山黃皮果實(shí)和葉片揮發(fā)油成分分析

覃振師　賀鵬　王文林　張濤　宋海云　譚秋錦　湯秀華　許鵬　黃錫云　鄭樹芳　何銑揚(yáng)　陳海生

摘要：[目的]考察山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)（含果肉和果皮）和葉片揮發(fā)油化學(xué)成分差異，以挖掘山黃皮桂研15號(hào)的利用價(jià)值，為山黃皮資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。[方法]采用水蒸汽蒸餾法提取山黃皮果實(shí)和葉片揮發(fā)油，通過氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)山黃皮不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析；通過NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫分別鑒定各化學(xué)組分；經(jīng)面積歸一化法測(cè)定山黃皮不同部位揮發(fā)油中化學(xué)成分的相對(duì)含量。[結(jié)果]從山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類28種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳?xì)浠衔镱?種、醚類5種。從山黃皮果肉、果皮及葉片揮發(fā)油中分別鑒定出20、31和34種化合物，其相對(duì)含量占各自揮發(fā)油總量的76.97%、95.11%和83.85%。山黃皮果肉、果皮及葉片揮發(fā)油的主要成分分別為單萜類化合物β-蒎烯、月桂烯和萜品油烯。因此，山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)和葉片揮發(fā)油化學(xué)成分以萜烯類化合物（主要是單萜類化合物）和醚類化合物為主。[結(jié)論]山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)和葉片揮發(fā)油化學(xué)成分成分種類和含量存在明顯差異，且有獨(dú)特的揮發(fā)油成分。綜合成本因素，山黃皮桂研15號(hào)葉片揮發(fā)油具有更大的開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：山黃皮；果實(shí)；葉片；化學(xué)成分；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜法

0引言

[研究意義]山黃皮[Clausena anisum-olena（Blauco）Merr.]為蕓香科（Rutaceae）黃皮屬（Clausena）常綠多年生小喬木或大灌木，俗稱雞皮果，主要分布于我國廣西、云南和廣東等地，越南及菲律賓也有分布（黃峰等，2005）。山黃皮的果實(shí)味酸可口，香氣怡人，富含門冬氨酸、Y-氨基丁酸、丙氨酸等氨基酸（楊益林和黃艷，2011），具有助食消暑、祛痰化氣、消積消滯、疏通腸胃等功效，其葉可人藥，有引氣、健胃、止痛、消風(fēng)腫、去疳積等功能。山黃皮揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌及枯草桿菌等有抑制作用（蘇秀芳等，2011a，2011b）。研究山黃皮果肉、果皮和葉片揮發(fā)油成分及其相對(duì)含量差異，對(duì)有效開發(fā)利用山黃皮具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]隨著人們對(duì)天然、綠色產(chǎn)品需求的日益增加，山黃皮產(chǎn)品市場(chǎng)空間越來越寬廣，有關(guān)其天然產(chǎn)物活性成分的研究逐漸成為熱點(diǎn)。Wang等（2008a，2008b，2009a，2009b，2010）運(yùn)用植物化學(xué)手段，從山黃皮地上脂溶性部分中分離鑒定出1種新環(huán)八肽Clausenain B和7種新的單萜類香豆素。余燾等（2009）對(duì)廣西崇左中越邊境山黃皮葉片進(jìn)行水蒸汽蒸餾，經(jīng)GC-MS分析鑒定出山黃皮葉片揮發(fā)油中主要成分為（+）-4-蒈烯（45.67%）、2-甲基-2，6-叔丁基苯酚（40.84%）等。梁立娟等（2011）運(yùn)用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)水蒸汽蒸餾法提取的桂研20號(hào)果實(shí)揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，鑒定出其主要成分為（+）-4-蒈烯、肉豆蔻醚、異松油烯和（+）-檸檬烯等。蘇秀芳等（2011a）對(duì)廣西民族師范學(xué)院龍州校區(qū)院內(nèi)景觀用品種山黃皮果仁以水蒸汽蒸餾，經(jīng)GC-MS分析鑒定出其揮發(fā)油主要成分為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亞甲二氧基苯（47.07%）等，且揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。蘇秀芳和梁振益（2011）對(duì)廣西扶綏縣野生品種山黃皮莖、根、葉、果實(shí)及花以水蒸汽蒸餾，經(jīng)GC-MS分析鑒定出其共有的主要成分為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二嗯茂，在果實(shí)中含量為58.40%。Thaia等（2014）對(duì)越南諒山市山黃皮果實(shí)和葉片以水蒸汽蒸餾，經(jīng)GC-MS分析鑒定出山黃皮果實(shí)和葉片揮發(fā)油中主要成分萜品油烯等占總峰面積的53%以上。You等（2015）研究發(fā)現(xiàn)山黃皮葉片揮發(fā)油中主要成分是肉豆蔻醚、萜品油烯、2-（4-甲基苯基）丙2-醇、3一蒈烯，其對(duì)常見糧倉害蟲煙草甲蟲（Lasioderma serricorne）和嗜卷書虱（Lipo scelis bostrychophila）成蟲具有較強(qiáng)排斥性。[本研究切入點(diǎn)]前人對(duì)山黃皮不同部位揮發(fā)油成分的研究主要集中在種植面積相對(duì)較少的景觀型及野生型品種上，目前有關(guān)主栽品種如山黃皮桂研15號(hào)等的揮發(fā)油成分分析研究報(bào)道較少。[擬解決的關(guān)鍵問題]采用GC-MS分析山黃皮桂研15號(hào)的果肉、果皮及葉片揮發(fā)油成分，為開發(fā)山黃皮資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，以期開發(fā)出山黃皮系列產(chǎn)品，延長產(chǎn)業(yè)鏈，提高果農(nóng)收入。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的山黃皮品種桂研15號(hào)為材料。選取5株長勢(shì)、樹形相似的成年結(jié)果果樹，從每株果樹樹冠的東、西、南、北4個(gè)方向采摘處于同一成熟度的成熟果實(shí)5個(gè)、顏色相近的葉片10片，各自混合帶回實(shí)驗(yàn)室，置于20℃冰箱冷藏。主要儀器設(shè)備：GC-MS（美國Thermo Electron FinniganTrace DSQ公司）、電子天平（型號(hào)BTl24S，賽多利斯公司）。試劑：NaCl、無水硫酸鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠）、超純水（自制）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1預(yù)處理 將成熟期山黃皮果實(shí)的果肉與果皮分離，果肉均勻漿，果皮和葉片均切成0.5 cm×0.5cm的小塊，搗碎。

1.2.2蒸餾提取方法 準(zhǔn)確稱量樣品150.0 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，加入0.6%NaCl溶液，搖勻，冷凝回流。自冷凝管上端加無離子水充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流人燒瓶時(shí)為止。測(cè)定器置電熱套中微沸4 h，停止加熱，靜置片刻，將水緩緩放出，放出香精油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，用適量正已烷溶解，過0.22 m有機(jī)濾膜，用于GC-MS分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 GC-MS分析條件

1.2.3.1色譜條件 DB-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱（30.00 mx0.25 mm，0.25 m）。載氣為高純度氦氣（>99.999%），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃。柱溫采用升溫程序：60℃保持1 min，以5℃/min升溫至280℃，保持10-min。進(jìn)樣量0.5uL，分流比100：1，溶劑延遲1 min，恒流模式進(jìn)樣。

1.2.3.2質(zhì)譜條件 電離方式：EI源，電離能量70eV，離子源溫度203℃，傳輸線溫度280℃。其他參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)調(diào)諧參數(shù)。質(zhì)量掃描范圍：30-600 m/z。

1.2.4檢索方式 儀器自動(dòng)檢測(cè)索，依據(jù)為NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫。對(duì)譜庫中化合物匹配程度（O）低于80（最大值為100）的組分標(biāo)為未鑒定出。采用峰面積歸一法計(jì)算各成分的相對(duì)含量，即計(jì)算各峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行整理及分析。

2結(jié)果與分析

2.1山黃皮果實(shí)和葉片的揮發(fā)油成分組成及其含量分析

由表1和表2可知，從山黃皮果實(shí)和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類28種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳?xì)浠衔镱?種、醚類5種。果肉與果皮共有的化合物有13種，分別是9種萜烯類、1種碳?xì)浠衔镱惡?種醚類。果實(shí)（含果肉和果皮）與葉片共有的化合物有11種，分別為8種萜烯類（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、y-pyronene、1-石竹烯、l-b-紅沒藥烯）和3種醚類（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、欖香素）。由表2可知，山黃皮桂研15號(hào)果肉中鑒定出20種揮發(fā)油成分，占總峰面積的76.97%。其中，萜烯類13種，含量最高，占總峰面積的66.10%；其次為醚類3種，占總峰面積的10.22%；僅存在于果肉揮發(fā)油中的化合物有4種，分別為3，7-二甲基-1，3，7-辛三烯、Germacrene B、壬醛和2，4-二甲基苯乙烯。從果皮中鑒定出31種揮發(fā)油成分，占總峰面積的95.11%。其中，萜烯類19種，含量最高，占總峰面積的78.53%；其次為醚類5種，占總峰面積的15.71%；僅存在于果皮揮發(fā)油中的化合物有13種，分別為Sabenene、皮蠅磷、月桂烯、（+）-香橙烯、b-cis-famesene、Leden、3，7，11，11-tetramethylbicyclo[8.1.0]2，6-u-ecadiene、1-壬醇、Myrtanol、橙花醇、（E）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛、胡椒酮和Perillene。從葉片中鑒定出34種揮發(fā)油成分，占總峰面積的83.85%。其中，萜烯類18種，含量最高，占總峰面積的74.99%；其次為醚類3種，占總峰面積的4.22%；僅存在于葉揮發(fā)油中的化合物有17種，分別為a-ylangene、a-石竹烯、（+）-a-elemene、（-）-b-cadinene、y-欖香烯、苯乙醇、2-己烯醛、（E，E）-2，4-己二烯醛、苯甲醛、反-2，6-壬二醛、對(duì)甲基苯乙酮、2-己烯酸甲酯、水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、4-異丙基甲苯和十八烷。綜上所述，山黃皮不同部位揮發(fā)油成分中的化合物種類及其相對(duì)含量間均存在明顯差異。

2.2山黃皮果實(shí)和葉片揮發(fā)油成分的主要組分及其相對(duì)含量分析

由表1和表2可知，山黃皮不同部位揮發(fā)油成分化合物中醇類、醛類、酮類、酯類和碳?xì)浠衔锛捌湎鄬?duì)含量較少，其主要成分是萜烯類化合物（尤其是單萜類化合物）和醚類化合物。山黃皮果肉揮發(fā)油組分的單萜烯類化合物B-蒎烯（FEMA編號(hào)2903）（表1）相對(duì)含量最高，其次為醚類化合物肉豆蔻醚及萜烯類化合物萜品油烯、3-蒈烯和l-b-紅沒藥烯，其中，單萜類化合物相對(duì)含量總和占62.96%。B-蒎烯因具有多種潛在的生物活性而受到廣泛關(guān)注（廖圣良等，2016），富含B-蒎烯的植物精油具有抗氧化（Kelen and Tepe，2008；Banday，2014）、殺菌（Kelenand Tepe，2008）、消炎（Woguem et a1.，2014）、抗腫瘤（Abdel-Hameed et a1.，2014）等活性，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》批準(zhǔn)其為允許使用的食用香料，編號(hào)S0659，目前主要生產(chǎn)方式是從松節(jié)油中單離出（林翔云，2007）。

山黃皮果皮揮發(fā)油組分的單萜烯類化合物月桂烯相對(duì)含量最高，其次為醚類化合物肉豆蔻醚及萜烯類化合物萜品油烯、l-b-紅沒藥烯、1-石竹烯、3-蒈烯；山黃皮果皮中主要成分為單萜類化合物月桂烯（FEMA編號(hào)2762）（表1），用于番木瓜、芒果、香檸檬、橙及果汁混合甜飲料等香型配制（林翔云，2007），GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將其批準(zhǔn)為允許使用的食用香料，編號(hào)S0653，也可用于合成1-薄荷醇、香茅醛、新鈴蘭醛和龍涎酮等香料（楊陽等，2012）。

山黃皮葉片揮發(fā)油組分的單萜烯類化合物萜品油烯相對(duì)含量最高，其次為醚類化合物地肉豆蔻醚及萜烯類化合物1-石竹烯、a-萜品烯、1-b-紅沒藥烯、B-蒎烯和醛類2-己烯醛。在山黃皮果肉、果皮和葉片揮發(fā)油中相對(duì)含量超過50.00%的萜烯類化合物分別為B-蒎烯（50.22%）、月桂烯（53.33%）和萜品油烯（55.37%），其單萜類化合物相對(duì)含量總和分別占62.96%、70.80%和64.99%，山黃皮葉片中主要成分單萜類化合物萜品油烯（FEMA編號(hào)3046）（表1）具有檸檬氣味，也是生產(chǎn)合成香料的重要原料。

因此，山黃皮揮發(fā)油成分的主要組分為萜烯類化合物（主要是單萜類化合物）和醚類化合物。

3討論

3.1山黃皮果實(shí)和葉片的揮發(fā)油成分比較

本研究從山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類29種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳?xì)浠衔镱?種、醚類5種；從果肉中鑒定出20種揮發(fā)油成分，從果皮中鑒定出31種揮發(fā)油成分，從葉片中鑒定出35種揮發(fā)油成分。果肉、果皮及葉片揮發(fā)油中共有的化合物有11種，分別為8種萜烯類（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、Y-pyronene、1-石竹烯和1-b-紅沒藥烯）和3種醚類（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、欖香素）；而共有的化合物分別占果肉、果皮和葉揮發(fā)油含量的23.36%、37.66%和69.59%。其中，僅存在于果肉揮發(fā)油中的化合物有4種，其相對(duì)含量為1.02%；僅存在于果皮揮發(fā)油中的化合物有13種，其相對(duì)含量為55.75%；僅存在于葉片揮發(fā)油中的化合物有17種，其相對(duì)含量為6.75%。本研究中山黃皮桂研15號(hào)果肉揮發(fā)油成分及其相對(duì)含量與梁立娟等（2011）研究得出的山黃皮桂研20號(hào)揮發(fā)油成分及其相對(duì)含量不同，與蘇秀芳等（2011b）報(bào)道的龍州產(chǎn)山黃皮變種細(xì)葉黃皮果實(shí)果肉揮發(fā)油成分及其相對(duì)含量也不同。梁立娟等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，桂研20號(hào)果實(shí)果肉揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的有肉豆蔻醚（64.85%）、（+）-4-檸檬酸（12.25%）等，其果皮揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的有（+）-4-蒈烯（62.6%）、肉豆蔻醚（20.28%）等；蘇秀芳等（2011b）研究發(fā)現(xiàn)，龍州產(chǎn)山黃皮變種細(xì)葉黃皮果實(shí)果肉揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的有4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亞甲二氧基苯（47.07%）等。本研究結(jié)果與Molino（2000）不同，未鑒定出（E）-茴香腦和甲基胡椒酚；與蘇秀芳和梁振益（2011）報(bào)道的也不同，未分離鑒定出山黃皮變種細(xì)葉黃皮莖、根、葉、果實(shí)及花揮發(fā)油的共有化合物為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二惡茂。在本研究中，桂研15號(hào)的葉片揮發(fā)油組分與余燾等（2009）研究結(jié)果相似，以萜品油烯（53.89%）含量最高，其次為肉豆蔻醚、3-蒈烯、B-月桂烯、（+）-4-蒈烯、芋烯、a-水芹烯、B-紅沒藥烯和a-蒎烯等；鑒定出的化合物以單萜化合物為主，與Thaia等（2014）研究結(jié)果一致。其主要原因是提取的揮發(fā)油是一種混合物，其化學(xué)成分組成和相對(duì)含量受到植物品種、組織部位、生長環(huán)境、提取方法及采樣時(shí)間等因素影響。

3.2山黃皮桂研15號(hào)揮發(fā)油的開發(fā)應(yīng)用前景

本研究中山黃皮果實(shí)和葉片揮發(fā)油成分中共有的化合物相對(duì)含量較高的為醚類化合物肉豆蔻醚，但其具有毒性（陳宏降等，2011）、致幻作用（黃鑫和楊家偉，2007）、抗肝臟脂質(zhì)過氧化作用（zheng et al.，1992）和癌癥預(yù)防作用（Hattori et al.，1993）。果實(shí)和葉片揮發(fā)油化學(xué)成分種類和含量差異明顯，果肉揮發(fā)油成分中B-蒎烯的相對(duì)含量達(dá)50.22%，果皮揮發(fā)油成分中月桂烯相對(duì)含量達(dá)53.33%，葉片揮發(fā)油成分中萜品油烯相對(duì)含量達(dá)55.37%。由此可見，山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)可作為制作香料香精B-蒎烯和月桂烯的原料，葉片可作為制作單離萜品油烯的原料。另外，山黃皮果實(shí)揮發(fā)油主要成分B-蒎烯和月桂烯的基本特征與山黃皮果實(shí)具有令人愉快的、清淡的香脂氣味揮發(fā)油類似，葉片揮發(fā)油主要成分萜品油烯的基本特征與山黃皮葉具有刺激性氣味、同時(shí)兼具檸檬和樹脂揮發(fā)油類似，由此可推斷山黃皮果實(shí)揮發(fā)油主要是B-蒎烯和月桂烯的共同作用結(jié)果，而葉片揮發(fā)油主要是萜品油烯作用的結(jié)果。由于B-蒎烯、月桂烯和萜品油烯在山黃皮桂研15號(hào)不同部位揮發(fā)油中含量比例均較高，可作為香精香料及其原料予以開發(fā)，但綜合成本因素，山黃皮桂研15號(hào)葉片揮發(fā)油具有更大的開發(fā)潛力。

4結(jié)論

山黃皮桂研15號(hào)果實(shí)及其葉片部位揮發(fā)油化學(xué)成分成分種類和相對(duì)含量存在明顯差異，且有獨(dú)特的揮發(fā)油成分。綜合成本因素，山黃皮桂研15號(hào)葉片揮發(fā)油具有更大的開發(fā)潛力。