我國小反芻獸疫病毒H基因序列分析

李飛+李岳洋+張路瑤+馬海璐+張保軍+蔣秀梅+馬世強(qiáng)+趙麗+劉永宏

摘要：為了分析我國小反芻獸疫疫情的特點(diǎn)，從GenBank下載我國和其他國家小反芻獸疫病毒（PPRV）毒株H基因全序列，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件DNAStar進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，始于2007年的我國首次PPR疫情中，我國西藏地區(qū)PPRV 各毒株間H基因核苷酸同源性介于99.6%～100.0%之間，我國西藏與其他國家PPRV毒株核苷酸同源性介于86.7%～983%之間；我國西藏地區(qū)PPRV毒株間氨基酸序列同源性介于99.7%～100.0%之間，我國西藏與其他國家PPRV毒株氨基酸序列同源性介于89.3%～98.4%之間。始于2013年年底的我國又一次PPR疫情中，我國PPRV毒株間核苷酸同源性介于99.7%～99.8%之間，我國與其他國家PPRV毒株核苷酸同源性介于87.2%～975%之間；我國PPRV毒株間氨基酸序列同源性介于99.2%～99.8%之間，我國與其他國家PPRV毒株氨基酸序列同源性介于89.0%～984%之間。H基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，我國的9株P(guān)PRV劃分為基因Ⅳ系。我國PPRV毒株與印度毒株及土耳其毒株同源性最高，可能由這2個(gè)國家傳入我國。

關(guān)鍵詞：小反芻獸疫；H基因；序列分析；核苷酸同源性；氨基酸同源性

中圖分類號(hào)： S855.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0149-04

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，簡稱PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，簡稱PPRV）感染小反芻動(dòng)物（綿羊、山羊、鹿、長角大羚羊和駱駝等）引起的的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床以高熱、口炎、腸炎和肺炎為特征。

PPR最初報(bào)道于非洲西部象牙海岸的科特迪瓦[1]，隨后傳播到西非國家。1987年出現(xiàn)了跨洲傳播，由非洲傳入亞洲國家。1993—1995年間在阿拉伯半島、中東地區(qū)及南亞次大陸地區(qū)逐漸流行[2-5]。2006年初，我國周邊國家暴發(fā)了大規(guī)模PPR疫情[6]；2007年7月，我國西藏阿里地區(qū)首次暴發(fā)PPR疫情；2010年贊比亞、不丹相繼暴發(fā)PPR疫情；2015年7月摩洛哥、贊比亞暴發(fā)PPR疫情；2016年2月格魯吉亞暴發(fā)PPR疫情。

依據(jù)我國農(nóng)業(yè)部消息，2003年我國周邊國家頻頻發(fā)生PPR疫情[7]。2007年7月9日西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣龍門卡村首次發(fā)現(xiàn)PPR疫情[8]。2007年11月15日，先后在西藏自治區(qū)阿里地區(qū)改則、札達(dá)、日土、革吉等4個(gè)縣發(fā)現(xiàn)疫情。2010年5月14日，西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣烏江村發(fā)生1起PPR疫情。2013年，我國農(nóng)業(yè)部報(bào)道新疆多地區(qū)發(fā)生疫情，并呈現(xiàn)由邊境逐漸向內(nèi)傳播的趨勢[9]。2013年11月30日，新疆伊犁霍城縣發(fā)生PPR疫情[10]。2013年12月份，新疆哈密、輪臺(tái)、庫車、柯坪等縣發(fā)生了PPR疫情。2014年1月份在我國新疆、西藏等地發(fā)生5起疫情，甘肅省武威市古浪縣于1月22日發(fā)生PPR疫情[11]。2014年2月寧夏、內(nèi)蒙古等地區(qū)發(fā)生PPR疫情；2月10日，內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市杭錦后旗團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)建設(shè)村、烏拉特后旗烏蓋蘇木和豐村發(fā)生PPR疫情[12]；3月初，修水縣發(fā)生PPR疫情[13]。2014年3月17日，遼寧省錦州市發(fā)生PPR疫情[14]。2014年3月18日，黑山縣白廠門鎮(zhèn)閆屯村發(fā)生PPR疫情[15]。2014年5月2日南寧市某養(yǎng)殖場羊群經(jīng)確診為PPRV感染，出現(xiàn)PPR疫情[16]。

PPRV分子屬副黏病毒科麻疹病毒屬，基因組為單股負(fù)鏈RNA，病毒大小為15 948 nt，基因組包括6個(gè)基因，分別編碼8種蛋白，即N蛋白、P蛋白、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）、大蛋白（L）和C、V非結(jié)構(gòu)蛋白[17]。H蛋白是副黏病毒表面的一種糖蛋白，基因全長1 852 bp，該蛋白由609個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為70 ku。H蛋白是PPRV編碼的8種蛋白中最不保守的蛋白，是一種跨膜蛋白。H糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，能引起細(xì)胞病變（CPE），但是對(duì)山羊、綿羊、猴、豬、牛、馬、犬等大多數(shù)哺乳動(dòng)物和禽類的紅細(xì)胞不具有凝集性[18]。研究發(fā)現(xiàn)，H蛋白存在多個(gè)翻譯后的修飾位點(diǎn)，包括6個(gè)糖基化位點(diǎn)G1～G6（G5和G6未被糖基化），不同麻疹病毒及同一病毒的不同菌株之間糖基化位點(diǎn)的數(shù)目有所不同，糖基化對(duì)血凝素神經(jīng)氫酸酶（HN）的翻譯后加工、神經(jīng)氨酸酶活性以及穩(wěn)定性等起著重要的作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

從GenBank下載我國和世界各PPR發(fā)病國家已登錄的PPRV H基因全序列、GenBank登錄號(hào)和毒株名稱等信息（表1）。

1.2試驗(yàn)方法

下載的氨基酸和核苷酸序列用DNAStar分子生物學(xué)軟件包EditSeq程序分別生成“*.Pro”和“*.Seq”格式文件，首先利用DNAStar軟件包MegAlign程序中File菜單下的 Enter sequences將需要比對(duì)的基因序列添加進(jìn)來，然后利用Align菜單下的Clustal W Method進(jìn)行多重比對(duì)，最后用Veiw菜單下的Sequence Distance程序和Phylogenetic Tree程序進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)合毒株年代和地域分布特點(diǎn)，分析我國PPRV毒株的進(jìn)化規(guī)律。

2結(jié)果與分析

2.1PPRV H基因核苷酸同源性

將22個(gè)來源不同的PPRV毒株H基因全序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，由表2可知，2007年P(guān)PR疫情初次傳入我國時(shí)，我國西藏地區(qū)各毒株間H基因核苷酸同源性介于 99.6%～100.0%之間；我國西藏China/Tibet/Geg/07與China/Tib/07毒株的核苷酸同源性為100.0%，China/Tibet/0701與China/Tib/07毒株的核苷酸同源性為99.9%，那曲地區(qū)Tibet/Bharal/2008與阿里地區(qū)China/Tib/07毒株的核苷酸同源性為99.7%。我國西藏毒株與其他國家毒株核苷酸同源性介于86.7%～98.3%之間，同源性最高的為印度1994年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。2013年當(dāng)PPR疫情再次傳入我國時(shí)，我國各毒株間核苷酸的同源性介于99.7%～99.8%之間；我國新疆伊犁China/XJYL/2013毒株與吉林省GZL-14毒株、河南省China/HNZM/2014毒株的同源性最高，為99.8%。我國毒株與其他國家毒株核苷酸同源性介于87.2%～97.5%之間，同源性最高的為印度1994年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。

2.2PPRV H蛋白氨基酸序列同源性

將22個(gè)來源不同的PPRV毒株H蛋白全序列進(jìn)行氨基酸序列同源性比較，由表2可知，2007年我國PPR疫情暴發(fā)初期，我國西藏地區(qū)各毒株間的氨基酸序列同源性介于997%～100.0%之間；我國西藏阿里地區(qū)的3株毒株氨基酸序列同源性為100.0%，那曲地區(qū)Tibet/Bharal/2008和阿里地區(qū)China/Tib/07毒株的氨基酸序列同源性為99.7%。我國西藏毒株與其他國家毒株氨基酸序列同源性介于 89.3%～98.4%之間，同源性最高的為土耳其2000年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。2013年當(dāng)PPR再次傳入我國時(shí)，我國各毒株的氨基酸序列同源性介于99.2%～99.8%之間，河南省China/HNZM/2014毒株、新疆伊犁 China/XJYL/2013 毒株和吉林省GZL-14毒株的同源性最高，為99.8%。我國毒株與其他國家毒株氨基酸序列同源性介于89.0%～98.4%之間，同源性最高的為土耳其2000年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。

2.3PPRV H基因核苷酸進(jìn)化樹

有文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)F基因或N基因進(jìn)行遺傳變異分析和分子流行病學(xué)研究可將全球PPRV的流行株分成Ⅰ～ Ⅳ 4個(gè)譜系。將22個(gè)來源不同的PPRV毒株H基因核苷酸全序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，來自塞內(nèi)加爾的1個(gè)毒株單獨(dú)構(gòu)成1個(gè)分支（Ⅰ系）；分離自西非科特迪瓦的1個(gè)毒株及尼日利亞的2個(gè)毒株和非洲西部加納的1個(gè)毒株共同構(gòu)成了1個(gè)分支（Ⅱ系）；來自亞洲阿曼、阿拉伯聯(lián)合酋長國和非洲東北部埃塞俄比亞、非洲東部肯尼亞及非洲中部烏干達(dá)的毒株構(gòu)成了1個(gè)分支（Ⅲ系）；11個(gè)亞洲毒株（包含9個(gè)我國毒株）和1個(gè)非洲西北部摩洛哥的毒株構(gòu)成了1個(gè)分支（Ⅳ系）。我國分離的9株毒株與印度1994年的毒株進(jìn)化關(guān)系最近，與阿曼、阿拉伯聯(lián)合酋長國、埃塞俄比亞、肯尼亞和烏干達(dá)的毒株進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。而我國新疆伊犁地區(qū)China/XJYL/2013毒株和河南省China/HNZY/2014毒株進(jìn)化關(guān)系最近，我國吉林省GZL-14毒株與河南省China/HNZK/2014毒株進(jìn)化關(guān)系最近（圖1）。

3討論

2007年P(guān)PR疫情初次傳入我國時(shí)，將我國西藏毒株與世界其他國家毒株的PPRV H基因核苷酸進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，我國西藏毒株與其他國家毒株核苷酸同源性最高的為印度1994年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株，推測造成該現(xiàn)象的原因有以下幾點(diǎn)：首先從地理位置來看，我國西藏東南部與印度接壤，疫情最有可能從印度傳入西藏地區(qū)；其次我國周邊國家中印度的PPR疫情最為嚴(yán)重，有研究表明我國西藏的毒株與印度等國流行毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系最近[19]，所以說同源性最高很有說服力。2013年P(guān)PR疫情再次傳入我國新疆伊犁，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的我國吉林省、河南省的毒株進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果顯示我國新疆伊犁China/XJYL/2013毒株和吉林省GZL-14毒株的同源性最高，推測造成這一現(xiàn)象的原因可能是利益驅(qū)動(dòng)下的羊群交易，導(dǎo)致疫病從新疆通過病羊、隱性感染羊、交通運(yùn)輸車輛等傳到吉林省。我國毒株與其他國家毒株核苷酸同源性最高的為印度1994年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。由于疫病的流行遵循“三間”分布的原則（即時(shí)間、地區(qū)間、畜禽群間），從時(shí)間分布來看我國西藏阿里地區(qū)最早暴發(fā)PPR疫情，從地區(qū)分布來看印度與我國西藏周鄰，PPR很有可能跨越喜馬拉雅山傳入我國西藏地區(qū)，畜禽間主要感染綿羊、山羊和羚羊等小反芻動(dòng)物，而我國和印度邊境地區(qū)野生小反芻動(dòng)物的頻繁接觸也可以導(dǎo)致疫病的傳播，同樣可以說明我國與印度1994年毒株關(guān)系最近。

通過氨基酸序同源性比較發(fā)現(xiàn)，2007年我國PPR疫情暴發(fā)初期，通過我國西藏毒株與其他國家毒株的PPRV H蛋白氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，我國西藏地區(qū)各毒株間氨基酸序列的同源性介于99.7%～100.0%之間，我國西藏毒株與其他國家毒株氨基酸序列同源性最高的為土耳其2000年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株。1993—1995年，PPR在阿拉伯半島、中東地區(qū)及印度次大陸及南亞次大陸部分地區(qū)逐漸流行，包括阿聯(lián)酋、伊朗、伊拉克、敘利亞和土耳其均發(fā)現(xiàn)PPR疫情的存在。由于土耳其周邊國家都有PPR疫情的發(fā)生，推測PPR可能是從土耳其傳播到伊朗、巴基斯坦和印度然后傳入我國。因此，氨基酸序列同源性最高也很有可能。2013年P(guān)PR疫情再次傳入我國新疆伊犁，通過新疆伊犁毒株與我國吉林省、河南省的毒株氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，我國新疆伊犁China/XJYL/2013毒株與河南省China/HNZM/2014毒株的氨基酸同源性最高。我國毒株與其他國家毒株氨基酸同源性最高的為土耳其2000年毒株，同源性最低的為烏干達(dá)2012年毒株，與2007年我國西藏第1次疫情氨基酸的比對(duì)結(jié)果一致。

有文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)F基因或N基因進(jìn)行遺傳變異分析和分子流行病學(xué)研究，可將全球的流行株分為Ⅰ～ Ⅳ譜系，Kwiatek等利用PPRV N基因1 253～1 507位核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，將來源不同的PPRV毒株劃分為4個(gè)系，其中基因Ⅰ系由分離自西非的病毒組成，基因Ⅱ系由來源于尼日利亞、加納、馬里的病毒構(gòu)成，基因Ⅲ系病毒來自阿拉伯半島南部和東非，基因Ⅳ系的病毒全部來源于亞洲[20]。本研究利用PPRV H基因全序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將22個(gè)來源不同的PPRV毒株劃分基因系，結(jié)果顯示我國西藏2007年和2008年、新疆伊犁2013年、河南省2014年、吉林省2014年、印度1994年、土耳其2000年以及摩洛哥2008年的流行毒株均可劃分到第Ⅳ譜系，與Kwiatek等利用PPRV N基因的核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化分析所劃分的譜系[20]一致。我國的9個(gè)毒株均被劃分到第Ⅳ譜系，與Kwiatek等的研究相符合。由于摩洛哥是非洲西北部的一個(gè)國家，按照Kwiatek等的劃分依據(jù)應(yīng)將其劃分到第Ⅰ譜系，本研究將其劃分到第Ⅳ譜系，所以與Kwiatek等的研究結(jié)果[20]產(chǎn)生了矛盾，而之前劉永宏等通過PPRV F和N基因同源性比較也證明了摩洛哥2008年毒株被劃分到了第Ⅳ譜系[21]。阿曼、阿拉伯聯(lián)合酋長國和非洲東北部埃塞俄比亞、肯尼亞和烏干達(dá)的毒株構(gòu)成了1個(gè)分支（Ⅲ系）與Kwiatek等的結(jié)果[20]一致，尼日利亞、科特迪瓦和加納的毒株被劃分到了第Ⅱ譜系，與Kwiatek等的結(jié)果[20]相符，來自塞內(nèi)加爾的1個(gè)毒株被劃分到第Ⅰ譜系，這與 Kwiatek 等的結(jié)論[20]相符。

PPRV在動(dòng)物體內(nèi)繁殖期間是否會(huì)傳播病毒還不確定，存在散毒和毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)；血清學(xué)檢測也不能區(qū)分自然感染（感染抗體）和疫苗免疫（免疫抗體）的動(dòng)物。目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的PPR抗原檢測方法為PCR和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。建議我國與PPR發(fā)生國相鄰的省份加強(qiáng)活羊調(diào)運(yùn)和進(jìn)出口疫病檢測工作，尤其是新疆、西藏2個(gè)地區(qū)是我國疫病最難以控制的地區(qū)。2013年新疆伊犁再次暴發(fā)PPR疫情，我國農(nóng)業(yè)部將新疆和西藏定為強(qiáng)制免疫的地區(qū)。新疆歷史上從來沒有PPR疫情報(bào)道，2013年新疆伊犁PPR疫情的發(fā)生存在2種可能：（1）當(dāng)PPR可以跨越喜馬拉雅山傳入我國西藏地區(qū)時(shí)，可以推測存在新疆伊犁暴發(fā)的PPR是由西藏通過昆侖山脈傳入的可能性；（2）我國新疆伊犁地區(qū)的PPR也可能由于活羊調(diào)運(yùn)時(shí)病羊、隱性感染羊、交通運(yùn)輸車輛等攜帶的病原傳播導(dǎo)致的。自從2013年我國新疆伊犁暴發(fā)PPR以來疫情由北疆迅速傳播至南疆多地，此后疫情迅速播至全國20多個(gè)?。▍^(qū)），而造成PPR的傳播這一現(xiàn)象的原因大多數(shù)也是由于活羊調(diào)運(yùn)機(jī)制的不完善。2014年10月，我國農(nóng)業(yè)部研究起草了《全國小反芻獸疫消滅計(jì)劃（征求意見稿）》，提出到2020年全國消滅PPR的目標(biāo)[22]。2015年歐洲食品安全局（EFSA）發(fā)布了PPR傳入歐盟和鄰近國家的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告[23]，可見PPR對(duì)我國及世界各地養(yǎng)殖業(yè)所造成的危害程度之大。建議各地加強(qiáng)PPR疫病防控的宣傳力度，加強(qiáng)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，且實(shí)驗(yàn)室工作人員具備疫病病原學(xué)檢測能力；強(qiáng)化邊境地區(qū)防控，重點(diǎn)要做好公路、鐵路口岸和港口進(jìn)口易感動(dòng)物及其動(dòng)物性產(chǎn)品的監(jiān)督檢查工作，嚴(yán)防疫情傳播。

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