復(fù)合酶法提取菊芋菊糖的工藝優(yōu)化

江玉婷 陳靖超 李程程 劉麗萍 汪自慧 杭華

摘要[目的]優(yōu)化復(fù)合酶提取菊芋菊糖的工藝。[方法]探討料液比、pH、溫度、復(fù)合酶等對菊芋菊糖提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析方法，對其操作參數(shù)進行優(yōu)化，獲得最佳的工藝條件。[結(jié)果]菊芋菊糖提取的最佳工藝條件：料液比1∶20（g∶mL），pH 6.0，酶解溫度 54 ℃，復(fù)合酶（m木瓜蛋白酶∶m果膠酶=1∶8）131 μg/g樣品，提取時間40 min；在此條件下，菊芋菊糖提取率為73.30%。[結(jié)論]該研究可為菊芋菊糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞菊芋；菊糖；復(fù)合酶法；響應(yīng)面優(yōu)化；提取

中圖分類號S632.9；R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0098-05

Optimization of Complex Enzymatic Extraction Technology of Inulin from Jerusalem artichoke

JIANG Yuting， CHEN Jingchao， LI Chengcheng， HANG Hua* et al（Anhui Normal University， Wuhu， Anhui 241002）

Abstract[Objective] To optimize the complex enzymes extraction of inulin from Jerusalem artichoke. [Method] The effects of solidliquid ratio， pH， temperature， enzyme contents on the yield of inulin were explored. On the basis of this， the response surface methodology was adopted to optimize operation parameters and obtain the best extraction conditions. [Result] The results showed that the optimum conditions were the radio of materialtoliquid of 1∶20 （g∶mL）， pH 6.0， temperature of 54 ℃， compound enzymes（mpapain∶mpectinase=1∶8） with enzyme sample of 131 μg/g and extraction time of 40 mins. Under the optimum conditions， the inulin yield could obtain about 73.30%. [Conclusion] The study will provide the thesis basis for further industrial production.

Key wordsJerusalem artichoke；Inulin；Compound enzymatic method；Response surface analysis； Extraction

菊芋（Jerusalem artichoke）別名洋姜、鬼子姜，屬于菊科向日葵屬，是一種多年生宿根性的草本植物[1]。新鮮菊芋塊莖質(zhì)地細(xì)致、微甜脆嫩，具有去濕、益胃、清熱解毒的功效，是一種可防治糖尿病和肥胖癥的保健食品原料[2]。菊芋塊根中含有的植物多糖——菊糖可溶于熱水成為膠體溶液，酶能水解菊糖生成單糖。

菊糖是一種天然的碳水化合物，具有甜味但不被人體消化吸收，其是由呋喃構(gòu)型的D-果糖通過β-（2，1）糖苷鍵聚合形成的果聚糖混合物，聚合度（DP）為2～60，分子量為3 500～5 500 D[3]。菊糖可作為腸道雙歧桿菌的增殖因子，能改善腸道功能[4]，提高人體抗病力并且能有效降低體內(nèi)致癌化合物含量[5]。菊糖因具有非胰島素依賴性，攝入人體后血糖含量不會升高，非常適合添加于糖尿病人的食品中[6-7]。因此，近年來有關(guān)菊芋菊糖提取和應(yīng)用的研究受到了廣泛的關(guān)注。

目前，菊糖主要是從菊芋中提取得到[8]。菊糖的提取方法主要有水浴浸提法[9]、微波輔助水浴浸提法[10]、超聲波輔助水浴浸提法[11]。復(fù)合酶法與傳統(tǒng)的水浴浸提法相比有提取條件溫和、節(jié)約能源、污染小、操作簡便等優(yōu)點，具有較好的應(yīng)用前景。然而，目前關(guān)于復(fù)合酶輔助提取菊芋菊糖的研究相對較少。筆者采用復(fù)合酶輔助水浴浸提法提取菊芋菊糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進行工藝參數(shù)優(yōu)化，為從菊芋中提取菊糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試藥材。新鮮菊芋，購于安徽蕪湖，經(jīng)干燥后粉碎備用。

1.1.2主要試劑。果膠酶（酶活力100 000 U/g），木瓜蛋白酶（酶活力800 000 U/g）；蒽酮、硫脲、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、濃硫酸、氫氧化鈉、丙三醇及其他試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器。DHG-9101-3S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，金壇市杰瑞爾電器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；SHZ-D（Ш）型循環(huán)水式真空泵，南京科爾儀器設(shè)備有限公司；756型紫外可見分光光度計，北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司；PHS-3C 型pH計，上海雷磁儀器廠；80目篩，北京祥宇偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1菊芋菊糖的提取工藝流程。菊芋→切片→干燥→粉碎→過篩→稱量樣品→復(fù)合酶提取→90 ℃滅酶10 min→過濾→保留上清液（提取液）。

1.2.2可溶性總糖含量的測定。采用蒽酮比色法在波長為620 nm處測定吸光值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程y=0.113 2 x+0.002，R2=0.995 4），求出總糖質(zhì)量，按下述公式計算菊芋中可溶性總糖含量。

可溶性總糖含量（%）=C×V總×DW×V測×106×100%

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的糖含量（μg）；V總為提取液的總體積（mL）；V測為測定時使用液體體積（mL）；D為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3還原糖含量的測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用DNS比色法在波長為540 nm處測定吸光值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程y=6.784 9x+0.086，R2=0.999 3），計算出還原糖質(zhì)量，按下述公式計算出菊芋中還原糖的含量。

還原糖含量（%）=m還原糖質(zhì)量m樣品×100%

1.2.4復(fù)合酶比例的篩選。使用分析天平稱取木瓜蛋白酶和果膠酶，按照質(zhì)量比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12制成0.1 mg/mL的復(fù)合酶酶解液，取上清液存放于冰箱中。稱取多份1.000 0 g樣品，加入2 mL上述酶解液后，再加入2 mL蒸餾水，在溫度55 ℃的條件下浸提50 min，根據(jù)下述公式計算菊糖的提取率。

菊糖得率（%）=m總糖-m還原糖m樣品×100%

1.2.5單因素試驗。

1.2.5.1料液比對菊糖提取率的影響。在復(fù)合酶為80 μg/g、pH 5.5、溫度50 ℃和提取時間40 min條件下，選擇料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）進行試驗，探究料液比對菊芋中菊糖提取率的影響。

1.2.5.2pH對菊糖提取率的影響。在復(fù)合酶為80 μg/g、料液比為1∶20、溫度50 ℃和提取時間40 min條件下，選擇pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0進行試驗，探究pH對菊芋中菊糖提取率的影響。

1.2.5.3溫度對菊糖提取率的影響。在復(fù)合酶為80 μg/g、料液比為1∶20、pH 6.0和提取時間40 min條件下，選擇溫度分別為45、50、55、60、65 ℃進行試驗，探究溫度對菊芋中菊糖提取率的影響。

1.2.5.4復(fù)合酶對菊糖提取率的影響。在溫度55 ℃、料液比為1∶20、pH 6.0和提取時間40 min條件下，選擇復(fù)合酶分別為0、40、80、120、160 μg/g進行試驗，探究復(fù)合酶對菊芋中菊糖提取率的影響。

1.2.5.5提取時間對菊糖提取率影響。在溫度55 ℃、料液比為1∶20、pH 6.0和復(fù)合酶為80 μg/g條件下，選擇提取時間分別為30、40、50、60、70 min進行試驗，探究提取時間對菊芋中菊糖提取率的影響。

1.2.6響應(yīng)面試驗設(shè)計。由于溫度和pH對酶活性影響很大，會對菊芋中菊糖的提取率產(chǎn)生直接影響。結(jié)合單因素試驗的結(jié)果，以溫度、復(fù)合酶用量和pH 3個因素為自變量，采用BoxBehnken中心組合試驗，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合酶比例篩選

可以看出，當(dāng)木瓜蛋白酶∶纖維素酶質(zhì)量比為1∶8時，菊糖的提取率最高。當(dāng)質(zhì)量比為1∶10和1∶12時，菊糖的提取率降低，原因可能是當(dāng)果膠酶的濃度升高到一定數(shù)值時，使得復(fù)合酶的酶活性下降[12]，對菊芋細(xì)胞壁的破壞力降低，導(dǎo)致菊糖的提取率降低。因此，復(fù)合酶（木瓜蛋白酶∶纖維素酶）質(zhì)量比應(yīng)為1∶8。

圖1復(fù)合酶酶解效果比較

Fig.1Comparison of the effects of complex enzymatic hydrolysis

2.2單因素試驗

2.2.1料液比。從圖2可知，隨著料液比中溶劑用量的增加，菊糖的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時，菊糖的提取率最高。原因是料液比中溶劑用量增加，溶液中的底物濃度和復(fù)合酶的濃度因此下降，有效反應(yīng)碰撞減少。

2.2.2pH。從圖3可知，當(dāng)pH 6.0時，菊糖的提取率最高；當(dāng)pH<6.0時，隨著pH的升高，菊糖的提取率也隨之增加；當(dāng)pH>6.0時，隨著pH的升高，菊芋中菊糖的提取率隨之下降。原因是pH 6.0時，可能是復(fù)合酶的最適pH，酶在最適 pH 范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適 pH，都會通過改變底物和酶的帶點狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合[13]。pH超過一定范圍會影響酶的穩(wěn)定性，過高過低都會使酶受到不可逆?zhèn)Α?/p>

2.2.3溫度。從圖4可知，當(dāng)溫度低于55 ℃時，菊糖的提取率隨溫度的升高而上升；在溫度為55 ℃時，菊糖的提取率達(dá)到最大；當(dāng)溫度高于55 ℃時，菊糖的提取率隨溫度的升高而下降。原因是溫度上升，反應(yīng)物的活化能增加，使酶解速度變快，而當(dāng)超過最適溫度后，反應(yīng)速率會顯著下降，這是由于溫度過高使蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致其活性降低甚至失活，反應(yīng)速率也會隨著溫度升高而下降。當(dāng)溫度過高時可能會使酶失去活性，最后提取得到的菊糖完全是水浴浸提法得到的，與酶解無關(guān)。

2.2.4復(fù)合酶用量。從圖5可知，當(dāng)復(fù)合酶的添加量增加時，菊糖提取率會上升。當(dāng)復(fù)合酶的添加量達(dá)到120 μg/g后，菊糖提取率的增加幅度會顯著減少。原因是添加復(fù)合酶的量達(dá)到飽和，此后，增加酶的添加量，菊糖提取率會下降?？紤]實際生產(chǎn)中的成本問題，復(fù)合酶的最佳添加量為120 μg/g。

2.2.5提取時間。從圖6可知，水浴浸提時間為40 min時，菊糖提取率達(dá)到最大；當(dāng)水浴浸提時間小于40 min時，隨著提取時間的增加，菊糖提取率增大；當(dāng)水浴浸提時間大于40 min時，菊糖的提取率變化幅度不大。原因可能是水浴浸提時間較短，導(dǎo)致反應(yīng)時間不夠，酶解的程度不夠充分，而當(dāng)復(fù)合酶濃度達(dá)一定量，酶促反應(yīng)時間的增加并不能顯著增加菊糖的提取率。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果。

采用DesignExpert V8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以菊糖提取率為響應(yīng)值，利用BoxBehnken 響應(yīng)面法設(shè)計3因素3水平試驗，共17個試驗點，其中12個析因點，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點； 5個零點為區(qū)域的中心點，用來估量試驗的誤差。 菊糖提取率見表2。

2.3.2模型的建立及其顯著性檢驗。

采用DesignExpert.V8.0.6軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到菊糖提取率和溫度（A）、復(fù)合酶（B）、pH（C）的二次多項回歸模型為：菊糖提取用顯著的是A、C，極顯著的是B、A2、B2、C2?？梢?，各因素對菊芋中菊糖提取率的影響并不是單純的線性關(guān)系。

對回歸模型進行方差分析顯示，該回歸模型的P<0.000 1，表明回歸方程模型極顯著；失擬項P=0.190 1>0.05，表示失擬不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.992 3，說明該模型能夠解釋99.23%響應(yīng)值的變化，即該數(shù)學(xué)模型與實際試驗擬合程度良好，試驗誤差小，用該模型分析和預(yù)測菊芋中菊糖的提取是合適的。

2.3.3響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化。為確定溫度、復(fù)合酶、pH這3個因素及其交互作用對菊芋中菊糖提取率的影響， 根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線圖。響應(yīng)面越陡峭，各因素之間的交互作用越強烈；響應(yīng)面越平緩，各因素之間的交互作用越弱。等高線的形狀呈現(xiàn)為橢圓形，則表明兩因素之間的交互作用較大，若等高線的形狀呈現(xiàn)為圓形，則表明兩因素之間的交互作用較小。各兩因素之間的交互作用響應(yīng)面和等高線見圖7～9。

可見，溫度和復(fù)合酶用量的相互關(guān)系顯著。在低溫區(qū)，提取時間對菊芋中菊糖提取率影響較明顯。最初菊糖的提取率會隨溫度升高而升高，而后提取溫度的升高反而會導(dǎo)致菊糖提取率的下降。由圖8可見，溫度和pH相互關(guān)系不十分顯著，菊糖提取率隨溫度的升高和pH的增大都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。由圖9可見，復(fù)合酶用量和pH相互關(guān)系十分不顯著，菊糖提取率隨復(fù)合酶用量的增加而增加，只是起初升高較快，隨后比較緩慢，直至逐漸趨于平緩。隨著pH的加大菊糖提取率的趨勢為先上升后下降。

2.3.4最佳工藝條件確定和回歸模型的驗證試驗。

應(yīng)用DesignExpert V8.0.6軟件，采用BoxBehnken建立了溫度（A）、復(fù)合酶用量（B）、pH（C）與菊糖提取率之間的數(shù)學(xué)模型，即菊糖提取率=72.60-1.78A+6.57B+1.79C-7.15A2-11.19B2-5.08C2。 回歸分析表明，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，回歸模型極顯著，擬合程度好，有實際應(yīng)用意義。 通過顯著性檢驗，各因素的影響排序從大到小依次復(fù)合酶用量（B）、pH（C）、溫度（A）。當(dāng)響應(yīng)面值最大時，A、B、C對應(yīng)的編碼值分別為-0.120、0.296、0.197，與之對應(yīng)的菊芋菊糖的復(fù)合酶輔助提取最佳工藝條件為溫度54.40 ℃ ，復(fù)合酶用量131.84 μg/g，pH 6.1。此時，菊芋中菊糖的理論提取率達(dá) 73.86%。為檢驗響應(yīng)面的可靠性，使用最優(yōu)提取工藝條件做菊芋菊糖的復(fù)合酶輔助提取菊糖的驗證試驗。 同時考慮到實際操作中的局限性， 將工藝參數(shù)修正為復(fù)合酶用量131 μg/g，溫度54 ℃，pH 6.0，在此修正條件下做3次平行驗證試驗，測得菊糖提取率分別為73.29%、73.36%、73.34%，平均菊糖提取率為73.30%，與理論預(yù)測值73.86%基本吻合， 說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，可為進一步大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

3結(jié)論

該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過BoxBehnken 中心組合設(shè)計以及響應(yīng)曲面分析法對菊糖的提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為料液比1∶20（g∶mL）、pH 6.0、溫度 54 ℃、復(fù)合酶（m木瓜蛋白酶∶m果膠酶=1∶8） 用量131 μg/g、

時間 40 min，在此條件下，菊糖得率為 73.30%。

該試驗采用木瓜蛋白酶和果膠酶的復(fù)合酶對菊芋浸提液進行處理，能夠有效地對菊芋細(xì)胞進行破壁，使糖類物質(zhì)易于溶出，提高了菊芋中菊糖的溶出速度，從而減少了提取時間。對比傳統(tǒng)方法[14]，該方法使菊糖提取率提高，并且顯著降低了提取時間和溫度，還可以降低能耗，具有工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用前景。該試驗采用游離復(fù)合酶對菊芋菊糖進行浸提，若采用固定化酶可使復(fù)合酶反復(fù)利用，對降低復(fù)合酶的應(yīng)用成本更為有利。

參考文獻(xiàn)

[1]

孔濤，吳祥云.菊芋中菊糖提取及果糖制備研究進展[J].食品工業(yè)科技，2013，34（18）：375-378，382.

[2] LIU Z X，HAN L P，YOSEF S，et al.Genetic variation and yield performance of Jerusalem artichoke germplasm collected in China[J].Agricultural sciences in China，2011，10（5）：668-678.

[3] 殷洪，林學(xué)進.菊粉、低聚果糖的研究進展[J].中國食品添加劑，2008（3）：97-101.

[4] 侯東軍，曾凡坤.菊粉低聚糖生產(chǎn)的研究進展[J].廣州食品工業(yè)科技，2002，19（1）：41-43.

[5] ROCHA J R，CATANA R，F(xiàn)ERREIRA B S，et al.Design and characterisation of an enzyme system for inulin hydrolysis[J].Food chemistry，2006，95（1）：77-82.

[6] 范三紅，李靜，王亞云，等.超聲波輔助復(fù)合酶提取菊糖工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2015，36（4）：23-28.

[7] 熊政委，董全.菊糖的生理功能和在食品中應(yīng)用的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（20）：351-354.

[8] 李雪雁，陳曉前，王玉麗.果膠酶浸提菊芋菊糖的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（11）：223-225.

[9] 姜少娟.菊芋菊糖的提取研究[J].廣州化工，2012，40（23）：82-84.

[10] 賈若凌.微波法提取菊芋中菊糖的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（23）：11568-11570.

[11] 羅登林，袁海麗，曾小宇，等.超聲強化提取菊芋中菊糖的研究[J].中國食品添加劑，2010（5）：107-112.

[12] VILKHU K，MAWSON R，SIMONS L，et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry：A review[J].Innovative food science and emerging technologies，2008，9（2）：161-169.

[13] 趙玉紅，趙小旭，姜曉青.超聲波-雙酶法協(xié)同提取林蛙皮多糖的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2012，33（11）：230-234.

[14] 張澤生，張建平，王浩，等.菊芋菊糖的超聲波提取、純化及HPLC法純度檢測[J].食品工業(yè)科技，2009，30（6）：260-262.