半枝蓮總黃酮通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬的體內(nèi)實驗研究

陳明　王舉濤　吳珍妮　胡滿燕　高華武

[摘要] 該研究擬從體內(nèi)角度研究半枝蓮總黃酮（TFSB）的抗腫瘤作用，并探討TFSB對腫瘤細胞自噬的影響及其對PI3K/AKT/mTOR通路的調(diào)控作用，為TFSB的抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)。實驗以黑色素瘤荷瘤小鼠模型為研究對象，分為空白對照組、雷帕霉素組（Rap，1.5 mg·kg-1）、TFSB高、中、低劑量組（200，100，50 mg·kg-1），每天給藥1次，連續(xù)用藥11 d，通過測量腫瘤的體積及抑瘤率，來觀察TFSB對黑色素瘤生長的抑制效果；通過TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況，來進一步驗證TFSB的抗腫瘤活性；通過Western blot法檢測LC3Ⅰ，LC3Ⅱ的蛋白表達，計算LC3Ⅱ?qū)C3Ⅰ的相對表達量，探討TFSB對腫瘤細胞自噬的誘導(dǎo)作用；通過檢測PI3K/AKT/mTOR通路標志蛋白的磷酸化水平，研究TFSB誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制。結(jié)果表明，TFSB可有效抑制荷瘤小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長，減小腫瘤體積、提高抑瘤率，并且可以顯著增加腫瘤細胞凋亡指數(shù)，增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，抑制pPI3K，pAKT及pmTOR的蛋白表達水平，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。由此可見，半枝蓮總黃酮具有抑制體內(nèi)黑色素瘤生長的作用，其機制可能與通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬及凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 半枝蓮總黃酮； PI3K/AKT/mTOR通路； 自噬； 細胞凋亡

Effect of total flavonoids in Scutellaria barbata in mediating

autophagy in tumor cells via PI3K/AKT/mTOR pathway

CHEN Ming， WANG Jutao*， WU Zhenni， HU Manyan， GAO Huawu

（Department of Pharmacology， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract] To investigate the effect of the total flavonoids in Scutellaria barbata（TFSB） against autophagy in tumor cells in vivo， and further determine whether the mechanism is correlated with the PI3K/AKT/mTOR pathway， which lead to autophagyinduced tumor cell death. Melanomabearing mice were prepared and divided into control group， rapamycin group （Rap 1.5 mg·kg-1）， and high， middle and lowdose TFSB （200， 100， 50 mg·kg-1） groups. The groups were given drugs once a day for successively 11 days. The inhibitory effect of TFSB on the growth of melanoma was determined by measuring tumor volume and tumor inhibition rate. TUNEL method was used to detect the apoptosis of tumor cells to further verify the antitumor activity of TFSB. The protein expressions of LC3Ⅰ and LC3Ⅱ were detected by Western blot， and the relative expression of LC3Ⅱ was calculated based on LC3Ⅱ/LC3Ⅰ. In addition， the effect of TFSB on autophagy of tumor cells， the underlying molecular mechanism of TFSB in inducing autophagy and PI3K/AKT/mTOR pathway marker protein phosphorylation were also studied. According to the results， TFSB effectively inhibited melanoma growth in mice， reduced tumor volume， increased the tumor inhibition rate， and significantly increased tumor cell apoptosis index and the ratio of LC3Ⅱ/LC3I （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）. The protein expressions of pPI3K， pAKT and pmTOR were also suppressed dramatically compared with those in control group （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）. In conclusion， the total flavonoids in S. barbata could inhibit the growth of melanoma in vivo by inducing autophagy and apoptosis of tumor cells， which may be correlated with suppression of PI3K/AKT/mTOR pathway.

[Key words] total flavonoids in Scutellaria barbata； PI3K/AKT/mTOR pathway； autophagy； apoptosis

半枝蓮是一種唇形科黃芩屬植物的干燥全草，性平、味辛微苦、無毒，古籍記載，具有清熱解毒、散瘀活血、解痙祛痰、利尿消腫、抗癌等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明其具有抗病原微生物、抗腫瘤、抗自由基等多種藥理學(xué)活性，單方或復(fù)方常用于胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤的治療。關(guān)于半枝蓮對于腫瘤細胞自噬的影響，僅在2010年發(fā)現(xiàn)其活性成分脫鎂葉綠酸a可通過激活線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡和ERK介導(dǎo)的細胞自噬來發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。但半枝蓮黃酮類化合物對腫瘤細胞自噬的影響，已公開報道的文獻較少。因此，本研究擬從體內(nèi)角度研究半枝蓮總黃酮對腫瘤細胞自噬的影響，并觀察其對PI3K/AKT/mTOR通路的調(diào)控作用，研究其誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡的分子機制，為中藥抗腫瘤的作用機制和理論創(chuàng)新可能提供新的思路，具有一定的理論價值與實際意義。

1 材料

1.1 藥品與試劑 半枝蓮總黃酮（the total flavonoids in Scutellaria barbata，TFSB）提取方法：取半枝蓮藥材10 kg，粉碎，加12倍量80%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，濾過，濾液合并，減壓濃縮，使每毫升提取液相當(dāng)于藥材2 g，通過聚酰胺柱色譜分離，依次用水、20%乙醇、70%乙醇洗脫，70%乙醇洗脫液濃縮、干燥，得TFSB（淺黃色精細粉末）0.512 kg，得率5.12%，經(jīng)紫外分光光度法測定，總黃酮含量達75.6%，4 ℃保存?zhèn)溆?，?jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王舉濤副教授鑒定。臨用時，用生理鹽水配置成2%，1%及0.5%（分別相當(dāng)于原藥材含量為391，195，97.5 g·L-1）濃度的混懸液備用。

陽性對照藥（mTOR抑制劑）為雷帕霉素（rapamycin，Rap），購于北京索萊寶科技有限公司，批號104C0316。藥液的配制：將雷帕霉素先用無水乙醇溶解，配成200 mg·L-1，再用生理鹽水稀釋成150 mg·L-1，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

Tunel試劑盒（10279600）購于Roche公司；DAB顯色劑（K136821F）、betaActin（16AV0210）均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker（00275697）、ECL超敏發(fā)光試劑盒（QE218149）均購于Thermo公司；過硫酸銨（A6761）、甲醇（20160315）、30%丙烯酰胺（ST003）均購于Sigma公司；LC3多克隆抗體（GR1377245）購于Abcam公司；pAKT多克隆抗體（19）購于CST公司；pmTOR多克隆抗體（CN22161）、pPI3K多克隆抗體（CA36131）均購于Bioworld公司。

1.2 儀器 JJ12J脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；JBP5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016切片機（上海徠卡儀器有限公司）；AF10自動制冰機（意大利SCOTSMAN）；EPS 300電泳儀（上海天能科技有限公司）；LX 300微量離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TS1000水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；JEdA801D形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)（江蘇省捷達科技）；凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)的分析系統(tǒng)）。

1.3 動物 8周齡C57BL/6J小黑鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由上海斯萊克動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK（滬）2012002；鼠料由安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司提供，合格證號SCXK（皖）2007001；飲水：實驗室自制蒸餾水，高溫高壓滅菌后使用，實驗動物自由進食、飲水，實驗室溫度控制在20～25 ℃，濕度55%～65%。

2 方法

2.1 黑色素瘤細胞的培養(yǎng) 取B16F1黑色素瘤細胞株，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細胞，離心、用PBS洗滌、重懸、細胞計數(shù)。

2.2 黑色素瘤荷瘤小鼠模型的建立[23] 取C57BL/6小鼠60只，于左側(cè)腋下皮下按2×106個細胞/瘤的劑量注射上述B16F1黑色素瘤細胞懸浮液，并于接種后的第5天，用游標卡尺測量腫瘤的直徑，篩選出腫瘤直徑大于2 mm的小鼠50只，進行分組、給藥。

2.3 動物的分組及給藥 取上述荷瘤小鼠50只，按照腫瘤體積和小鼠體重、性別等因素隨機均分為5組：空白對照組、陽性對照組（Rap，1.5 mg·kg-1）、半枝蓮總黃酮（TFSB）高（200 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）劑量組[4]（分別相當(dāng)于原藥材劑量為3.91，1.95，0.975 g·kg-1）。當(dāng)腫瘤體積達到要求后，開始給藥：陽性對照組腹腔注射150 mg·L-1雷帕霉素10 mL·kg-1體重，半枝蓮總黃酮各劑量組分別灌胃2%，1%，0.5%的溶液10 mL·kg-1體重，空白對照組灌胃等容量的生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)11 d[根據(jù)美國Institutional Animal Care And Use Committee（IACUC）頒布的Guidelines For Tumor Induction In Mice And Rats （Updated MAY 2013）可知，荷瘤小鼠腫瘤直徑不得超過20 mm，此時對照組腫瘤體積已接近20 mm，且增長速度很快，故須及時處理動物、終止實驗]。

2.4 半枝蓮總黃酮的抑瘤效果觀察 用藥期間，每天觀察腫瘤的生長情況，分別間日稱取小鼠的體重，并用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，根據(jù)小鼠體重和腫瘤體積，繪制各組小鼠體重的生長曲線及腫瘤生長曲線。腫瘤體積[3]=長徑×短徑2/2。末次藥后24 h，頸椎脫臼處死小鼠。剝?nèi)「鹘M小鼠完整黑色素瘤組織、稱取瘤重，并計算抑瘤率。抑瘤率[3]=（對照組瘤重-藥物組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2.5 TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況 取一部分腫瘤組織，進行冷凍切片，TUNEL分析，觀察腫瘤細胞凋亡情況，方法如下：組織經(jīng)石蠟切片脫蠟至水、用蛋白酶K修復(fù)、破膜處理后，加試劑：取試劑1 TdT 5 μL和試劑2 dUTP 45 μL混合，覆蓋組織，37 ℃水浴60 min，然后將切片放入用甲醇配制的3% H2O2溶液中，室溫避光孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再加試劑3 converterPOD覆蓋組織，37 ℃水浴鍋孵育30 min；DAB顯色：用新鮮配制的DAB顯色液覆蓋組織，于顯微鏡下控制顯色時間，陽性凋亡細胞的細胞核呈棕黃色；復(fù)染細胞核：用Harris蘇木素復(fù)染細胞核3 min左右，最后用乙醇、二甲苯等試劑將切片脫水，用中性樹膠封片。切片經(jīng)JEdA801D形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)觀察腫瘤組織細胞凋亡情況，每張切片隨機選取5個視野于400高倍鏡下觀察凋亡細胞數(shù)、并計算細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）[3]=（對照組瘤重-藥物組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2.6 Western blot法檢測LC3Ⅰ，LC3Ⅱ及pPI3K，pAKT及pmTOR的蛋白表達 剪取100 mg腫瘤組織，用1 mL RIPA細胞裂解液進行裂解，提取組織總蛋白，然后經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗孵育：LC3抗體按照1∶2 000稀釋，pPI3K抗體按照1∶500稀釋，pAKT抗體按照1∶2 000稀釋，pmTOR抗體按照1∶500稀釋，4 ℃緩慢搖動孵育過夜，加入TBST洗滌3次，每次洗滌10 min。二抗孵育：參考二抗的說明書，按照1∶1萬比例稀釋HRP標記的二抗；最后使用ECL發(fā)光試劑盒進行蛋白檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，采用北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)的分析系統(tǒng)進行分析。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間采用t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 半枝蓮總黃酮對荷瘤小鼠體重及一般狀態(tài)的影響 對照組小鼠隨著腫瘤的快速生長，精神狀態(tài)不佳，進食、飲水量及活動量明顯減少，但是隨著腫瘤的生長，荷瘤小鼠體重卻迅速增加；雷帕霉素組小鼠精神狀態(tài)較好，進食、飲水量及活動量明顯增多，腫瘤體積較小，故體重低于模型組，在用藥第7，9，11天，與對照組有顯著性差異（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；半枝蓮總黃酮各劑量組小鼠精神狀態(tài)良好，進食、飲水量、活動量相對于對照組有所增加，在荷瘤狀態(tài)下，體重低于對照組，其中TFSB高劑量組（200 mg·kg-1）在用藥第9，11天與對照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），見圖1。

3.2 半枝蓮總黃酮對荷瘤小鼠黑色素瘤體積的影響 對照組小鼠腫瘤組織生長迅速，腫瘤體積在實驗第5日開始迅速增大；雷帕霉素組小鼠腫瘤生長較慢、腫瘤體積較小，于實驗第5日，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05），于實驗第7，9，11日，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001）；半枝蓮總黃酮各劑量組小鼠腫瘤組織生長較對照組比較有所減慢，其中TFSB高劑量組（200 mg·kg-1）在用藥第7，9，11日，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01或P<0.001），TFSB中、低劑量組（100，50 mg·kg-1）分別在用藥第9，11日，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05），見圖2。

3.3 半枝蓮總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 對照組小鼠腫瘤質(zhì)量較大，雷帕霉素組小鼠腫瘤質(zhì)量較輕，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001）；半枝蓮總黃酮各劑量組小鼠腫瘤均有所減輕，其中TFSB高劑量組（200 mg·kg-1）與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001），TFSB中、低劑量組（100，50 mg·kg-1）與對照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.4 半枝蓮總黃酮對腫瘤組織細胞凋亡的影響 TUNEL法染色檢測腫瘤組織細胞凋亡情況，經(jīng)過JEdA801D形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)分析可知，陽性凋亡細胞的細胞核被染色呈棕黃色。結(jié)果顯示，對照組腫瘤細胞凋亡數(shù)較少，只見散在零星的凋亡細胞；雷帕霉素組小鼠腫瘤組織內(nèi)凋亡細胞數(shù)較多，鏡下可見大量成塊狀的棕黃色染色的陽性凋亡細胞，其凋亡指數(shù)明顯升高，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001）；TFSB各劑量組（200，100，50 g·kg-1）腫瘤組織內(nèi)，凋亡細胞數(shù)較多，細胞凋亡指數(shù)升高，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001），這與腫瘤體積及質(zhì)量分析結(jié)果一致，見圖3。

3.5 半枝蓮總黃酮對腫瘤組織細胞自噬的影響 LC3是檢測自噬體最常用的標記，LC3Ⅱ于LC3Ⅰ的相對表達量代表著自噬水平的高低。實驗結(jié)果顯示：雷帕霉素組小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05），表明雷帕霉素可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬；TFSB各劑量（200，100，50 mg·kg-1）LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05），表明半枝蓮總黃酮對腫瘤細胞的自噬也有一定的促進作用，見圖4。

3.6 半枝蓮總黃酮對腫瘤組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達的影響 對照組腫瘤細胞內(nèi)pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白表達較多，表明此通路處于激活狀態(tài)；雷帕霉素組腫瘤細胞內(nèi)pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白表達明顯減少，其相對表達量降低，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001）；半枝蓮總黃酮各劑量組可顯著抑制腫瘤組織內(nèi)pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白的表達，其中TFSB高劑量組（200 mg·kg-1）與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001），TFSB中、低劑量組（100，50 mg·kg-1）對pPI3K的抑制，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.001），對pAKT，pmTOR的抑制，與對照組比較有顯著性差異（P<0.01），見圖5。

4 討論

半枝蓮黃酮類化合物是半枝蓮中主要的活性成分，目前已分離鑒定的黃酮類化合物近50種，主要包括芹菜素、野黃芩苷、木犀草素和黃芩苷等，具有保護心腦血管、抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性。近年來對半枝蓮黃酮類化合物抗腫瘤活性的研究顯示：半枝蓮總黃酮可通過線粒體途徑誘導(dǎo)MHCC97H細胞的凋亡[5]，并且通過降低MMP和TIMP的表達降低MHCC97H細胞的轉(zhuǎn)移能力[6]，通過調(diào)節(jié)VEGF抑制體內(nèi)外血管新生[7]。半枝蓮中黃酮與順鉑聯(lián)用可提高人卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，與順鉑之間產(chǎn)生協(xié)同作用[8]。本研究結(jié)果顯示，半枝蓮總黃酮對B16F1黑色素瘤細胞小鼠移植瘤具有顯著的抑制作用，使腫瘤體積明顯縮小、瘤重減輕、抑瘤率增加，并且可以顯著升高腫瘤細胞凋亡指數(shù)，與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01或P<0.001），與文獻報道一致。

自噬是作為溶酶體的主要降解途徑之一，使胞內(nèi)分子和細胞器得以循環(huán)利用。研究表明，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著既能促進、又能抑制的雙重作用。一方面，自噬可以作為一種防御機制，防止胞質(zhì)內(nèi)受損細胞器和代謝產(chǎn)物的堆積，保護受損的腫瘤細胞；另一方面，自噬的活性過強，又會使得溶酶體的降解能力不能滿足降解自噬體的需要，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生Ⅱ型程序性細胞死亡，與凋亡共同促進細胞死亡[9]。因此，自噬的發(fā)生在腫瘤中起著至關(guān)重要的作用，并有可能為腫瘤的防治提供新的思路。

LC3是檢測自噬活性最為常用的標志蛋白，LC3Ⅰ為胞質(zhì)分散型、LC3Ⅱ為膜結(jié)合型，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ會轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，因此LC3Ⅱ于LC3Ⅰ的相對表達量能大致反應(yīng)自噬水平的高低[10]。在進行SDS凝膠電泳時，LC3Ⅱ（14 kDa）比LC3Ⅰ（16 kDa）移動得更快，因此可以通過Western blot檢測LC3Ⅰ，LC3Ⅱ的蛋白表達水平。實驗結(jié)果顯示，半枝蓮總黃酮各劑量組可以顯著升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)果表明半枝蓮總黃酮可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的自噬，這種作用可能與其抗腫瘤作用相關(guān)。

PI3K是一種廣泛存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，能被許多細胞因子受體活化，使得磷脂酰肌醇（PI）在D3 位的磷酸化，促進PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3。AKT則可以接受PI3K的信號，通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，將信號向下傳遞到mTOR。mTOR可通過AKT直接或間接磷酸化而被激活，磷酸化的mTOR一方面能夠使得細胞周期素上調(diào)而加速細胞周期，另一方面，也可以通過清除泛素蛋白從而抑制自噬的發(fā)生，由此可見，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活將對自噬起到抑制作用[11]。本研究通過檢測腫瘤組織PI3K/AKT/mTOR通路標志蛋白磷酸化的水平，來考察半枝蓮總黃酮誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制，結(jié)果顯示：半枝蓮總黃酮各劑量組可顯著抑制pPI3K，pAKT，pmTOR的蛋白表達，與對照組比較有極顯著性差異（P<0.01或P<0.001）。表明半枝蓮總黃酮可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化，此作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬具有一定的關(guān)系。

綜上所述，半枝蓮總黃酮可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬、促進腫瘤細胞的自噬性死亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化有關(guān)。但是，本研究也有一些不足之處，例如只使用了自噬促進劑（mTOR抑制劑雷帕霉素）正面論證了自噬和腫瘤發(fā)生的關(guān)系，為了更好探討這種關(guān)系，最好還要使用自噬抑制劑從反面論證，這部分研究，本課題組將在細胞實驗中完成。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]