木薯再生體系建立的研究進(jìn)展

文峰 蘇文潘 黃建祺 鄭華 俞奔馳 付海天

摘要木薯是一種重要的糧食和工業(yè)原料作物。隨著細(xì)胞工程和基因工程的發(fā)展，生物技術(shù)育種要求一種高效的再生體系。從木薯的器官發(fā)生途徑、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑、脆性胚性愈傷組織（FEC）再生和原生質(zhì)體再生4個(gè)方面闡述了木薯再生體系的發(fā)展與建立，以期為木薯組織培養(yǎng)和基于木薯再生體系的技術(shù)進(jìn)步提供參考。

關(guān)鍵詞木薯；器官發(fā)生；體細(xì)胞胚發(fā)生；脆性胚性愈傷組織（FEC）；原生質(zhì)體；再生

中圖分類號(hào)S533文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0156-03

Research Progress of Establishment of Regeneration System in Cassava

WEN Feng1，2，SU Wenpan1，HUANG Jianqi1 et al（1.Guangxi Institute of Subtropical Crops，Nanning，Guangxi 530001；2.Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Horticultural Plant Biology （Ministry of Education），Wuhan，Hubei 430070）

AbstractCassava is an important crop for food and industrial raw materials.With the development of cell engineering and gene engineering，highly efficient regeneration system is a prerequisite for biotechnology breeding.This review summarizes the development and establishment of regeneration of cassava，via organogenesis，somatic embryogenesis，friable embryogenic callus （FEC） and protoplast，hoping to provide some useful reference for the technical progress of tissue culture and regeneration system of cassava.

Key wordsCassava；Organogenesis；Somatic embryogenesis；Friable embryogenic callus （FEC）；Protoplast；Regeneration

木薯（Manihot esculenta Crantz）別名樹薯，屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）多年生灌木，常作為一年生作物栽培，因其塊根富含淀粉，被譽(yù)為“淀粉之王”。木薯在熱帶、亞熱帶地區(qū)是重要的糧食作物，還是生產(chǎn)淀粉、變性淀粉、酒精、葡萄糖等工業(yè)產(chǎn)品的重要原料，被用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織、造紙等多種行業(yè)，其塊根、嫩莖、枝葉也常用作飼料。

木薯遺傳背景復(fù)雜，具有基因型高度雜合、花粉育性低、種子萌發(fā)率低和有性子代性狀嚴(yán)重分離[1-2]的特性，使其傳統(tǒng)育種受到一定限制。生物技術(shù)育種是傳統(tǒng)育種方法的一種補(bǔ)充手段。隨著細(xì)胞工程和基因工程的發(fā)展，生物技術(shù)育種要求一種高效的再生體系。木薯的組織培養(yǎng)技術(shù)起步較晚，但在國際熱帶農(nóng)業(yè)中心（International Center for Tropical Agriculture，CIAT）得到發(fā)展，主要用于脫毒、無性繁殖、種質(zhì)收集保存和種質(zhì)交換。木薯種子顯示了高度的基因多樣性，有性繁殖會(huì)導(dǎo)致基因嚴(yán)重分離，因此作為無性繁殖作物，從特定的組織再生植株顯得尤為重要。木薯科研工作者也一直在朝著這個(gè)方向努力。目前，木薯已經(jīng)建立的再生體系主要有器官發(fā)生途徑、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑、脆性胚性愈傷（FEC）再生和原生質(zhì)體再生4種。筆者對(duì)木薯現(xiàn)有的4種再生體系發(fā)展與建立進(jìn)行了總結(jié)與歸納，以期為木薯組織培養(yǎng)和基于木薯再生體系的技術(shù)進(jìn)步提供一些參考。

1器官發(fā)生途徑

1974年，Kartha等[3]首次對(duì)木薯的頂端分生組織進(jìn)行了培養(yǎng)，獲得5個(gè)品種的完整植株。1994年，Konan等[1]用高濃度的細(xì)胞分裂素6-BA（10 mg/L）培養(yǎng)木薯腋芽，形成了致密的類似球莖的結(jié)構(gòu)，然后轉(zhuǎn)移到低濃度的6-BA培養(yǎng)基上，能形成多莖結(jié)構(gòu)，再生了植株。

在建立體細(xì)胞胚發(fā)生的基礎(chǔ)上，初生胚胎、次生胚胎以及循環(huán)胚胎形成的子葉都可在含1.0 mg/L 6-BA 和 0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中經(jīng)器官發(fā)生再生植株[4]。初生胚胎的子葉器官發(fā)生的能力較低，循環(huán)胚胎子葉器官發(fā)生能力最高[5]。木薯器官發(fā)生途徑可來源于腋芽、莖尖、嫩葉以及初生胚、次生胚、循環(huán)胚的子葉等外植體。

2體細(xì)胞胚發(fā)生途徑

2.1體細(xì)胞胚發(fā)生的發(fā)展

自1982年Stamp等[6]首次報(bào)道以木薯合子胚的胚軸和子葉為外植體成功誘導(dǎo)出胚狀體以來，該方法現(xiàn)已得到普遍發(fā)展。從最初的2步：①在包含2，4-D的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎；②將誘導(dǎo)的胚狀體轉(zhuǎn)到含2，4-D、6-BA、含或不含GA的培養(yǎng)基中發(fā)展莖，之后再生根[7-8]，細(xì)化到現(xiàn)在的4步：①在包含2，4-D等生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎；②在含低濃度6-BA的培養(yǎng)基中成熟或萌發(fā)；③在含高濃度6-BA的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，發(fā)展成莖；④在含低濃度NAA或不含激素的培養(yǎng)基中生根[9-11]。循環(huán)①、②步，能產(chǎn)生次生胚胎和循環(huán)胚胎，形成循環(huán)的體細(xì)胞胚發(fā)生體系，循環(huán)的胚胎外植體誘導(dǎo)胚胎更顯著[9，11]。此后的相關(guān)體細(xì)胞胚發(fā)生研究也大多在此基礎(chǔ)上，根據(jù)基因型、外植體類型及激素類型等不同因素進(jìn)行了優(yōu)化。所用外植體也從最開始的合子胚的胚軸和子葉發(fā)展到莖尖、嫩葉、腋芽、花組織以及初生胚、次生胚、循環(huán)胚的子葉。

2.2植物激素對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

植物激素在木薯體細(xì)胞胚發(fā)生中有重要作用。2，4-D、Picloram和NAA常作為誘導(dǎo)木薯體細(xì)胞胚發(fā)生的激素，但根據(jù)木薯品種、外植體類型的不同，誘導(dǎo)的能力也有所不同。2，4-D濃度在 1～8 mg/L范圍內(nèi)增加時(shí)，體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率顯著增加；當(dāng)濃度在 8～16 mg/L時(shí)，胚胎誘導(dǎo)率是相似的[8]。研究顯示，在某些基因型中，誘導(dǎo)初生胚胎，Picloram比2，4-D效果更好[12-13]。起初的研究認(rèn)為NAA沒有誘導(dǎo)初生胚胎的能力，但有誘導(dǎo)次生胚胎的能力[14]。馬國華等[15]研究顯示，采用高濃度的NAA，能成功地直接誘導(dǎo)初生體細(xì)胞胚發(fā)生和芽的形成。后來的研究也證實(shí)了這一結(jié)果[16]。盡管研究的激素較多，但目前常采用12 mg/L 的Picloram誘導(dǎo)常規(guī)木薯的體細(xì)胞胚發(fā)生。

有研究認(rèn)為在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)早期，生長(zhǎng)素起關(guān)鍵作用，而6-BA有抑制作用，一旦胚胎形成后，生長(zhǎng)素抑制莖結(jié)構(gòu)形成，而6-BA促進(jìn)莖結(jié)構(gòu)形成。同時(shí)認(rèn)為，改變生長(zhǎng)激素能調(diào)控木薯經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑或器官發(fā)生途徑再生。外植體在含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一旦胚性細(xì)胞團(tuán)被誘導(dǎo)，若繼續(xù)在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則向體細(xì)胞胚發(fā)生途徑發(fā)展，若轉(zhuǎn)入含6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則向器官發(fā)生途徑發(fā)展，而誘導(dǎo)時(shí)間決定了胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)。在含生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，越多的胚性細(xì)胞團(tuán)發(fā)展成胚胎，也越難改變?cè)偕窂絒17]。

3脆性胚性愈傷組織（FEC）誘導(dǎo)與再生

在植物中，F(xiàn)EC已經(jīng)得到發(fā)展，合子胚通常是用于誘導(dǎo)的首選外植體材料[18]。在木薯中，合子胚基因型嚴(yán)重分離，不清楚基因型來源，不適合作為外植體，如同體細(xì)胞胚發(fā)生一樣。

Taylor等[19]描述FEC發(fā)生于嫩葉誘導(dǎo)初生胚胎，經(jīng)次生胚胎或循環(huán)胚胎發(fā)生，將高質(zhì)量的胚性組織在含Picloram的GD培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)，產(chǎn)生一種由數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的直徑約1 mm的細(xì)小細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，即脆性胚性愈傷組織。這種結(jié)構(gòu)新陳代謝快，分離出來后，在SH液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)可迅速擴(kuò)增。嫩葉誘導(dǎo)初生胚胎的胚性組織質(zhì)量不高，次生胚胎或循環(huán)胚胎培養(yǎng)產(chǎn)生的胚性組織質(zhì)量較高。

FEC的誘導(dǎo)仍存在基因型限制。Taylor等[20]在20個(gè)木薯供試品種中，成功誘導(dǎo)了14個(gè)品種的FEC，并且FEC產(chǎn)生的時(shí)間和植株的再生效率存在很大差異。Raemakers等[21]報(bào)道，供試的10個(gè)木薯基因型中只有6個(gè)獲得了FEC，每個(gè)基因型的FEC都能再生植株，但再生的效率不同。方佳敏等[22]對(duì)11個(gè)主栽木薯品種進(jìn)行誘導(dǎo)FEC，經(jīng)多次重復(fù)的誘導(dǎo)與條件優(yōu)化，結(jié)果表明只有4個(gè)木薯品種在GD培養(yǎng)基上多次繼代培養(yǎng)后，可獲得FEC。盡管木薯的FEC難誘導(dǎo)，但一旦誘導(dǎo)了FEC，均能再生成植株。FEC的再生過程與體細(xì)胞胚發(fā)生再生過程類似，除起始材料不同外，都經(jīng)過誘導(dǎo)胚胎出現(xiàn)、胚胎成熟、莖伸長(zhǎng)、生根4個(gè)階段。

4原生質(zhì)體培養(yǎng)與再生

4.1葉肉原生質(zhì)體的培養(yǎng)與再生

木薯葉片分離原生質(zhì)體再生植株僅有1例成功的報(bào)道[23]，其他學(xué)者不能重復(fù)這個(gè)過程[24-25]。Anthony等[24]采用組培苗的葉片分離原生質(zhì)體，用固（B5培養(yǎng)基）液（無銨MS培養(yǎng)基）雙層法培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中均勻垂直地插入短玻璃棒，對(duì)照不插玻璃棒，其他均相同，結(jié)果原生質(zhì)體只在插玻璃棒的培養(yǎng)基中持續(xù)分裂，形成肉眼可見的愈傷，但仍沒有再生植株。此后再未見木薯葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道，后人一般認(rèn)為木薯葉肉原生質(zhì)體不能再生植株。

4.2胚性愈傷組織原生質(zhì)體的培養(yǎng)與再生

20世紀(jì)90年代，木薯原生質(zhì)體再生研究取得了突破性的進(jìn)展。在建立FEC及其懸浮系的基礎(chǔ)上[19]，展開了木薯品種TMS60444原生質(zhì)體分離、純化及培養(yǎng)研究，并再生了植株，然而再生效率低，主要是由于原生質(zhì)體起源的愈傷組織分化體細(xì)胞胚的效率低，并且成熟胚萌發(fā)效率也低造成的，這成為木薯原生質(zhì)體再生植株的瓶頸[25]。2012 年，筆者根據(jù)前人[25]的研究基礎(chǔ)，分離木薯品種TMS60444的FEC懸浮系原生質(zhì)體并培養(yǎng)，在胚狀體發(fā)生過程中采用MSN培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)前人提及的瓶頸問題有所改進(jìn)，原生質(zhì)體再生效率有較大提高，建立了相對(duì)完整有效的木薯脆性愈傷原生質(zhì)體再生體系[26]。目前原生質(zhì)體再生成功的經(jīng)驗(yàn)是先誘導(dǎo)胚性愈傷組織，再建立胚性懸浮系，利用胚性懸浮系分離原生質(zhì)體，這樣分離的原生質(zhì)體容易再生。該方法已在水稻[27]、玉米[28]、甘蔗[29]、小麥[30]等多種作物的原生質(zhì)體再生過程中成功應(yīng)用。

5結(jié)語

木薯是一種主要糧食作物，對(duì)其再生體系的研究落后于水稻、小麥等糧食作物。直到20世紀(jì)90年代木薯的再生體系研究才得到了充分發(fā)展，從器官發(fā)生、體細(xì)胞胚發(fā)生、FEC再生，再到原生質(zhì)體再生，都有了新的突破。當(dāng)時(shí)木薯的體細(xì)胞胚發(fā)生是一個(gè)研究熱點(diǎn)，無論是品種、外植體類型，還是激素影響的研究都非常多[7-17]。這些促使了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步，為木薯遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

目前木薯再生體系的應(yīng)用除種質(zhì)保存、無性繁殖外，主要應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化。子葉和FEC常作為遺傳轉(zhuǎn)化的起始材料。木薯遺傳轉(zhuǎn)化有2種方式：一種是利用體細(xì)胞胚發(fā)生得到的子葉，經(jīng)過器官發(fā)生得到轉(zhuǎn)基因植株；另一種是利用FEC再生得到轉(zhuǎn)基因植株。器官發(fā)生應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化研究，其優(yōu)點(diǎn)是基因型不受限制，再生時(shí)間短，簡(jiǎn)單、易操作，缺點(diǎn)是再生效率低，有假陽性和嵌合現(xiàn)象。FEC是很多基礎(chǔ)研究的重要起始材料，是木薯高效遺傳轉(zhuǎn)化的最合適材料[31]。FEC再生應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化研究，其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高，可以得到較多的轉(zhuǎn)基因植株，缺點(diǎn)是受基因型限制，有嵌合現(xiàn)象，F(xiàn)EC在繼代保存及再生過程中可能發(fā)生體細(xì)胞變異。目前遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道大多是模式品種TMS60444、M.Col 22，轉(zhuǎn)換到栽培種中還需要優(yōu)化。木薯原生質(zhì)體再生，其操作過程繁瑣，技術(shù)要求較高，再生成功的報(bào)道少。若在原生質(zhì)體再生的基礎(chǔ)上原生質(zhì)體融合及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等研究成功，將為木薯育種提供一條新途徑。

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年