環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠免疫細(xì)胞損傷及修復(fù)作用的影響

林帥　陳孟毅　劉冰

[摘要] 目的 比較環(huán)磷酰胺對幼年鼠、老年鼠與成年鼠免疫系統(tǒng)的影響。 方法 雄性C57BL/6幼年、成年、老年鼠各32只，各年齡小鼠均隨機(jī)分為對照組（12只）和模型組（20只）。模型組成年鼠、老年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，幼年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺72 mg/kg。對照組腹腔注射等劑量生理鹽水。分別在給藥后第3、7、14、28天采用流式細(xì)胞儀、血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測各年齡3只對照組、5只模型組小鼠相關(guān)免疫指標(biāo)。 結(jié)果 給藥后，與成年鼠相比，幼年鼠胸腺CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞、血漿IgA、IgG損傷恢復(fù)情況更好（P < 0.05）；脾臟Treg細(xì)胞恢復(fù)情況較差（P < 0.05）。與成年鼠相比，老年鼠脾臟指數(shù)下降更明顯（P < 0.05）；外周血NK細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞恢復(fù)情況較差（P < 0.05）；白細(xì)胞數(shù)下降更明顯且預(yù)后較差（P < 0.05）。 結(jié)論 應(yīng)用環(huán)磷酰胺后，幼年鼠免疫系統(tǒng)損傷、恢復(fù)情況與成年鼠基本一致。環(huán)磷酰胺對老年鼠免疫系統(tǒng)的損傷較成年鼠更嚴(yán)重且預(yù)后較差。

[關(guān)鍵詞] 環(huán)磷酰胺；年齡差異；免疫細(xì)胞；損傷與修復(fù)

[中圖分類號] R392.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0008-07

[Abstract] Objective To compare the effect of immune system injury induced by Cyclophosphamide among juvenile， adult and aged mice. Methods The 32 male C57BL/6 mice of every age were randomly divided into control group and model group. Every age control group had 12 mice and model group had 20 mice. Adult and aged mice were treated with Cyclophosphamide 100 mg/kg by intraperitoneal injection. Juvenile mice were treated with Cyclophosphamide 72 mg/kg by intraperitoneal injection. And the control mice were treated with saline in the same way as the Cyclophosphamide treated mice. Some immune indexes were measured by flow cytometer and blood-counter system at 3， 7， 14， 28 days after treatment. 3 mice of control group and 5 mice of model group of every age were measured every time. Results Compared with the adult mice， the proportion of thymus CD8+T cells， CD4+TCD8+T cells， plasma IgA， IgG had better prognosis （P < 0.05）， but spleen Treg cells had poor prognosis （P < 0.05）. Compared with the adult mice， spleen indexes of aged mice were reduced more seriously （P < 0.05）. The percentage of peripheral blood NK cells， B cells， neutrophils and CD4+T cells had poor prognosis （P < 0.05）； the number of white blood cell were reduced more seciously and it had poor prognosis （P < 0.05）. Conclusion After treatment with Cyclophosphamide， the damage and repair of juvenile mice′s immune system are consistent with the adult mice′s， but the damage and repair of aged mice′s are more severe.

[Key words] Cyclophosphamide； Different ages； Immune cells； Damage and repair

免疫系統(tǒng)可以對病原體侵入人體做出適度反應(yīng)，從而保持人體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[1]。免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答可分為固有免疫和獲得性免疫。固有免疫細(xì)胞是機(jī)體非特異免疫的重要組成部分，包括中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等[2-3]。獲得性免疫包括參與體液免疫的B細(xì)胞、參與細(xì)胞免疫的T細(xì)胞等。一般來說，人至青春期免疫系統(tǒng)才發(fā)育成熟，兒童免疫細(xì)胞表現(xiàn)出數(shù)量不足和功能不成熟[4]，成年人的免疫系統(tǒng)日趨成熟。隨著年齡的增長，人的免疫功能逐漸衰退。60歲以上老人T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等會(huì)出現(xiàn)生成數(shù)量減少或代謝活力下降等現(xiàn)象[5-6]。環(huán)磷酰胺作為一種免疫抑制劑，已有大量研究表明其能抑制體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對B細(xì)胞損傷作用尤為明顯[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床預(yù)測應(yīng)用免疫系統(tǒng)抑制劑后兒童、老年人免疫系統(tǒng)的損傷情況與修復(fù)，以及臨床藥物劑量差異性選擇提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備

健康3周齡（幼年鼠）、8周齡（成年鼠）、14月齡（近老年鼠，下文簡稱“老年鼠”）雄性C57BL/6小鼠（SPF級）各32只購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。各年齡小鼠分為對照組（12只），模型組（20只）。模型組成年鼠、老年鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，分兩次隔天給藥，50 mg/（kg·次）；幼年鼠環(huán)磷酰胺劑量為72 mg/kg[同種動(dòng)物間劑量換算公式：Dose（b）=Dose（a）×（Wb/Wa）2/3，W為體重（kg）]，分兩次隔天給藥，36 mg/（kg·次）。對照組腹腔注射等劑量生理鹽水。分別于給藥后第3、7、14、28天檢測各年齡小鼠相關(guān)免疫指標(biāo)。每次檢測各年齡對照組小鼠3只，模型組小鼠5只。

1.2 主要試劑與儀器

NK1.1、CD11b、F4/80、CD4、CD25、Foxp3抗體（eBioscience）；Foxp3 Buffer Set、CD8a、B220抗體（美國BD）。注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞）。小鼠IgA、IgG、IgM ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科）。137Csγ射線照射源，加拿大原子能有限公司，GAMMA-CELL40，劑量率0.80 Gy/min。流式細(xì)胞儀C6（美國BD），全自動(dòng)血液分析儀MEK-7222K（日本光電），酶標(biāo)儀MK3（美國ThermoMultiskan）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血血常規(guī)檢測 給藥后第3、7、14、28天，小鼠眼內(nèi)眥取血，EDTA-K3抗凝，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比。

1.3.2器官指數(shù)測定 小鼠稱重后取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。器官指數(shù)=器官重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.3.3 外周血IgA、IgG、IgM測定 樣本孔10 000倍稀釋的樣本，復(fù)孔加入2倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孵育2 h。洗滌后每孔加入檢測抗體孵育1 h。洗滌后每孔加入100 μL顯色底物，避光孵育30 min后加入終止液。450 nm波長檢測OD值。

1.3.4 外周血淋巴細(xì)胞分型測定 每管取50 μL抗凝血，分別加入CD4/CD8a和NK1.1/F4/80/B220/CD11b混合流式抗體，避光孵育30 min后裂解紅細(xì)胞，離心棄上清后洗滌，加入300 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+）、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8a+T細(xì)胞比例。外周血B220細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8a+T細(xì)胞絕對數(shù)計(jì)算方法：細(xì)胞數(shù)（×109/L）=B220細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8a+T細(xì)胞在總細(xì)胞中占比×淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 脾臟淋巴細(xì)胞分型測定 取100 μL 107個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液加到EP管中。加入CD4/B220/CD25混合流式抗體。避光孵育30 min后裂解紅細(xì)胞。離心棄上清后洗滌，使用Foxp3 Buffer Set處理細(xì)胞后，加入FOXP3流式抗體，避光孵育20 min。離心棄上清后洗滌，加入300 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測B細(xì)胞、Treg細(xì)胞（CD4+CD25+FOXP3+）比例。

1.3.6 胸腺淋巴細(xì)胞分型測定 取100 μL 107個(gè)/mL胸腺細(xì)胞懸液加到EP管中，加入CD4/CD8a混合流式抗體，避光孵育30 min，離心棄上清后洗滌，加入300 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞、CD8a+T細(xì)胞、CD4+CD8a+T細(xì)胞比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)、作圖，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠白細(xì)胞及分類的影響

給藥后，對比WBC結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成年鼠白細(xì)胞數(shù)在第3天降到（52.7±8.3）%，幼年鼠變化趨勢與成年鼠相似，老年鼠在第3天降到（27.3±4.2）%，下降幅度遠(yuǎn)大于成年鼠（P < 0.05），且第28天無法恢復(fù)至正常水平，恢復(fù)能力弱于成年鼠（P < 0.05），見圖1A。

給藥后，對比中性粒細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠中性粒細(xì)胞比例在第7天升高到（130.9±4.1）%，第14天后可恢復(fù)至正常水平。幼年鼠在第7天升高到（221.5±23.6）%，升高幅度大于成年鼠（P < 0.05），第14天后亦可恢復(fù)至正常水平。老年鼠比例在第7天下降到（59.4±6.8）%，趨勢與成年鼠相反（P < 0.05），第28天恢復(fù)情況與成年鼠不同（P < 0.05）。見圖1B。

給藥后，對比淋巴細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，成年鼠淋巴細(xì)胞比例在第7天小幅下降到（85.2±8.2）%，第14天后可恢復(fù)到正常水平。幼年鼠變化趨勢與成年鼠相似。老年鼠在給藥后第3天即上升到（119.5±12.0）%，趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第14天后可恢復(fù)到正常水平。見圖1C。

2.2 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠器官指數(shù)的影響

對比胸腺指數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠胸腺指數(shù)在給藥后第3天下降至（58.1±8.0）%，至第28天，只能恢復(fù)至（77.2±11.8）%。幼年鼠損傷及恢復(fù)情況與成年鼠相似。老年鼠在給藥后第3天未有明顯變化，趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第7天下降至（55.7±15.3）%，降至最低值時(shí)間晚于成年鼠，第14天后可恢復(fù)至正常值。見圖2A。

對比脾臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠脾臟指數(shù)在第3天下降至（73.5±6.8）%，第14天后可恢復(fù)至正常值。幼年鼠在第7天下降至（68.3±7.0）%，降至最低值時(shí)間晚于成年鼠，恢復(fù)情況與成年鼠相似。老年鼠在第3天下降至（40.8±4.7）%，下降程度大于成年鼠（P < 0.05），恢復(fù)情況與成年鼠相似。見圖2B。

2.3 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分型的影響

給藥后，對比CD4+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，CD4+T細(xì)胞比例降低至（36.5±1.1）%，第7天后可恢復(fù)至正常值，但是第28天再次下跌至（26.7±4.8）%。幼年鼠在給藥第3天小幅下降至（89.1±1.5）%，趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第7天后即可恢復(fù)至正常值，整體變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似。見圖3A。

給藥后，對比CD8+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，CD8+T細(xì)胞比例下降至（35.9±10.4）%，第7天后可恢復(fù)至正常值，但第28天再次下跌至（13.2±2.1）%。幼年鼠在給藥第3天下降至（71.1±4.4）%，趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第7天后即可恢復(fù)至正常值范圍。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似。見圖3B。

給藥后，對比CD4+CD8+T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，CD4+CD8+T細(xì)胞比例下降至（18.9±0.8）%，第7天后可恢復(fù)至正常值，但第28天再次下降至（2.9±0.2）%。幼年鼠在給藥第3天下降至（63.4±5.1）%，下降趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第7天后可恢復(fù)至正常值范圍，至第28天，再次下降至（77.9±23.2）%，恢復(fù)趨勢與成年鼠不同（P < 0.05）。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似，見圖3C。

2.4 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分型的影響

給藥后，對比B細(xì)胞比例：成年鼠在給藥后，B細(xì)胞比例持續(xù)走低，第14天達(dá)最低值[（59.9±8.3）%]，第28天可恢復(fù)至（86.7±6.9）%。幼年鼠、老年鼠在給藥后無明顯變化，均與成年鼠變化趨勢不同。見圖4A。

給藥后，對比Treg細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，Treg細(xì)胞比例下降至（59.1±22.7）%，至第7天下降至最低值（4.3±1.6）%，第28天可恢復(fù)至（126.7±17.4）%。幼年鼠損傷情況與成年鼠類似，但第28天僅能恢復(fù)至（66.5±3.2）%，恢復(fù)能力弱于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠損傷、恢復(fù)情況與成年鼠類似。見圖4B。

2.5 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠外周血淋巴細(xì)胞分型的影響

給藥后，對比NK細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第7天NK細(xì)胞比例下降至（29.9±7.0）%，至第28天，經(jīng)過小幅反跳后恢復(fù)至（106.5±13.0）%。幼年鼠在給藥后第3天無明顯變化，至第7天，上升至（149.3±32.1）%，至第28天依然維持該水平，整體變化趨勢與成年鼠不同。老年鼠在給藥第3天，下降至（53.5±13.2）%，至第28天，依然維持該水平，整體變化趨勢與成年鼠不同。見圖5A。

給藥后，對比B細(xì)胞絕對數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，B細(xì)胞比例驟降至（2.1±1.4）%，第14天反跳至（122.5±20.2）%，第28天回落到（57.1±11.5）%。幼年鼠損傷及恢復(fù)趨勢與成年鼠類似，第28天恢復(fù)情況優(yōu)于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠在給藥后第3天驟降至（1.1±0.3）%，至第7天可恢復(fù)至（25.4±18.7）%，至第28天一直維持該水平，恢復(fù)能力弱于成年鼠（P < 0.05），見圖5B。

給藥后，對比巨噬細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，巨噬細(xì)胞比例驟降至（20.9±8.9）%，至第28天可恢復(fù)至正常值。幼年鼠變化趨勢與成年鼠類似。老年鼠在給藥后第3天驟降至（14.8±6.6）%，至第28天回落到（56.1±26.3）%，變化趨勢與成年鼠相同。見圖5C。

給藥后，對比CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，CD4+T細(xì)胞比例驟降至（4.0±2.3）%，至第7天即可恢復(fù)正常值范圍。幼年鼠在給藥第3天下降至（30.4±16.2）%，第14天可恢復(fù)正常值范圍，恢復(fù)能力弱于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠在給藥第3天，驟降至（1.6±0.4）%，至第28天恢復(fù)至（63.7±14.3）%，恢復(fù)情況弱于成年鼠（P < 0.05）。見圖5D。

給藥后，對比CD8+T細(xì)胞絕對數(shù)發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥第3天，CD8+T細(xì)胞比例驟降至（3.6±2.8）%，至第28天可恢復(fù)至正常值。幼年鼠在給藥后第3天，下降至（20.9±9.8）%，趨勢與成年鼠不同（P < 0.05），第7天可恢復(fù)至（39.9±7.1）%，第28天恢復(fù)情況與成年鼠類似。老年鼠在給藥后第3天，驟降至（3.9±1.0）%，至第7天可恢復(fù)至（83.3±11.0）%，第28天恢復(fù)情況與成年鼠類似。見圖5E。

2.6 環(huán)磷酰胺對不同年齡小鼠血漿IgA、IgG、IgM含量的影響

給藥后，對比血漿IgA含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgA含量下降至（6.7±3.0）%，至第28天可恢復(fù)至（83.3±9.8）%。幼年鼠在給藥后第3天，下降至（62.6±4.4）%且至第28天可完全恢復(fù)。損傷恢復(fù)趨勢優(yōu)于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠變化趨勢與成年鼠基本一致。見圖6A。

給藥后，對比血漿IgG含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量驟降至（4.5±0.7）%，且第28天只能恢復(fù)至原來的（50.2±8.3）%。幼年鼠在給藥后第7天，下降至（38.9±7.5）%，至第14天即可完全恢復(fù)，恢復(fù)情況優(yōu)于成年鼠（P < 0.05）。老年鼠損傷恢復(fù)情況與幼年鼠相似。見圖6B。

給藥后，對比血漿IgM含量發(fā)現(xiàn)：成年鼠在給藥后第3天，IgG含量降至（37.0±4.9）%，至第28天可完全恢復(fù)。幼年鼠、老年鼠變化情況與成年鼠基本一致。見圖6C。

3 討論

兒童處于免疫功能不全期，自身免疫系統(tǒng)發(fā)育還未成熟，免疫系統(tǒng)較易受到攻擊。在一些疾病的急性期，常發(fā)生免疫細(xì)胞紊亂，引起繼發(fā)感染[4]。隨著年齡的增長，人體免疫系統(tǒng)功能將逐漸衰退。免疫功能不足對老年人的健康產(chǎn)生極為不利的影響[10]。目前，許多老年人易感的疾病需要長期用藥，部分藥物會(huì)產(chǎn)生免疫系統(tǒng)損傷的毒副作用[11]，老年人在長期應(yīng)用這類藥物后，相較成年人，對損傷會(huì)更敏感且恢復(fù)更緩慢。

胞數(shù)均在第3天降低。從模型上講，應(yīng)用環(huán)磷酰胺后，幼年鼠免疫系統(tǒng)變化情況與成年鼠基本一致；老年鼠免疫系統(tǒng)功能明顯下降，表現(xiàn)在脾臟指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞損傷更嚴(yán)重或預(yù)后較差。這與已報(bào)道的研究結(jié)果一致[12-15]。提示在應(yīng)用免疫抑制類藥物時(shí)，兒童免疫系統(tǒng)受影響程度較小，老年人免疫系統(tǒng)表現(xiàn)更為敏感。從機(jī)制上講，上述細(xì)胞的功能涉及非特異性免疫、特異性免疫、免疫平衡等方面，兒童、老人和成人在特異性免疫、非特異性免疫方面的反應(yīng)性差別已有較多研究[16-17]。在以往研究中，環(huán)磷酰胺常用作免疫抑制劑，利用成年鼠評價(jià)免疫保護(hù)類、免疫調(diào)節(jié)類藥物的作用，但評價(jià)體系較為單一[18-19]。本研究旨在全面地評價(jià)不同年齡小鼠的免疫系統(tǒng)損傷的具體差異，為臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

隨著年齡的增長，人的免疫功能經(jīng)歷了從建立到成熟到退化的過程[20]。關(guān)于免疫抑制劑對幼年鼠、老年鼠免疫系統(tǒng)的抑制作用，停藥后的恢復(fù)情況以及與成年鼠相關(guān)指標(biāo)的差別鮮有報(bào)道。本研究以環(huán)磷酰胺為陽性藥物，旨在全面系統(tǒng)地比較幼年鼠、老年鼠與成年鼠免疫系統(tǒng)的具體差別。為日后評價(jià)對兒童、老人免疫系統(tǒng)有損傷作用的藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究亦對比了幼年、成年、老年鼠外周血、胸腺、脾臟免疫細(xì)胞應(yīng)用免疫抑制劑造模后的參數(shù)變化，為兒童、老人應(yīng)用對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用的藥物時(shí)提供參考。

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（收稿日期：2016-09-06 本文編輯：程 銘）