了影響黃芪3種皂苷成分的主導(dǎo)環(huán)境因子分別為年均氣溫和平均無(wú)霜期， 蔡萍等（2014）運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度法分析影響杜仲中4種有效成分含量產(chǎn)地差異的主要環(huán)境因子。本研究運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，以紅禾麻不同種質(zhì)資源藥材中總黃酮含量作為母因素，以各環(huán)境因子和評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平的指數(shù)作為子因素進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)苗藥紅禾麻種質(zhì)資源42個(gè)地理居群的各影響因子與總黃酮含量變化的分析，Shannon信息指數(shù)I、Neis指數(shù)H、經(jīng)度、無(wú)霜期4個(gè)影響因子的關(guān)聯(lián)度較大（>0.90），其中Neis指數(shù)H關(guān)聯(lián)度最大，表明各影響因子中內(nèi)因（遺傳因子）對(duì)紅禾麻藥材總黃酮含量影響最大，因此選擇遺傳變異較小的優(yōu)良種質(zhì)資源，能夠更好地控制藥材品質(zhì)，其中貴州赫章縣羅布石林（4、8號(hào)居群），貴州赫章縣韭菜坪（9號(hào)），貴州梵凈山拜佛臺(tái)（24號(hào)居群）4個(gè)居群的遺傳多樣性指數(shù)和總黃酮含量較高，不僅可以作為人工育種的選育材料，而且對(duì)于苗藥紅禾麻種植適生地區(qū)劃研究有很好的參考價(jià)值。

本研究所建立的紅禾麻藥材總黃酮含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可行，可作為苗藥紅禾麻藥材的質(zhì)量控制方法，為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）收載的紅禾麻藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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