人參皂苷Rb1減輕阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞自噬的保護作用

李龍飛　馬增春　王宇光　湯響林　譚洪玲　肖成榮　高月

[摘要] 該研究以H9c2細胞為研究對象，采用阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞自噬活化，探討人參皂苷Rb1對阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞自噬的作用。應(yīng)用CCK8法、透射電鏡觀察、熒光染色觀察、Western blot等方法分別檢測藥物作用后H9c2細胞的增殖以及自噬變化。結(jié)果顯示，阿霉素引起H9c2細胞活力下降，導(dǎo)致H9c2細胞的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加、自噬標(biāo)志性蛋白LC3由LC3I 轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ增加及p62蛋白表達降低；人參皂苷Rb1可以減弱阿霉素引起的心肌細胞活力下降并抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加、LC3I 轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ的增加以及p62蛋白表達的降低。以上結(jié)果提示，阿霉素可引起H9c2細胞死亡并誘導(dǎo)細胞自噬的活化，而人參皂苷Rb1對阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞死亡具有保護作用，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)自噬產(chǎn)生的。

[關(guān)鍵詞] 人參皂苷Rb1； 阿霉素； 自噬； H9c2細胞

Protective effect of ginsenoside Rb1 on doxorubicin

induced myocardial autophagy

LI Longfei， MA Zengchun*， WANG Yuguang， TANG Xianglin， TAN Hongling， XIAO Chengrong， GAO Yue*

（Institute of Radiation Medicine Science， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

[Abstract] Ginsenoside Rb1（Rb1）， which is one of the main ingredients derived from Panax ginseng， has been found to have extensive pharmacological activities including antioxidant， antiinflammatory， anticancer properties. In this study， the effect of Rb1 on doxorubicininduced myocardial autophagy was studied with H9c2 as the study object. CCK8 method， transmission electron microscope observation， fluorescence staining observation and Western blot were used to detect changes in H9c2 cell proliferation and autophagy after treatment. According to the results， doxorubicin could cause cell viability decrease， significant increase in the LC3Ⅱ/LC3I ratio and downregulation of the expression of p62. Pretreatment with ginsenoside Rb1 inhibited cell viability decrease and increase in doxorubicininduced autophagic structure and LC3Ⅱ/LC3I ratio， and downregulation of the expression of p62. In conclusion， doxorubicin could induce H9c2 cell death and induce autophagy， and ginsenoside Rb1 showed a protective effect on DOXinduced cardiotoxicity， which may be correlated with suppression of DOXinduced autophagy.

[Key words] ginsenoside Rb1； doxorubicin； autophagy； H9c2 cell

自噬是細胞受到刺激后產(chǎn)生雙層膜囊泡包裹胞內(nèi)物質(zhì)運送到溶酶體降解的過程，是真核生物所特有的進化保守過程，其主要功能是清除和降解細胞內(nèi)受損的細胞結(jié)構(gòu)和衰老的細胞器以及外來物，保持細胞穩(wěn)態(tài)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬不但參與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，而且在心肌肥大、心肌纖維化、心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭等多種病理過程中發(fā)揮重要作用[25]。人參為五加科植物人參Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國藥用歷史悠久，對多種疾病具有防治效果。人參皂苷Rb1是人參的主要有效成分之一[6]?，F(xiàn)代藥理研究證明，人參皂苷Rb1可明顯改善缺血性心臟病、各型心律失常、急性或慢性心力衰竭等心臟疾病[7]。阿霉素屬于周期非特異性抗腫瘤藥。文獻報道，其具有心臟毒性并且會導(dǎo)致心肌細胞自噬性死亡[810]。因此，本研究擬用阿霉素建立心肌細胞自噬損傷模型，探討人參皂苷Rb1對阿霉素誘導(dǎo)心肌自噬的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑 人參皂苷Rb1購于上海一飛生物科技有限公司（批號E049517，純度98%）；阿霉素（doxorubicine，DOX）、3MA購自美國Selleck Chemicals公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素雙抗溶液購于GE醫(yī)療公司；胎牛血清（FBS）購自天津康源生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit購于美國賽默飛世爾科技公司；CCK8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；AntiSQSTM1/p62抗體購自英國Abcam公司；LC3B抗體購自美國CST公司；實驗用水為超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 VICTOR X型多標(biāo)記酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）；SM 510 META激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；日立透射掃描電子顯微鏡H7650（日本日立集團）；Microfuge 22R型離心機（美國Beckman公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Millipore SimplicityTM185超純水機（德國Merck集團）；VIBS223S電子天平（德國Sartorious公司）。

1.3 細胞系 本研究采用大鼠胚胎心肌細胞系H9c2（21）作為實驗對象，此細胞系購自北京協(xié)和細胞資源中心（Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中（含青霉素鈉100 units·mL-1，鏈霉素100 mg·L-1），放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞生長至約80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 細胞活力檢測 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基不加細胞）、細胞對照孔和實驗孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細胞培養(yǎng)24 h后棄去上清培養(yǎng)液，加入用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成的各濃度受試藥物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)適當(dāng)時間后，每孔加入CCK8試劑10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約1～2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。細胞存活率=（A給藥組–A調(diào)零孔）/（A對照組–A調(diào)零孔）×100%。

2.3 電鏡觀察自噬體 細胞給藥處理后采用刮刀法收集細胞，經(jīng)過前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片等步驟制成超薄切片進行透射電鏡觀察。

2.4 RFPGFPLC3B融合蛋白示蹤自噬形成 按照PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit說明書，每1萬細胞中加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑，孵育16 h，將RFPGFPLC3B融合蛋白轉(zhuǎn)染至H9c2細胞。轉(zhuǎn)染成功后進行給藥處理，采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

2.5 Western blot 法檢測自噬相關(guān)蛋白 取對數(shù)生長期細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶約5×104個細胞。進行給藥處理后，收集各培養(yǎng)瓶細胞，離心，PBS漂洗，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白。經(jīng)BCA法測定蛋白濃度及變性后，進行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉或BSA封閉，分別加入LC3B，p62和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min，TBST洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J軟件進行條帶分析。

2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用±s表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析；統(tǒng)計分析軟件使用GraphPad Prism 5.0，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rb1減輕阿霉素引起的細胞損傷 阿霉素0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol·L-1處理24 h后，采用CCK8法檢測H9c2細胞活力的變化。結(jié)果顯示，阿霉素在1～20 μmol·L-1對H9c2細胞活力具有顯著的抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系（圖1）。不同濃度的人參皂苷Rb1預(yù)處理6 h后加入5 μmol·L-1DOX共孵育24 h，采用CCK8法檢測細胞活力。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1可以逆轉(zhuǎn)阿霉素導(dǎo)致的H9c2細胞活力下降，表明人參皂苷Rb1可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細胞死亡（圖2）。

3.2 阿霉素誘導(dǎo)H9c2細胞自噬活化模型的建立 為了選擇合適的濃度以及時間進行阿霉素自噬模型的建立，分別采用0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol·L-1 DOX處理細胞12 h和1 μmol·L-1DOX處理細胞0，3，6，12，24，48 h后提取細胞蛋白，采用Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示，阿霉素可劑量依賴性（0～10 μmol·L-1）以及時間依賴性（0～48 h）地導(dǎo)致LC3BⅡ/ LC3BⅠ升高并使p62蛋白含量降低，表明阿霉素可導(dǎo)致H9c2細胞自噬活化。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，選擇1 μmol·L-1DOX處理細胞12 h進行造模（圖3）。

3.3 人參皂苷Rb1抑制阿霉素誘導(dǎo)的H9c2自噬活化 50 μmol·L-1人參皂苷Rb1預(yù)處理6 h加入1 μmol·L-1DOX共孵育12 h后，收集細胞，制備超薄切片，采用透射電鏡觀察自噬體。與對照組相比，DOX組可以明顯觀察到自噬結(jié)構(gòu)，人參皂苷Rb1預(yù)處理組自噬結(jié)構(gòu)則不明顯（圖4）。

將RFPGFPLC3B融合蛋白轉(zhuǎn)染至H9c2細胞后，50 μmol·L-1人參皂苷Rb1和5 mmol·L-13MA分別預(yù)處理6 h加入1 μmol·L-1DOX共孵育12 h后，進行熒光觀察。與對照組相比，DOX組merge后紅色熒光明顯增強，提示RFPGFPLC3B融合蛋白多定位于溶酶體或自噬溶酶體內(nèi)，即自噬流活化（圖5）。人參皂苷Rb1預(yù)處理與自噬抑制劑3MA預(yù)處理組merge后紅色熒光減弱，提示其抑制DOX誘導(dǎo)的自噬活化（圖5）。

50 μmol·L-1人參皂苷Rb1和5 mmol·L-13MA分別預(yù)處理6 h加入1 μmol·L-1DOX共孵育12 h后，采用Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1預(yù)處理與自噬抑制劑3MA預(yù)處理組LC3BⅡ/LC3BⅠ明顯低于DOX組，同時p62蛋白表達亦有部分升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。提示人參皂苷Rb1可以抑制DOX誘導(dǎo)的自噬活化（圖6）。

4 討論

阿霉素亦稱多柔比星，是從一種真菌菌株中提取的有抗腫瘤作用的蒽環(huán)類抗生素，屬周期非特異性抗腫瘤藥物，能有效抑制DNA和RNA的合成，對各生長周期的腫瘤細胞均有殺滅作用，其特點是抗腫瘤作用強且抗瘤譜廣，因此廣泛用于各種惡性腫瘤的治療。但阿霉素存在嚴(yán)重的心臟毒性，主要表現(xiàn)為長期使用導(dǎo)致心肌病和慢性充血性心力衰竭[11]。目前認(rèn)為阿霉素心臟毒性機制包括活性氧自由基的產(chǎn)生、細胞線粒體損傷、細胞凋亡等[12]。越來越多的證據(jù)提示細胞自噬是阿霉素引起心臟毒性的重要因素[13]。

自噬是細胞吞噬自身物質(zhì)或細胞器，運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解，以實現(xiàn)細胞自身的代謝需要和相關(guān)細胞器更新的過程。自噬廣泛參與多種生理和病理過程[1415]。自噬對維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)是必須的，而且在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞自噬也起著重要作用，其具有雙重性，有可能促進或抑制疾病的發(fā)生發(fā)展，具體的作用與疾病的狀態(tài)以及引發(fā)細胞自噬的程度有關(guān)[16]。在自噬研究中，LC3和p62蛋白常被作為自噬標(biāo)記物。自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型（即LC3Ⅱ），因此，LC3Ⅱ/I 比值的大小可估計自噬水平的高低；p62做為自噬底物，通過自噬來降解，因此p62的多少可以反映自噬的強弱[17]。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]