高危型HPV—18E6引起小鼠骨髓源性樹突細胞p53的磷酸化

孫麗娜　韋超　吉興照

[摘要] 目的 探討高危型HPV-18E6對樹突細胞中p53蛋白磷酸化的作用。 方法 構(gòu)建真核表達載體pGFP-18E6，轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性的樹突細胞，采用磷酸化的p53抗體免疫熒光化學(xué)染色，共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察其表達水平。選用p53磷酸化位點的抗體（包括Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser37、Ser46和Ser392）對GFP-18E6融合蛋白表達的細胞進行免疫細胞化學(xué)染色，進一步探討磷酸化的p53蛋白在轉(zhuǎn)染后12～72 h的動態(tài)表達水平。 結(jié)果 樹突細胞在轉(zhuǎn)染pGFP-18E6和pEGFP-C1質(zhì)粒后，GFP-18E6主要定位于細胞核內(nèi)，而對照組只表達GFP的蛋白則均勻分布于樹突細胞。GFP-18E6誘導(dǎo)了p53蛋白的Ser15、Ser20和Ser392三個位點磷酸化。激光共聚焦顯微鏡測量細胞熒光強度顯示，GFP-18E6的表達與時間有相關(guān)性。 結(jié)論 高危型HPV-18E6可以誘導(dǎo)樹突細胞的p53蛋白發(fā)生多個位點的磷酸化，包括Ser15、Ser20和Ser392，p53多個位點磷酸化是病毒宿主相互作用的一種機制。

[關(guān)鍵詞] HPV18-E6；樹突細胞；p53磷酸化；定位

[中圖分類號] R373.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0022-04

[Abstract] Objective To study the effect of p53 phosphorylation in high-risk HPV-18E6 expressed bone marrowed dendritic cells. Methods The eukaryotic expression vector pGFP-18E6 was constructed and transfected into mouse bone marrow derived dendritic cells. The expression level of p53 was detected by immunofluorescence staining under the confocal microscope. Antibodies to p53 phosphorylation sites （including Ser6， Ser9， Ser15， Ser20， Ser37， Ser46， and Ser392） were used for immunocytochemical staining of cells expressing GFP-18E6 fusion protein， the phosphorylation of p53 protein after transfection in 12-72 h dynamic expression was further investigated. Results Dendritic cells transfected with pGFP-18E6 and pEGFP-C1 plasmid， GFP-18E6 was localized in the nucleus， while in the control group， the expression of GFP protein was uniformly distributed in the dendritic cells. GFP-18E6 induced phosphorylation of Ser15， Ser20 and Ser392 in three sites of p53 protein. The fluorescence intensity of the cells measured by confocal microscopy showed that the expression of GFP-18E6 was correlated with the time. Conclusion The high risk HPV-18E6 can induce the p53 phosphorylation mainly located in nucleic in dendritic cells， including Ser15， Ser20 and Ser392. It may be one of the way that virus interact with host cells.

[Key words] HPV-18E6； Dendritic cells； p53 phosphorylation； Location

人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可引起人的多種皮膚和黏膜的上皮增生性病變，根據(jù)HPV引起的病變性質(zhì)，其被分為高危型（high risk，HR）和低危型（low risk，LR）兩種。高危型HPV如HPV-16和HPV-18可以引起宮頸癌，而低危型HPV-11和HPV-6只引起生殖道的良性增生或尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）[1-2]。長期以來人們對高危型HPV的致癌機制進行了許多深入的探討，發(fā)現(xiàn)高危型HPV的E6蛋白是引起惡性轉(zhuǎn)化的主要原因。p53是重要的抗癌蛋白，在DNA損傷應(yīng)激的作用下可以被活化[3-5]。近年來，p53的磷酸化逐漸成為研究的熱點，已經(jīng)表明其在活化p53的功能上發(fā)揮了重要作用。目前發(fā)現(xiàn)了p53至少有20個磷酸化的位點，它們可以通過不同的信號途徑來發(fā)揮作用[7-10]。那么高危型HPV-18E6是否會影響p53的磷酸化？本研究采用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，在小鼠骨髓來源的樹突細胞中表達全長的高危型HPV-18E6蛋白，以探討其對樹突細胞p53磷酸化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達載體pEGFP-C1購自Clonetech公司；含有全長HPV-18E6基因序列的載體pCMV/HPV-18E6來自本實驗室；質(zhì)粒大量提取試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ，T4 DNA ligase、Taq酶等均購自Takara公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 樹突細胞培養(yǎng) 脫頸處死C57BL/6小鼠，用75%乙醇浸泡5 min，無菌剝離股骨、脛骨及肱骨，去除附著肌肉，剪去骨骺兩端，用注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，離心收集骨髓細胞，加入37℃預(yù)熱的Tris-NH4Cl裂解紅細胞，PBS洗滌2次，加入IL-4（500 μg/mL） 和GM-CSF（800 μg/mL），經(jīng)流式細胞儀檢測表面標記分子證實為樹突細胞。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至3×109 個/mL，接種于6孔板中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，棄去懸浮細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基并補充相同濃度的細胞因子，隔日半量換液，每日在相差顯微鏡下觀察樹突細胞的形態(tài)。

1.2.2 真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及細胞瞬時轉(zhuǎn)染 以pCMV/HPV-18E6為模板，以E6基因片段兩端分別引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的引物行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃ 50 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，獲得HPV-18E6的基因片斷，利用T4 DNA ligase經(jīng)4℃過夜，插入pEGFP-C1表達載體，連接好的重組體進行BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切鑒定正確，并經(jīng)測序與Genebank中的序列完全一致，重組表達質(zhì)粒命名為pGFP-18E6，按QIAGEN公司試劑盒說明書進行質(zhì)粒大量提取與純化。樹突細胞培養(yǎng)至第5天時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照Invitrogen公司Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行[11]。

1.2.3 共聚焦顯微鏡觀察 樹突細胞在轉(zhuǎn)染pGFP-18E6和pEGFP-C1質(zhì)粒后的24 h取出細胞爬片，用4%多聚甲醛固定，室溫10 min，冰冷的PBS洗3次，細胞核用PI染色，避光，10 min，用熒光顯微鏡采集圖像，觀察E6蛋白在樹突細胞中的定位情況。

1.2.4 免疫熒光技術(shù)檢測p53蛋白及磷酸化p53的表達 分別將pGFP和pGFP-18E6轉(zhuǎn)染樹突細胞后，取出24孔培養(yǎng)板中的細胞爬片，生理鹽水洗3次，每次5 min，用4%的多聚甲醛室溫固定7 min，置于空氣中干燥。1×PBS洗滌3次，每次約5 min。滴加蛋白封閉液，置于37℃濕盒中，封閉30 min。吸去封閉液，在細胞表面分別滴加入p53抗體和磷酸化p53抗體（cell signaling，1∶500稀釋），4℃，濕盒中過夜。次日，1×PBS-T洗滌3次，每次5 min。滴加Cy3標記的羊抗兔二抗（santa cruz，1∶500稀釋），注意避光，37℃，濕盒中作用40～60 min。采用1×PBS-T洗滌3次，每次5 min。PBS封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各組間比較采用oneway ANOVA，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GFP-18E6融合蛋白在細胞中的定位

將轉(zhuǎn)染后的樹突細胞用4%的多聚甲醛固定，室溫，7 min，GFP發(fā)出綠色的熒光，可以清晰地看到蛋白的定位。結(jié)果可見細胞中GFP-18E6（GFP與HPV-18E6的融合蛋白）主要定位于細胞核內(nèi)，而對照GFP蛋白則分布于整個細胞中。

2.2 GFP-18E6融合蛋白與磷酸化的p53共定位于細胞核

選用不同的p53磷酸化位點的抗體（包括Ser6，Ser9，Ser15，Ser20，Ser37，Ser46和Ser392）對GFP-11E6融合蛋白表達的細胞進行免疫細胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示，Ser15，Ser20和Ser392三個位點磷酸化的p53蛋白呈現(xiàn)紅色的熒光，因此，GFP-18E6蛋白可以引起p53多個位點磷酸化，包括Ser15，Ser20和Ser392，并且磷酸化的p53蛋白均主要表達于細胞核內(nèi)。進一步通過計算機圖像Merge處理可以很清晰的看到發(fā)出紅色熒光的磷酸化p53與綠色熒光的GFP-18E6蛋白共定位于細胞核。見圖1（封四）。

2.3 磷酸化p53的表達水平與時間的關(guān)系

由于GFP-18E6的表達與時間有相關(guān)性，進一步探討磷酸化的p53蛋白轉(zhuǎn)染后的12～72 h的動態(tài)表達水平。激光共聚焦顯微鏡測量細胞熒光強度顯示，在GFP-18E6轉(zhuǎn)染后的12 h，樹突細胞中Ser15和Ser20的p53蛋白表達陽性，并且它們的表達逐漸增高，在24 h表達到高峰。另外，在相同時間點觀察到Ser15的表達明顯高于Ser392和Ser20的p53的水平，且Ser392明顯高于Ser20的水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染后的48～72 h，這三個位點磷酸化的p53蛋白均為陰性。對于只表達GFP的對照組細胞，在整個觀察期間均未見到p53的磷酸化表達。見圖2。

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)，p53至少有20個磷酸化的位點，它們可以通過不同的信號途徑來發(fā)揮作用。如，在p53的N端的磷酸化位點（Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser33和Ser37）可以增強與轉(zhuǎn)錄活化因子p300/CBP和PCAF的相互作用[12]。且已有研究表明，Ser15、Ser20和Ser37可以穩(wěn)定p53。而C末端磷酸化的Ser315和Ser392位點以序列特異性結(jié)合的方式來調(diào)節(jié)p53的寡聚化狀態(tài)。磷酸化能夠穩(wěn)定并且活化p53，主要是由p53的Ser15和Ser20的磷酸化引起的。當(dāng)細胞受到DNA損傷的刺激時，ATM能迅速磷酸化p53的Ser15位點，抑制p53與MDM2的相互作用，從而來穩(wěn)定p53。p53的Ser20位于p53與MDM2相互作用的α-螺旋內(nèi)，其磷酸化可抑制p53的泛素化降解。在應(yīng)激的刺激中，p53的Ser20位點被細胞周期檢查點激酶2（Chk2）等激酶磷酸化，迅速提高了p53在細胞內(nèi)的總蛋白質(zhì)水平。對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，當(dāng)p53的Ser15和Ser20位點都突變成丙氨酸時，將嚴重削弱p53依賴的細胞凋亡及腫瘤抑制效應(yīng)[13]。這一發(fā)現(xiàn)有力地證明了p53的Ser15和Ser20的磷酸化對p53生理功能的重要性。

本研究構(gòu)建了真核HPV-18E6蛋白表達系統(tǒng)，觀察到HPV-18E6主要表達于細胞核中，且隨著時間的延長，進入細胞核的p53逐漸增加。由于p53的磷酸化是抗病毒的主要機制之一，因此在HPV-18E6蛋白表達的背景下來探討p53的磷酸化狀態(tài)。觀察到HPV-18E6瞬時表達的細胞中，p53在Ser15、Ser20和Ser392位點出現(xiàn)了明顯的磷酸化，并且它們主要位于細胞核中。因此，結(jié)果表明HPV-18E6可以誘導(dǎo)p53多個位點的磷酸化。其中，Ser15和Ser20位點最先發(fā)生磷酸化，與此相一致的是，曾經(jīng)有報道認為，Ser15在DNA損傷的事件中是最早發(fā)生磷酸化的位點，由ATM/ATR誘導(dǎo)的Ser15位點的磷酸化可以使p53和MDM2解離，因此，p53在Ser15的磷酸化可以使p53的表達水平增加[14]。另外，已有研究證實，Ser20的磷酸化在穩(wěn)定p53功能時也發(fā)揮了重要的作用，Ser20的磷酸化是由Chk1和Chk2介導(dǎo)的，它增加了p53的四聚體化、穩(wěn)定性及對抗DNA損傷的能力[15]?，F(xiàn)已知Ser15和Ser20的磷酸化位點恰好在MDM2結(jié)合的位置上，因此可以打斷p53與MDM2的結(jié)合，從而導(dǎo)致p53的穩(wěn)定性增加[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，p53在Ser15位點的磷酸化明顯高于Ser20位點的磷酸化，對于HPV-18E6來說，可能磷酸化的Ser15位點比Ser20位點發(fā)揮了更大的作用。這與已經(jīng)證實的結(jié)果去除Ser15位點的磷酸化可以廢除Ser20位點的磷酸化相符合。以前的研究發(fā)現(xiàn)，在不同的DNA損傷的應(yīng)激下可以引起不同位點的p53磷酸化。其中，Ser15是發(fā)現(xiàn)的第一個磷酸化位點，它在γ放射線的刺激下可以通過DNA依賴的PK和ATM蛋白來磷酸化p53，并且抑制MDM2對p53的降解。類似的，Ser20的磷酸化，也是在γ放射線的作用下可以解離p53與MDM2的作用，從而來穩(wěn)定p53的功能[14]。另外，在紫外線的照射下，可以引起酪氨酸激酶依賴的p53磷酸化，其位點是在p53C末端的Ser392[17]。因此，目前的研究表明，在DNA損傷的應(yīng)激下，p53的磷酸化在調(diào)節(jié)p53的功能上發(fā)揮重要作用。在另一方面，細胞將病毒的感染視為DNA損傷的刺激，啟動了宿主的監(jiān)視防御機制來對抗病毒的感染，其中，調(diào)節(jié)p53的磷酸化功能是一個主要的抗病毒的途徑。非洲黃熱病毒（African swine fever virus，ASFV）是通過Ser392的磷酸化來穩(wěn)定p53的功能，磷酸化的p53可以誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。EB（Epstein Barr）病毒是通過Ser15，Ser20和Ser392位點的磷酸化來活化p53蛋白，并通過促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活化靶向作用于抗病毒的轉(zhuǎn)錄因子[19]。相對應(yīng)的，病毒也進化了一些策略通過減少p53的磷酸化來對抗p53的活化。如，卡波氏肉瘤相關(guān)病毒（Kaposi Sarcoma Associated Herpesvirus，KSHV）的干擾素調(diào)節(jié)因子（vIRF1）能極大地降低p53在Ser15的磷酸化水平，導(dǎo)致p53的泛素化降解，從而屏蔽掉宿主的監(jiān)視機制，有利于病毒在宿主細胞中的復(fù)制[20]。因此，本研究推斷，在HPV-18E6的作用下，細胞內(nèi)p53發(fā)生了磷酸化，p53多個位點磷酸化是病毒宿主相互作用的一種機制。

綜上所述，HPV-18E6轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性樹突細胞后，可以引起細胞內(nèi)p53在多個位點的磷酸化，這可能是病毒宿主相互作用的一種機制。

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（收稿日期：2016-09-15 本文編輯：王紅雙）