廣西特色香稻地方品種香味及其香味基因型的鑒定

曾宇　夏秀忠　農(nóng)保選　張宗瓊　楊行海　鄧國(guó)富　劉開強(qiáng)　黃志　李丹婷

摘要：[目的]鑒定廣西地方香稻品種的香味及其香味基因型，為開發(fā)和利用廣西香稻地方種質(zhì)資源及選育優(yōu)質(zhì)特色香稻品種提供理論依據(jù)。[方法]將傳統(tǒng)香味鑒定方法（KOH浸泡法和籽粒咀嚼法）與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，對(duì)179份廣西地方香稻種質(zhì)資源的香味及其香味基因型進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]179份供試材料中，KOH浸泡法檢測(cè)到具有香味的材料167份，籽粒咀嚼法檢測(cè)到具有香味的材料124份。籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中97.58%能用KOH浸泡法鑒定出香味，但KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中僅72.46%能用籽粒咀嚼法鑒定出香味。利用分子標(biāo)記法能檢測(cè)到等位基因的有7l份，占供試材料總數(shù)的39.66%，主要以InDe17和InDel4-5等位基因?yàn)橹?，其中僅1份檢測(cè)到InDel2等位基因，40份檢測(cè)到InDel7等位基因，37份檢測(cè)到InDel4-5等位基因，未檢測(cè)到InDel13等位基因，但有7份同時(shí)檢測(cè)到In-Del7等位基因和InDel4-5等位基因。7l份能檢測(cè)到等位基因的材料中有69份被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鑒定為香稻品種，正確率達(dá)97.18%。在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的121個(gè)品種中，香味表型明確，但僅有55個(gè)品種能檢測(cè)到等位基因，檢出率為45.45%。來(lái)自百色市的供試材料中能檢測(cè)到等位基因的品種占該市香稻品種總數(shù)的53.19%，含有InDel2、InDe17和InDel4-5等位基因型，但以Inde17等位基因型為主；來(lái)自河池市的供試材料中能檢測(cè)到等位基因品種占該市香稻品種總數(shù)的比例最高，達(dá)64.10%，但只檢測(cè)到2種基因型，以Indel4-5等位基因型為主；柳州市及其他市能檢測(cè)到等位基因的比例遠(yuǎn)低于百色市和河池市。[結(jié)論]廣西香稻地方品種具有較強(qiáng)的地域特色，不同地區(qū)的香稻香味等位基因存在明顯差異，且可能存在已報(bào)道的等位基因之外的香味基因或香味等位基因，僅用4個(gè)已報(bào)道的等位基因不足以檢測(cè)出全部的香稻品種，應(yīng)將分子標(biāo)記法與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合，才可更準(zhǔn)確鑒定出香稻品種。

關(guān)鍵詞：香稻；香味；Badh2基因；等位基因；分子標(biāo)記

0引言

[研究意義]香稻是一種具有獨(dú)特香味的功能稻和特種稻，其食味佳且藥效顯著，在我國(guó)古代就享有“貢米”之稱，國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格是非香稻和優(yōu)質(zhì)稻的2-3倍（胡培松等，2006）。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，香稻市場(chǎng)需求量日益增大，迫切需要選育出更多優(yōu)質(zhì)香稻新品種，但鑒定其香味性狀，明確香味產(chǎn)生的原因是發(fā)掘香味基因資源的首要工作，對(duì)選育優(yōu)質(zhì)特色香稻品種具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]自Ahn等（1992）采用分子標(biāo)記技術(shù)將香稻的香味基因定位于第8染色體上以來(lái)，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，成功克隆香稻第8染色體上的香味基因（Bradbury et al.，2005），并發(fā)現(xiàn)香稻的香味主要受第8染色體上的甜菜堿醛脫氫酶（BADH2）基因Badh2控制（Chenet al.，2008），且其整個(gè)基因序列的引物也已設(shè)計(jì)完成（Shi et al.，2008），為深入研究香味基因打下基礎(chǔ)。近年來(lái)，關(guān)于水稻香味基因的研究較多。Bradbury等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，香稻香味的產(chǎn)生是由于第8染色體上的Badh2基因序列編碼區(qū)第7外顯子8 bp的缺失和3 bp突變?cè)斐删幋a蛋白的提前終止，產(chǎn)生無(wú)功能的截短BADH2蛋白，香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）不斷積累，致使香稻的葉片和籽粒產(chǎn)生香味。Shi等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，與非香稻品種相比，香稻的香味基因Badh2具有新等位基因，即第7個(gè)外顯子正常而第2個(gè)外顯子存在7 bp的缺失。王軍等（2008）將Badh2基因第2個(gè)外顯子的7 bp缺失和第7個(gè)外顯子的8 bp缺失設(shè)計(jì)成lnDel功能性分子標(biāo)記，分別命名為InDel-E2和InDel-E7，是最先應(yīng)用于香稻基因缺失類型鑒定的功能性分子標(biāo)記。Shao等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，廣西的香稻品種妙香糯第4、5外顯子803 bp缺失。Myint等（2012）研究表明，緬甸的香稻品種Pathein Nyunt和Yangon Saba Badh2基因第13外顯子中插入3 bp，導(dǎo)致稻米產(chǎn)生香味，是一種新的等位基因型，由此開發(fā)了相應(yīng)功能性分子標(biāo)記In-Del-E5和InDel-E13。這些InDel功能性分子標(biāo)記的開發(fā)，為香稻種質(zhì)資源的鑒定篩選及多樣化研究提供了便利，使更多香稻的香味基因型得以鑒定（Fitzgerald et al.，2008；劉化龍等，2014；閆影等，2015）。目前，已將香味基因功能性分子標(biāo)記應(yīng)用到香稻定向選育，以提高選育效率和準(zhǔn)確性。杜雪樹等（2009）利用香味基因功能性分子標(biāo)記成功選育出香稻恢復(fù)系C349和c354。董華林等（2015）利用香味基因功能性分子標(biāo)記定向選擇親本，選育出可媲美泰國(guó)香稻的優(yōu)質(zhì)香稻Y43。趙志鵬等（2015）利用香味基因功能性分子標(biāo)記輔助選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)香型粳稻種質(zhì)純合株系香粳1305。[本研究切入點(diǎn)]廣西獨(dú)特的氣候條件和區(qū)位優(yōu)勢(shì)，造就了豐富的稻種資源，存在一些以香、糯、大、軟、白為特點(diǎn)的特色香稻地方品種，具代表性的有靖西香糯、上思香糯、都安板升香糯等，在我國(guó)享有盛名，是非常寶貴的地方稻種資源，但有關(guān)廣西香稻種質(zhì)資源的香味性狀及香味基因研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]將分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合，對(duì)廣西不同地方香稻品種的香味性狀進(jìn)行鑒定，明確其香味基因型及存在的多樣化信息，為挖掘新香味基因資源，發(fā)揮廣西香稻優(yōu)勢(shì)，培育優(yōu)質(zhì)特色水稻品種打下基礎(chǔ)，同時(shí)為開展廣西區(qū)稻種資源的原位保護(hù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試的179份香稻材料分別來(lái)自廣西不同地區(qū)（表1），收集于20世紀(jì)70-90年代，保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院中期庫(kù)，原記錄信息為香稻。其中，糯稻175份，粘稻4份；粳稻176份，秈稻3份；水稻176份，陸稻3份。所有供試材料均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗(yàn)田，于2013年7月25日播種，8月5日移栽，9月中旬分蘗，11月中旬收獲。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1傳統(tǒng)方法鑒定香稻香味 采用2種傳統(tǒng)方法進(jìn)行香味鑒定。（1）KOH浸泡法：在水稻分蘗期，取每份材料的單株葉片2 g，剪碎后放人50 mL離心管中，加入10 mL 1.7%KOH溶液，加蓋密封后于30℃放置10 min，然后逐一打開蓋子，立即聞其氣味，評(píng)價(jià)有無(wú)香味。為避免嗅覺差異引起偏差，每次檢測(cè)均設(shè)香稻材料和非香稻材料為對(duì)照。采用3人分別評(píng)定的方法，并對(duì)有爭(zhēng)議的材料進(jìn)行重復(fù)鑒定（Sood and Siddiq，1978）。（2）籽粒咀嚼法：稻米成熟后分別收集每份材料的單株谷粒，自然曬干后每株隨機(jī)選取一個(gè)穗子的16粒谷粒，剝殼逐粒咀嚼糙米，鑒定其香味。若16粒均不香，表明該植株種子無(wú)香味，鑒定為非香稻品種；若連續(xù)5粒谷粒均有香味，鑒定為香稻品種。采用3人分別評(píng)定的方法，并對(duì)有爭(zhēng)議的材料進(jìn)行重復(fù)鑒定（Bemer and Hoff，1986）。

1.2.2分子標(biāo)記法鑒定香稻香味基因型

1.2.2.1引物設(shè)計(jì) 目前已報(bào)道的Badh2基因有4個(gè)等位基因，其中InDel2等位基因?yàn)榈?外顯子7 bp缺失，InDel7等位基因?yàn)榈?外顯子8 bp缺失和3 bp突變，lnDel4-5等位基因?yàn)榈?-5外顯子803 bp缺失，lnDell3等位基因?yàn)榈?3外顯子3 bp插入。4個(gè)等位基因引物見表2，由廣州英韋創(chuàng)建生物科技有限公司合成。4個(gè)等位基因的非香型對(duì)照均為日本晴，其中，lnDel2、InDel7和InDel4-5的香型對(duì)照品種分別為武香粳9號(hào)、廣陵香糯和花香糯，InDell3無(wú)香型對(duì)照品種。

1.2.2.2總DNA提取 參照Murray和Thompson（1980）的CTAB法提取每份材料單株葉片的總DNA。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增及基因型鑒定 PCR擴(kuò)增參照Shao等（2011）的方法。PCR產(chǎn)物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，經(jīng)0.2%硝酸銀快速染色并觀察拍照。根據(jù)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度判斷香稻材料的香味基因型，純合香味基因型記為1，雜合香味基因型記為2，非香基因型記為0，并統(tǒng)計(jì)各基因型數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1香稻香味的鑒定結(jié)果

179份供試材料的品種信息中顯示為香稻，但部分僅是資源收集時(shí)的簡(jiǎn)單記錄，未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的香味鑒定。本研究利用籽粒咀嚼法和KOH浸泡法驗(yàn)證這批材料是否具有香味。籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均可快速鑒別香稻的香味，但檢測(cè)結(jié)果存在差異（表3）。KOH浸泡法檢測(cè)到具有香味的材料167份，占供試材料總數(shù)的93.30%；籽粒咀嚼法檢測(cè)到具有香味的材料124份，占供試材料總數(shù)的69.27%，兩種方法均能檢測(cè)到香味的材料121份，占供試材料總數(shù)的67.60%，兩種方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）共檢測(cè)到有香味的材料共170份。綜上所述，籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中97.58%能用KOH浸泡法鑒定出香味，但KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中僅72.46%能用籽粒咀嚼法鑒定出香味，表明KOH浸泡法能鑒定出較多的香味品種。

2.2香味基因型鑒定結(jié)果

利用分子標(biāo)記法鑒定廣西香稻地方品種香味基因型，結(jié)果如表4所示，有71個(gè)品種能檢測(cè)到香味等位基因，占供試材料總數(shù)的39.66%，其中僅1個(gè)品種檢測(cè)到InDel2等位基因，40個(gè)品種檢測(cè)到InDel7等位基因，37個(gè)品種檢測(cè)到InDel4-5等位基因，但有7個(gè)品種同時(shí)檢測(cè)到InDel7等位基因和InDel4-5等位基因，即純InDel7等位基因型的香稻品種33個(gè)、純InDel4-5等位基因型的香稻品種30個(gè)；供試的179個(gè)香稻地方品種均未檢測(cè)到InDell3等位基因。部分供試香稻材料的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。糯稻尾為InDel2等位基因型，號(hào)石蛇和香糯為InDel7等位基因型，冷水糯、后糯八谷和黑米糯為InDel4-5等位基因型，八月糯為InDel7和InDel4-5等位基因型，但在黑皮糯谷、谷對(duì)實(shí)、后十亮列、禾糯大坡和靖西香谷中4個(gè)等位基因均未檢測(cè)到。

綜上所述，供試的179份地方水稻材料中，主要1）.2InDel7等位基因型和InDel4-5等位基因型為主，分別占71份檢測(cè)到已知等位基因品種數(shù)的46.48%和42.25%，分別占兩種傳統(tǒng)方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）鑒定為香稻品種數(shù)（170份）的19.41%和17.65%。如表3所示，KOH浸泡法鑒定為香稻的167個(gè)品種中能檢測(cè)到等位基因的有67個(gè)，占40.12%。籽粒咀嚼法鑒定為香稻的124個(gè)品種中能檢測(cè)到等位基因的有57個(gè)，占45.97%。KOH浸泡法和籽粒咀嚼法均鑒定為香稻的121個(gè)品種中能檢測(cè)到等位基因的有55份，占45.45%。表明利用分子標(biāo)記法能檢測(cè)到等位基因的71個(gè)品種中，有69個(gè)被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鑒定為香稻品種，正確率達(dá)97.18%。但僅用4個(gè)已知的等位基因不足以檢測(cè)出全部的香稻品種，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的121個(gè)品種中，香味表型很明確，但僅有55個(gè)品種能檢測(cè)到等位基因，檢出率為45.45%。由此推測(cè)，供試的香稻品種中含有其他未知的香味基因或香味等位基因。

2.3香味等位基因地域分布分析

廣西的香稻品種以粳糯稻為主，主要分布于百色、河池和柳州等市的山區(qū)。本研究供試香稻品種中有140個(gè)來(lái)自于這3個(gè)市，占供試材料總數(shù)的78.21%，其余21.79%的供試材料分別來(lái)自于崇左、來(lái)賓、桂林、防城港、南寧和欽州6個(gè)市（表1）。各市的香稻品種香味基因型存在明顯差異（表5）。來(lái)自百色市的供試材料中被鑒定為香稻的品種數(shù)量（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）占供試材料總數(shù)的比例最低，為87.04%，其中能檢測(cè)到等位基因的品種有25個(gè)，占該市香稻品種總數(shù)的53.19%，具有本研究能檢測(cè)到的全部等位基因型即InDel2、InDel7和InDel4-5，基因型豐富，但以Indel7等位基因型為主，占該市能檢測(cè)到等位基因品種數(shù)的60.00%。來(lái)自河池市的供試材料中，能檢測(cè)到等位基因的品種數(shù)占該市香稻品種總數(shù)比例最高，達(dá)64.10%，但僅檢測(cè)到2種等位基因，以Indel4-5等位基因?yàn)橹?，占該市能檢測(cè)到等位基因品種數(shù)的64.00%。柳州市及其他市全部供試品種均鑒定為香稻品種，但能檢測(cè)到等位基因的比例卻遠(yuǎn)低于百色市和河池市。

3討論

已有研究表明，KOH浸泡法和籽粒咀嚼法是常用的傳統(tǒng)香味鑒定方法，僅用其一即可鑒定出香稻品種（葉興鋒等，2013）。但本研究發(fā)現(xiàn)，用葉片KOH浸泡法比籽粒咀嚼法能鑒定出更多的香稻品種，在籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中，97.58%同樣被KOH浸泡法鑒定為香稻品種；在KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中，僅72.46%被籽粒咀嚼法鑒定為香稻品種。由于香稻籽粒是最主要的目標(biāo)，故可用籽粒咀嚼法進(jìn)一步驗(yàn)證KOH浸泡法。結(jié)合兩種方法進(jìn)行香味鑒定，可獲得更準(zhǔn)確的香稻品種鑒定結(jié)果。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，根據(jù)水稻Badh2基因的等位基因設(shè)計(jì)InDel分子標(biāo)記用于鑒定香稻品種，具有準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)（徐小龍等，2011；張江麗等，2015），是定向選育香稻品種的有效、快捷途徑（董華林等，2015；趙志鵬等，2015）。本研究還發(fā)現(xiàn)，利用已報(bào)道的Badh2基因4個(gè)等位基因（InDel2、InDel7、InDel4-5和InDell3）來(lái)鑒定香稻品種的準(zhǔn)確率高達(dá)97.18%，但僅用4個(gè)等位基因不足以檢測(cè)出所有香稻品種，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的品種中，僅45.45%的香稻品種能檢測(cè)到等位基因，說(shuō)明在供試香稻材料中含有其他香味基因或香味等位基因，可通過(guò)對(duì)香味基因Badh2進(jìn)行測(cè)序、基因定位和基因克隆等研究進(jìn)一步挖掘。

本研究的179份供試香稻材料中有香味材料170份（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法），19.41%為InDel7等位基因型，17.65%為InDel4—5等位基因型，僅0.59%為InDel2等位基因型，無(wú)InDell3等位基因型，其中7個(gè)香稻品種同時(shí)存在2個(gè)香味等位基因（InDel7和InDel4-5等位基因型），表明其Badh2基因既存在第7外顯子8 bp缺失和3 bp突變又存在第4-5外顯子803 bp缺失，屬疊加型的缺失類型。這與Shao等（2011）、Myint等（2012）、姜達(dá)等（2015）研究證實(shí)，香稻香味僅受Badh2基因單一缺失或突變型控制的結(jié)論相矛盾，其原因可能是在種植過(guò)程品種發(fā)生自然或人工雜交，聚合了2個(gè)香稻品種的等位基因，也有可能是品種在進(jìn)化過(guò)程中，Badh2基因多個(gè)位置同時(shí)發(fā)生突變。

廣西香稻地方品種具有較強(qiáng)的地域特色，不同地區(qū)的香稻香味等位基因存在明顯差異。本研究供試香稻地方品種中78.21%來(lái)自百色、河池和柳州等3個(gè)市。這3個(gè)市分別位于廣西的西北部和中北部，有較多少數(shù)民族聚居的山區(qū)，當(dāng)?shù)厝讼彩撑疵?，香糯稻是重要的飲食和宗教材料，因此香糯稻地方品種非常豐富，是香稻寶貴的基因資源。由于山區(qū)的香糯稻品種部分種于山坡或丘陵地，抗旱和耐貧瘠能力強(qiáng)，因此，這些地方品種在優(yōu)異基因挖掘及香稻和糯稻新品種選育中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，粳糯在廣西又稱大糯，米粒圓潤(rùn)，粘性好，做粽子、糍粑等商品性好，如三江大糯、大順糯米等，深受消費(fèi)者喜愛，但當(dāng)前一些粳糯稻老品種綜合性狀差、產(chǎn)量低，可利用本研究鑒定篩選出的香型粳糯稻進(jìn)行遺傳改良，選育出高產(chǎn)、綜合性狀好、適應(yīng)性廣的粳型香糯。

4結(jié)論

廣西香稻地方品種可能存在已報(bào)道的香味等位基因之外的香味基因或香味等位基因，且不同地區(qū)的香稻其香味等位基因存在明顯差異，可進(jìn)一步挖掘廣西特色香味基因型，并應(yīng)用于育種研究。