辣椒疫病罹病植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性分析

周濤 羅路云 陳紅松 張卓 羅源華

摘要：【目的】分析辣椒疫病罹病植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性，為辣椒疫病防控提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎杉祥L沙、吉首及永州地區(qū)辣椒疫病罹病植株根際土壤，運(yùn)用IlluminaMiSeq高通量測序技術(shù)對土壤樣品基因組DNA的16S rDNA-V4區(qū)進(jìn)行測序分析，明確不同地區(qū)罹病辣椒植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性?！窘Y(jié)果】3個(gè)地區(qū)罹病辣椒根際土壤的細(xì)菌OTU數(shù)量存在差異，獨(dú)有OTU占總體比例各有差異，其中永州地區(qū)占其總數(shù)的30.18%、吉首地區(qū)占其總數(shù)的41.83%、長沙地區(qū)占其總數(shù)的24.07%，3個(gè)地區(qū)共有OTU占所有檢測到OTU的14.95%。α多樣性指標(biāo)均表現(xiàn)為長沙地區(qū)最低，吉首地區(qū)最高。在門水平上，3個(gè)地區(qū)的罹病辣椒根際土壤微生物組成相似，優(yōu)勢菌門為Acidobacteria（酸桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門），但3個(gè)地區(qū)在相對豐度上表現(xiàn)一定差異?！窘Y(jié)論】湖南永州、吉首和長沙地區(qū)辣椒疫病罹病植株根際土壤細(xì)菌多樣性存在差異，以吉首最高、長沙最低；3個(gè)地區(qū)的罹病辣椒根際土壤微生物組成相似，但相對豐度存在差異。

關(guān)鍵詞： 辣椒疫病；根際土壤；微生物群落；多樣性

中圖分類號： S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-1014-05

Comparison on bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight

Abstract：【Objective】In the present study， bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight was studied to provide reference for control of pepper phytophthora blight. 【Method】Rhizosphere soil of peppers dying from phytophthora blight was collected from Changsha， Jishou and Yongzhou in Hunan. 16S rDNA-V4 regions of sample genome DNA were sequenced by IlluminaMiSeq high-throughput sequencing to analyze bacterial community diversity in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight in different areas. 【Result】Bacteria OTU number and proportions of unique OTU of rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of three areas were different. The proportion of Yongzhou accounted for 30.18% of the total， and that of Jishou accounted for 41.83% of the total and that of Changsha accounted for 24.07% of the total. Shared OTU of the three areas accounted for 14.95% of all detected OTU. Alpha diversity index were the lowest in Changsha and the highest in Jishou. At phylum level， the microbial composition was similar in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of three areas， the dominant bacteria were Acidobacteria， Proteobacteria， Actinobacteria and Chloroflexi， but relative abundance showed some differences. 【Conclusion】There is difference in bac-

terial community diversity in rhizosphere soil of peppers dying from phytophthora blight in Yongzhou， Jishou and Changsha， the diversity of Jishou is the highest while that of Changsha is the lowest. The microbial composition is similar in rhizosphere soil of peppers with phytophthora blight of the three areas， but the relative abundance is different.

Key words： pepper phytophthora blight； rhizosphere soil； microorganism community； diversity

0 引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國常年種植面積超過130萬ha。辣椒疫?。≒epper phytophthora blight）是由辣椒疫霉菌引起的一種真菌病害，可造成辣椒嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。辣椒疫霉菌侵染辣椒后可引起其器官腐爛或整株死亡（Sanogo and Ji，2013；Cao et al.，2014；Wang et al.，2014）；辣椒疫霉菌還可危害番茄、黃瓜、南瓜、茄子等多種茄科和葫蘆科作物，嚴(yán)重制約作物生產(chǎn)（Polo-López et al.，2013；伍善東等，2015）。近年來，隨著辣椒產(chǎn)業(yè)及辣椒種植區(qū)域的不斷擴(kuò)大，辣椒疫病危害面積也逐年擴(kuò)大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。土壤生態(tài)是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，與農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展直接相關(guān)（Maul et al.，2014）。因此，研究辣椒疫病罹病植株根際土壤微生物的組成和多樣性有助于進(jìn)一步了解辣椒疫病的發(fā)生機(jī)制，對辣椒疫病的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤微生物、理化性質(zhì)和酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，是調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境及功能的關(guān)鍵因子。土壤微生物能將土壤中的有機(jī)物和一些難分解的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物生長所需的營養(yǎng)成分（Yin et al.，2014）。每克土壤中一般含有104～106個(gè)真菌個(gè)體、106～1010個(gè)細(xì)菌個(gè)體和10～103個(gè)原生生物，而植物根際土壤微生物的數(shù)量較一般土壤多。植物根際土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，參與土壤中各種生物學(xué)和生物化學(xué)過程，對植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性產(chǎn)生重要影響。大量的土壤微生物聚集在植物根系周圍，與植物根系相互作用，形成微生態(tài)環(huán)境（Nadeem et al.，2014）。涂璇等（2007）對接種生防放線菌后土壤和辣椒根系微生物區(qū)系的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)拮抗放線菌可通過影響辣椒根際微生物來控制辣椒疫霉的生長繁殖。Nadeem等（2014）研究表明，在辣椒植株根際接種外來菌，可以調(diào)節(jié)植株根區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)，有利于保持和促進(jìn)土壤肥力和健康狀況，改變土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性，有可能從根本上控制辣椒疫病。Wang等（2014）發(fā)現(xiàn)蕓苔屬植物殘?bào)w作為土壤熏蒸材料與有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌結(jié)合，可通過影響辣椒根際土壤中微生物群落多樣性而達(dá)到防治辣椒疫病的目的。王秋君等（2015）進(jìn)行了銅綠假單胞菌結(jié)合生物熏蒸防控辣椒疫病的效果研究，結(jié)果表明，生物熏蒸結(jié)合施用銅綠假單胞菌是一種環(huán)保的防控辣椒疫病方法。羅路云等（2017）研究表明，施用沼澤紅假單胞菌PSB06可改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，提高土壤微生物群落豐富性及土壤中放線菌所占的豐度，達(dá)到防治辣椒疫病的目的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，微生物多樣性的分析手段主要是基于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法，但該方法僅針對群落中的可培養(yǎng)微生物。運(yùn)用高通量測序技術(shù)可準(zhǔn)確、全面地對樣品中細(xì)菌群落進(jìn)行鑒定，但相關(guān)研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集湖南長沙、吉首和永州地區(qū)辣椒疫病罹病植株根際土壤樣品，運(yùn)用IlluminaMiSeq高通量測序技術(shù)分析根際土壤中細(xì)菌群落多樣性，以期為辣椒疫病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

土壤樣品分別采集于湖南長沙（CS）、吉首（JS）和永州（YZ）3個(gè)地區(qū)，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)辣椒疫病嚴(yán)重發(fā)生田塊，使用五點(diǎn)取樣法采集土樣，采集后將土樣混勻，分別裝入采樣袋，低溫保藏，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃保存。3個(gè)采樣地均為常年種植同種辣椒品種，施肥條件一致，自然條件及土壤性質(zhì)相似。

1. 2 DNA測序、擴(kuò)增及測序

土壤DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒（MP Biomedicals，美國），具體步驟參照試劑盒使用說明。取5.0 μL基因組DNA使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，濃度和純度采用NanoDrop2000（Thermo Scientific，美國）測定，A260/A280在1.8～2.0，-20 ℃冰箱保存。以土壤DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)的引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：5.0 μL 10×PCR Buffer（含20 mmol/L MgCl2），1.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 U Taq DNA聚合酶，1.0 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s，68 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增完成后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。PCR回收產(chǎn)物送諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行IlluminaMiSeq高通量測序。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

先使用Barcode（標(biāo)簽序列）將不同樣品原始數(shù)據(jù)區(qū)分開，去除引物，刪除低質(zhì)量序列，然后使用FLASH程序（version 1.0.0）進(jìn)行拼接，采用UCHIME（version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。計(jì)算DNA矩陣，使用UPARSE程序在97%的序列相似度水平下對序列劃分操作分類單元（OTU）。RDP-Classifer分析設(shè)置置信度參數(shù)50%。對處理數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算不同分類水平上的OTU數(shù)量和Chao1，繪制稀釋曲線。通過Chao1、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson）多樣性評估序列文庫的α多樣性。以上分析均在Galaxy網(wǎng)站平臺上（http：//zhoulab5.rccc.ou.edu：8080/root）及R語言vegan程序包完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 3個(gè)地區(qū)辣椒根際土壤微生物群落OTU差異及多樣性比較

由圖1可看出，3個(gè)地區(qū)土壤樣品間細(xì)菌群落多樣性存在差異，各樣品的稀釋曲線趨于平緩，即認(rèn)為測序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性，且測序達(dá)飽和時(shí)表現(xiàn)為α多樣性JS>YZ>CS。對長沙、吉首和永州3個(gè)地區(qū)辣椒根際土壤樣品細(xì)菌群落的α多樣性指標(biāo)進(jìn)行評估，其中Shanon指數(shù)變化范圍為5.59～6.45，Simpson指數(shù)變化范圍為71.08～245.42，Chao1變化范圍為1016.14～ 1875.06（表1），3組數(shù)據(jù)均表現(xiàn)為長沙地區(qū)最低，吉首地區(qū)最高。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后按97%的序列相似性可劃分為2662個(gè)OTUs，其中永州地區(qū)檢測到1524個(gè)OTUs、吉首地區(qū)檢測到1841個(gè)OTUs、長沙地區(qū)檢測到910個(gè)OTUs；3個(gè)地區(qū)獨(dú)有OTU所占比例各有差異，其中永州地區(qū)占其總數(shù)的30.18%、吉首地區(qū)占其總數(shù)的41.83%、長沙地區(qū)占其總數(shù)的24.07%，3個(gè)地區(qū)重合OTU占所有檢測到OTU的14.95%，說明土壤樣品雖然均來源于辣椒疫病死亡植株根際，但3個(gè)地區(qū)在OTU水平上存在明顯差異（圖2）。

2. 2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

測得的細(xì)菌群落所有序列可被注釋到27個(gè)門、60個(gè)綱、75個(gè)目和147個(gè)科（表2）。從圖3可看出，在門的水平下，永州地區(qū)占優(yōu)勢地位的門有Acidobacteria（酸桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門）；吉首地區(qū)占優(yōu)勢地位的門有Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Planctomycetes（浮霉菌門）；長沙地區(qū)占優(yōu)勢地位的門有Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Firmicutes（厚壁菌門）和Thaumarchaeota（奇古菌門）。永州、吉首和長沙地區(qū)在門水平上微生物組成相似，但在相對豐度上表現(xiàn)出一定的差異，其中Actinobacteria的相對豐度分別為9.71%、25.07%和13.28%，Proteobacteria為30.38%、17.47%和17.31%，Chloroflexi為5.62%、9.12%和12.67%，Acidobacteria為22.18%、13.82%和2.96%。這4種優(yōu)勢菌門在3個(gè)地區(qū)的相對豐度總和分別為67.89%、65.48%和46.22%。在不同分類水平下相對豐度分析結(jié)果表明，Proteobacteria是最優(yōu)勢門，Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）為最優(yōu)勢綱，Actinomycetales（放線菌目）為優(yōu)勢目。

3 討論

前人主要通過分離培養(yǎng)對土壤微生物多樣性進(jìn)行研究，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的方法已不能全面鑒定土壤樣品中的微生物，只能鑒定其中可培養(yǎng)部分。馬云艷等（2015）對辣椒疫病病株和健株根際土壤中的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行鑒定并對其群落多樣性進(jìn)行檢測，但由于技術(shù)的局限性未能對其中不可培養(yǎng)微生物進(jìn)行多樣性分析。植物根際與其他生境一樣，根際微生物不僅具有豐富的多樣性，還含有大量未培養(yǎng)的微生物種群（Prosser，2002），因此有必要采用非培養(yǎng)手段對根際微生物進(jìn)行研究。本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析辣椒疫病罹病植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性，有助于全面了解湖南長沙、吉首和永州地區(qū)辣椒疫病根際土壤中細(xì)菌多樣性情況，為采用微生態(tài)調(diào)控技術(shù)防治辣椒疫病提供理論基礎(chǔ)。

根據(jù)Fierer和Jackson（2006）的研究結(jié)果可知，Acidobacteria、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacter-

oidetes在所有的生物群中均占優(yōu)勢地位，且在細(xì)菌群落組成上差異不顯著。近年來，越來越多的研究表明在各種不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落的優(yōu)勢門組成具有相似性（Fierer et al.，2011；Wang et al.，2011；Shen et al.，2013）。本研究中，在門水平上Acidobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria在3個(gè)地區(qū)均占優(yōu)勢地位，與前人的研究結(jié)果一致，但在相對豐度上3個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢門存在一定差異。

通常來說，健康植株根際土壤上比發(fā)病植株根際土壤擁有更多獨(dú)有的OTU，同時(shí)病株根際土壤細(xì)菌群落中更低的多樣性表明發(fā)病程度越高（Rosenzweig et al.，2012）。本研究比較了湖南永州、吉首和長沙3個(gè)地區(qū)辣椒疫病罹病植株根際土壤樣品的OTU差異，結(jié)果顯示3個(gè)地區(qū)獨(dú)有的OTU所占總體比例存在差異，其中永州地區(qū)占其總數(shù)的30.18%、吉首地區(qū)占其總數(shù)的41.83%、長沙地區(qū)占其總數(shù)的24.07%，表現(xiàn)為吉首>永州>長沙；同時(shí)，3個(gè)地區(qū)稀釋曲線及α多樣性結(jié)果也表現(xiàn)為吉首>永州>長沙，與OTU的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

湖南永州、吉首和長沙3個(gè)地區(qū)辣椒疫病罹病植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果表明，3個(gè)地區(qū)的辣椒疫病致死發(fā)病程度不同，吉首地區(qū)的辣椒疫病發(fā)病程度最重，長沙地區(qū)較低；3個(gè)地區(qū)的辣椒疫病罹病植株根際土壤微生物組成相似，優(yōu)勢菌門均為Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi，但在相對豐度上存在一定差異。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）