雷利度胺抗胃癌細(xì)胞作用及機(jī)制研究

李紅玲　張玲芳　李明玉

[摘要] 目的 探討雷利度胺對(duì)胃癌MFC細(xì)胞體外增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制。 方法 以MTT法檢測(cè)雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞增殖的影響，熒光顯微鏡觀察雷利度胺作用后MFC細(xì)胞形態(tài)的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)雷利度胺作用后MFC凋亡率，Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3表達(dá)。 結(jié)果 雷利度胺能顯著抑制MFC細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)趨勢(shì)。雷利度胺作用MFC細(xì)胞后呈現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變、凋亡增加。與對(duì)照組比較，60 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h組及120 mg/雷利度胺誘導(dǎo)72 h組的細(xì)胞可以明顯抑制MFC細(xì)胞的生長(zhǎng)（P < 0.01）。與對(duì)照組比較，雷利度胺作用后Bcl-2表達(dá)明顯下降（P < 0.01），Cleaved Caspase-3表達(dá)有所增加（P < 0.05）。 結(jié)論 雷利度胺可抑制MFC細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活Caspase-3、下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 雷利度胺；MFC細(xì)胞；增殖；凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0018-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Lenalidomide on gastric carcinoma MFC cells proliferation and apoptosis in vitro and its mechanism. Methods The inhibitory effect of Lenalidomide on MFC cells was estimated by MTT assay， and the morphological changes of the cells were observed under fluorescence microscope. Cell apoptosis were analyzed using flow cytometry. The protein expressions of apoptosis-associated genes as Bcl-2 and Caspase-3 were viewed by Western blot. Results Proliferation of MFC cells was inhibited effectively after treated with Lenalidomide. Lenalidomide inhibited the proliferation of MFC cells in a time- and dose-dependent manner. Lenalidomide treatment resulted in changes of apoptotic morphology of the cells as observed under fluorescence microscope and increased cell apoptosis. Compared with control group， 60 mg/L Lenalidomide group and 120 mg/L Lenalidomide group can significantly inhibit the growth of MFC cells after treatment of 72 hours （P < 0.01）. Compared with control group， the expression of Bcl-2 was significantly decreased after Lenalidomide （P < 0.01）， the expression of Cleaved Caspase-3 was increased after Lenalidomide （P < 0.05）. Conclusion Lenalidomide can inhibit MFC cell proliferation， induce cell apoptosis， and the mechanism may be correlated to the up-regulation of Caspase-3 and down-regulation of Bcl-2.

[Key words] Lenalidomide； MFC cell； Proliferation； Apoptosis

雷利度胺是沙利度胺的類(lèi)似物，最早用于多發(fā)性骨髓瘤[1]的治療，目前在套細(xì)胞淋巴瘤[2-3]和骨髓增生異常綜合征的治療中也取得較好的效果，且不良反應(yīng)輕微。研究發(fā)現(xiàn)，雷利度胺對(duì)某些實(shí)體瘤[4]也有抗腫瘤作用，如在非小細(xì)胞肺癌[5]的研究中也發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用。但雷利度胺是否對(duì)胃癌有抗腫瘤作用目前未知。本研究采用胃癌細(xì)胞株MFC作為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)等方法，觀察雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞體外抗增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用，并初步探討其機(jī)制。旨在為雷利度胺在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雷利度胺購(gòu)自臺(tái)州市椒江星成醫(yī)藥化工有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）配制成20 mg/mL的儲(chǔ)存液，-20℃凍存，臨用時(shí)稀釋至工作濃度，其中DMSO的使用濃度低于1%。0.1%胰蛋白酶、PMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Hoechst33258、Annexin V試劑盒為杭州碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（250 mg/支）為Sigma公司；Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3抗體購(gòu)自Santa-Cruz公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞系為鼠胃癌細(xì)胞株MFC，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)、傳代細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，常規(guī)加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素于培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。0.1%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測(cè)雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.1%胰蛋白酶消化，每孔加200 μL細(xì)胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板中。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低濃度雷利度胺（1.25、2.5、5、10 mg/L）對(duì)MFC細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，故本研究中選擇雷利度胺濃度為20、40、60、80、100、120 mg/L。各組均按每孔5×104/mL細(xì)胞數(shù)接種96孔板，每組設(shè)4復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和調(diào)零孔。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度雷利度胺，使其終濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加20 μL/孔MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清液，加入150 μL/孔DMSO。為使結(jié)晶充分溶解需先震蕩10 min，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。細(xì)胞抑制率=（1-A570處理組/A570未處理組）×100%。

1.4 Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組，60 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h組，120 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h組。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，消毒蓋玻片后放入6孔板中，細(xì)胞接種濃度為5×104/mL。48 h后取出貼有細(xì)胞的蓋玻片，PBS沖洗3次，對(duì)照組細(xì)胞只加培養(yǎng)液孵育48 h，按照Hoechst33258染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 Annexin Ⅴ染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集對(duì)照組，60、120 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h的細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌兩遍，應(yīng)用緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105細(xì)胞，生理鹽水洗滌2遍，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻避光作用30 min，加入10 μL PI室溫避光作用15 min，流式細(xì)胞儀（FASCalibur）在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處進(jìn)行凋亡率檢測(cè)。

1.6 Western blot分析Bcl-2、Caspase-3表達(dá)

制備細(xì)胞抽提液。取1.0 μL測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-聚丙酰胺凝膠濃度為15%。上樣前每份標(biāo)本取50 μg蛋白質(zhì)與2×上樣緩沖液混勻后，100℃煮沸3 min。電泳完成后用硝酸纖維素膜上進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，用5%脫脂牛奶封閉，Bcl-2（1∶1000）、Caspase-3（1∶500）、Cleaved Caspase-3（1∶500）室溫雜交2 h。二抗室溫雜交45 min，ECL顯像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定雷利度胺對(duì)MFC的細(xì)胞毒性

20、40、60、80、100、120 mg/L雷利度胺分別誘導(dǎo)MFC細(xì)胞0～96 h，分別以雷利度胺作用濃度及時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)作圖1，可見(jiàn)細(xì)胞抑制率隨雷利度胺作用濃度的增加而逐漸增加，隨雷利度胺作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，顯示了雷利度胺抑制作用的時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性特點(diǎn)。72 h細(xì)胞IC50為60 mg/L，因此選用60 mg/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。

2.2 Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察雷利度胺對(duì)MFC作用后細(xì)胞形態(tài)的改變

雷利度胺作用后可見(jiàn)MFC細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯的改變。Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常細(xì)胞的細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞核接近圓形，染色均勻而明亮。雷利度胺處理后，細(xì)胞核發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，染色質(zhì)斷裂、濃縮，細(xì)胞核裂解為碎塊，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為發(fā)強(qiáng)藍(lán)色熒光的團(tuán)塊或顆粒，部分染色呈彌散分布，部分細(xì)胞核碎裂成明亮的塊狀（圖2），提示MFC細(xì)胞核損傷為雷利度胺引起的凋亡改變。

2.3 雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞凋亡的影響

圖3所示MFC細(xì)胞凋亡率隨雷利度胺濃度的增加而增加，在MFC細(xì)胞中對(duì)照組、60 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h組及120 mg/L雷利度胺誘導(dǎo)72 h組的細(xì)胞凋亡率分別為0.24%、16.06%和29.75 %，顯示了劑量依賴(lài)性特點(diǎn)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.4 雷利度胺對(duì)BGC-823、MFC細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果如圖4所示，雷利度胺作用后Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，前者較對(duì)照組明顯降低（P < 0.01），后者則明顯升高（P < 0.05），且上述變化與雷利度胺呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

3 討論

胃癌為我國(guó)高發(fā)腫瘤之一[6]，手術(shù)、化療、放療是其傳統(tǒng)的治療方法，對(duì)于晚期胃癌而言，化療是最重要的治療手段之一[7-8]，然而一線(xiàn)的化療有效率仍然徘徊在30%～40%，PFS在4～6個(gè)月，總生存期不超過(guò)1年[9]，因此很有必要研究新的治療策略。

雷利度胺是一種免疫調(diào)節(jié)藥，該藥被FDA首先批準(zhǔn)用于惡性血液病的治療，如多發(fā)性骨髓瘤[10]及骨髓增生異常綜合征[11]，且療效肯定，其抗腫瘤機(jī)制包括直接細(xì)胞毒性、對(duì)腫瘤免疫的間接調(diào)節(jié)作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤組織血管生成、抑制由細(xì)胞因子和骨髓基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞抗藥性的產(chǎn)生等作用。近幾年隨其應(yīng)用的擴(kuò)大，有臨床研究逐步推廣應(yīng)用于血液系統(tǒng)其他腫瘤及部分實(shí)體瘤中，已有研究顯示部分非霍奇金淋巴瘤[12-13]、復(fù)發(fā)難治的霍奇金淋巴瘤[14]、老年急性髓系白血病及初治的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者[15]在療效方面獲得臨床緩解，不良反應(yīng)小、可控。

本研究以雷利度胺誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞MFC為模型探討雷利度胺誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡的方式及分子機(jī)制。采用MTT法證實(shí)了對(duì)MFC細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。從MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，20～40 mg/L的雷利度胺對(duì)MFC-7細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，而60 mg/L及更高濃度的雷利度胺則可使細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且伴隨著藥物作用濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖被抑制更為明顯，根據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)計(jì)算，雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞的半數(shù)有效量在72 h時(shí)為60 mg/L。提示雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞的增殖有抑制作用，而且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

Hoechst33258是一種能夠于細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)合的無(wú)毒、水溶性雙苯咪唑類(lèi)化合物，能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA分子結(jié)合，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核是否受損。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為60、120 mg/L的雷利度胺作用MFC細(xì)胞72 h后，部分染色質(zhì)的染色增強(qiáng)，說(shuō)明雷利度胺可以引起MFC細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分比，60、120 mg/L雷利度胺分別作用MFC細(xì)胞72 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在雷利度胺濃度60 mg/L時(shí)即有較高的細(xì)胞凋亡發(fā)生，伴隨雷利度胺藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，藥物濃度在120 mg/L時(shí)，凋亡率達(dá)到29.75%。以上證明雷利度胺具有抗胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且這一作用與藥物作用的濃度有相關(guān)性。

細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著非常重要的作用[16]，其中Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族等在調(diào)控凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有著彌足輕重的地位[17]。Caspase是執(zhí)行凋亡的主要酶類(lèi)，Bcl-2蛋白家族主要通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體中Ca2+濃度等機(jī)制調(diào)控細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究對(duì)凋亡因子Bcl-2，Caspase-3[20]表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果提示雷利度胺能夠下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、并上調(diào)凋亡效應(yīng)分子Caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)MFC細(xì)胞凋亡，提示它們可能參與雷利度胺誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控。

綜上所述，雷利度胺對(duì)MFC細(xì)胞的體外生長(zhǎng)增殖有明顯抑制作用，并誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，可能成為有希望的抗胃癌新藥，這為抗胃癌的治療提供了一個(gè)新的思路。

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（收稿日期：2016-09-04 本文編輯：李亞聰）