桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑HPLC指紋圖譜相關(guān)性研究

王曉亞，甄亞欽，王鑫國(guó)，姜國(guó)志，牛麗穎，

?

桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑HPLC指紋圖譜相關(guān)性研究

王曉亞1，甄亞欽2，3，王鑫國(guó)2，3，姜國(guó)志3，4，牛麗穎1，2，3

1.河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊 050017；2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050091； 3.河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050091；4.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北石家莊 051430

目的 采用HPLC對(duì)桂枝配方顆粒、飲片和水煎劑的指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)性研究，考察三者之間化學(xué)成分的差異。方法 采用Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。分別建立10批桂枝配方顆粒、10批飲片、10批水煎劑的指紋圖譜。結(jié)果 桂枝配方顆粒HPLC指紋圖譜中的12個(gè)共有峰均可在水煎劑中得到追蹤，有10個(gè)可在飲片中得到追蹤，并指認(rèn)出原兒茶酸、香豆素、肉桂酸3種成分。結(jié)論 桂枝配方顆粒與水煎劑的主要化學(xué)成分組成基本相同，其共有成分含量比例接近。

桂枝配方顆粒；飲片；水煎劑；高效液相色譜法；指紋圖譜；相關(guān)性；肉桂酸

桂枝為樟科植物肉桂Presl的干燥嫩枝，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽(yáng)化氣的功效，用于治療風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛、血寒經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、痰飲、水腫、心悸、奔豚[1]。桂枝主要含有揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、多糖類、甾體類、香豆素類及鞣質(zhì)類等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗腫瘤、利尿等藥理作用[2-4]。肉桂酸和原兒茶酸屬于有機(jī)酸類成分，肉桂酸具有抗菌、升高白細(xì)胞、利膽、抗突變、誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)和抗侵襲等藥理作用，原兒茶酸是抗炎、抗菌的活性成分[5]。

桂枝配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的桂枝飲片作為原料，經(jīng)提取、濃縮、噴霧干燥、制粒等現(xiàn)代化制備工藝加工而成，解決了傳統(tǒng)湯劑制備和使用不方便的問(wèn)題，具有免煎易服、起效快、攜帶方便、安全衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)。中藥配方顆粒經(jīng)一系列制備工藝加工制成后，在性狀和顯微鑒別上已完全不同于原飲片，無(wú)法以此評(píng)價(jià)其質(zhì)量，因此，對(duì)中藥配方顆粒制定有效可行、重復(fù)性好的質(zhì)量控制方法意義重大[6-7]。本研究采用HPLC方法分別建立了桂枝配方顆粒、飲片和水煎劑的指紋圖譜，并比較三者主要化學(xué)成分的差異，旨在為桂枝配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究及其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-15C高效液相色譜儀（LC-15C泵，SPD-15C型紫外檢測(cè)器，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-15C柱溫箱，島津LC色譜工作站），日本島津；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），北京迪馬；TB-215D電子天平（十萬(wàn)分之一）、BSA224S-CW電子天平（萬(wàn)分之一），德國(guó)賽多利斯。

原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)151123，純度≥98.0%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；香豆素對(duì)照品（批號(hào)TM0520CA14，純度≥98.0%），上海源葉生物科技有限公司；肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)110786-200503，純度100.0%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；10批桂枝飲片分別來(lái)自廣東（編號(hào)Y1～Y4）、廣西（編號(hào)Y5～Y10），經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)院主任中藥師孫寶惠老師鑒定為樟科植物肉桂Presl的干燥嫩枝；10批桂枝水煎劑（編號(hào)S1～S10），嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》藥材煎煮方法相關(guān)要求制備；桂枝配方顆粒，由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司（7批中試小樣，編號(hào)K1～K7；3批中試成品，批號(hào)15051411、15061411、15052711）及其他5個(gè)中藥配方顆粒試點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè)（批號(hào)1509001S、1507005、5070291、15018592、1507009）提供；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-0.1%磷酸（A），梯度洗脫（0～25 min，10%→20%B；25～48 min，20%→35%B；48～58 min，35%B；58～60 min，35%→90% B；60～68 min，90%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取原兒茶酸對(duì)照品、香豆素對(duì)照品、肉桂酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含原兒茶酸10 μg、香豆素20 μg、肉桂酸23 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取10批桂枝配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，即得桂枝配方顆粒供試品溶液；取10批桂枝飲片，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，各取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照配方顆粒制備方法制備得桂枝飲片供試品溶液；稱取粉碎后的10批桂枝飲片各10 g，加水，浸泡30 min，煎煮，保持微沸30 min，倒出煎液，藥渣再分別加水煎煮2次，時(shí)間分別為30、20 min，合并3次煎液，過(guò)濾，真空減壓濃縮，濃縮液真空干燥，得干浸膏，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照配方顆粒制備方法制備得桂枝水煎劑供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

選擇峰11作為參照峰，計(jì)算12個(gè)主要特征峰的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）、相對(duì)峰面積（RPA）的RSD值。以桂枝配方顆粒（批號(hào)15051411）進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備桂枝配方顆粒供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度。結(jié)果各主要特征峰RRT的RSD為0.02%～0.11%，RPA的RSD為0.34%～1.98%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備桂枝配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果各主要特征峰RRT的RSD為0.01%～0.19%，RPA的RSD為0.51%～1.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份桂枝配方顆粒供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各主要特征峰RRT的RSD為0.01%～0.09%，RPA的RSD為0.47%～1.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析

2.5.1 桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑指紋圖譜的建立 按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備10批桂枝配方顆粒（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供）、飲片、水煎劑的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄64 min色譜圖，將所得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用多點(diǎn)校正將譜峰自動(dòng)匹配，平均數(shù)法計(jì)算得出樣品指紋圖譜的共有模式，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。其中，確定了10批桂枝配方顆粒12個(gè)共有峰，并指認(rèn)了峰1為原兒茶酸、峰9為香豆素、峰11為肉桂酸，見(jiàn)圖4。

注：A.混合對(duì)照品；B.桂枝配方顆粒供試品； 1.原兒茶酸；9.香豆素；11.肉桂酸

2.5.2 指紋圖譜相關(guān)性分析 采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算相似度，10批桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑指紋圖譜的相似度見(jiàn)表1。10批桂枝配方顆粒指紋圖譜的相似度均在0.99以上，說(shuō)明桂枝配方顆粒的相似度很高，產(chǎn)品制劑工藝穩(wěn)定；10批桂枝飲片指紋圖譜的相似度均在0.86以上；10批桂枝水煎劑指紋圖譜的相似度均在0.98以上，說(shuō)明10批桂枝水煎劑有良好的相似性。比較桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑的指紋圖譜，對(duì)共有峰進(jìn)行分析可知，桂枝配方顆粒12個(gè)特征峰在水煎劑中均能得到追蹤，而桂枝飲片6、12號(hào)峰缺失，其他10個(gè)峰均存在，說(shuō)明桂枝配方顆粒與水煎劑化學(xué)成分基本一致，桂枝飲片經(jīng)高溫提取、濃縮等工藝處理后可能產(chǎn)生了新的成分，見(jiàn)圖5。

表1 10批桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑指紋圖譜的相似度（r）

注：A.飲片；B.配方顆粒；C.水煎劑

2.6 不同廠家桂枝配方顆粒指紋圖譜的建立

分別取市售6個(gè)廠家桂枝配方顆粒適量，研細(xì)，取不同量的配方顆粒使之均相當(dāng)于3.6 g飲片，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（取樣量見(jiàn)表2），分別進(jìn)樣10 μL，采集6個(gè)不同廠家桂枝配方顆粒指紋圖譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)圖6、表3。

表2 不同廠家桂枝配方顆粒取樣量

表3 不同廠家桂枝配方顆粒指紋圖譜的相似度（r）

3 討論

中藥配方顆粒在制備過(guò)程中有效成分已被煮提出來(lái)，因此制備供試品溶液時(shí)采用超聲溶解即可。本試驗(yàn)對(duì)提取溶劑的種類和提取時(shí)間進(jìn)行了考察。分別以50%、70%、100%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，以50%甲醇作為提取溶劑時(shí)色譜峰數(shù)量較多、強(qiáng)度較大，故選用50%甲醇作為提取溶劑；選擇10、20、30 min進(jìn)行提取時(shí)間考察，結(jié)果超聲20、30 min比超聲10 min效果好，超聲20 min與30 min差別不大，故采用20 min為提取時(shí)間。

試驗(yàn)中采用DAD檢測(cè)器對(duì)桂枝配方顆粒供試品溶液進(jìn)行了紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，肉桂酸在280 nm處呈現(xiàn)最大吸收，且譜圖中出現(xiàn)的色譜峰數(shù)目較多，峰形和分離度良好，基線平穩(wěn)，故采用280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在共有峰研究中，以峰面積及響應(yīng)值最大的11號(hào)峰即肉桂酸峰為S峰。將桂皮醛對(duì)照品進(jìn)樣對(duì)照，發(fā)現(xiàn)桂枝飲片中含有大量桂皮醛，但桂枝配方顆粒和水煎劑中未能檢測(cè)到。桂皮醛屬于揮發(fā)油類成分，可能在高溫提取、濃縮、干燥等制備過(guò)程中損失了。

試驗(yàn)中比較了10批桂枝飲片的指紋圖譜，結(jié)果相似度偏低，說(shuō)明不同批次飲片主要化學(xué)成分含量比例差別較大，可能與原藥材的產(chǎn)地和采收時(shí)間等因素有關(guān)。

本試驗(yàn)將市售不同廠家的桂枝配方顆粒的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同廠家桂枝配方顆粒指紋圖譜的相似度均在0.99以上，說(shuō)明6個(gè)廠家生產(chǎn)的桂枝配方顆粒主要化學(xué)成分基本相同，其共有成分含量比例接近。

本試驗(yàn)采用HPLC對(duì)桂枝配方顆粒進(jìn)行指紋圖譜研究，方法學(xué)考察中精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RRT和RPA均RSD＜2.0%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可行、重復(fù)性良好，能較全面地反映桂枝配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，為桂枝配方顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

桂枝配方顆粒、飲片、水煎劑指紋圖譜的主要色譜峰基本一致，尤其配方顆粒與水煎劑指紋圖譜的相似度高達(dá)0.98以上，說(shuō)明桂枝配方顆粒與水煎劑主要化學(xué)成分基本等同，為桂枝配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供了參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：276.

[2] 劉萍,張麗萍.桂枝化學(xué)成分及心血管藥理作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(10)：1926-1927.

[3] 楊琳,趙慶春,譚菁菁,等.桂枝的化學(xué)成分研究[J].實(shí)用藥物與臨床, 2010,13(3)：183-185.

[4] 趙菊宏,劉書苑.桂枝的藥理作用和臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)信息(中旬刊), 2011,24(4)：1575.

[5] 許源,宿樹蘭,王團(tuán)結(jié),等.桂枝的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材,2013,36(4)：674-678.

[6] 韋紅言,溫慶偉,陸東,等.虎杖飲片、水煎劑、配方顆粒高效液相色譜特征圖譜相關(guān)性研究[J].中國(guó)藥業(yè),2014,23(18)：37-39,40.

[7] 于姍姍,李敏,張秋紅.中藥配方顆粒的指紋圖譜研究進(jìn)展[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師,2016,13(1)：38-40.

Correlation of HPLC Fingerprint Chromatograms of Cinnamomi Ramulus Formula Granules, Decoction Pieces and Water Decoction

WANG Xiao-ya1, ZHEN Ya-qin2,3, WANG Xin-guo2,3, JIANG Guo-zhi3,4, NIU Li-ying1,2,3

Objective To study the correlation of fingerprint chromatograms of Cinnamomi Ramulus formula granules, decoction pieces and water decoction by HPLC; To investigate the difference of main chemical constituents among different forms. Methods The Diamonsil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used with mobile phase of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min, with detection wave of 280 nm and temperature of 30 ℃. The detection of 10 batches of Cinnamomi Ramulus formula granules, 10 batches of decoction pieces and 10 batches of water decoction were established respectively. Results Totally 12 peaks in the HPLC fingerprint chromatogram from 10 batches of formula granules could be tracked in the water decoction; 10 peaks in the HPLC fingerprint chromatogram could be tracked in the decoction pieces. Three components, such as protocatechuic acid, coumarin and cinnamic acid were verified. Conclusion The main chemical components of Cinnamomi Ramulus formula granules and water decoction are basically the same, and the common component contents have similar proportion.

Cinnamomi Ramulus formula granules; decoction pieces; water decoction; HPLC; fingerprint chromatogram; correlation; cinnamic acid

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.022

R284.1

A

1005-5304(2017)06-0087-04

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2015001）

牛麗穎，E-mail：niuliyingyy@163.com

（2016-10-18）

（修回日期：2016-11-08；編輯：陳靜）