云南松松針多糖清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化活性研究

李永飛，付文鵬，丁 路，馬增艷，楊永壽

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

云南松松針多糖清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化活性研究

李永飛1，付文鵬1，丁 路1，馬增艷1，楊永壽2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：研究云南松松針多糖清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化的活性。方法：采用DPPH法研究云南松松針多糖清除自由基的能力，用硫代巴比妥酸（TBARS）法研究云南松松針多糖對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的抑制作用，并與維生素C的抗氧化作用進(jìn)行對比，評價其抗脂質(zhì)過氧化能力。結(jié)果：云南松松針多糖對DPPH自由基有較好的清除能力，能抑制肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。結(jié)論：云南松松針多糖對DPPH自由基有清除作用，對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化有抑制作用，表明云南松松針多糖有較好的抗氧化作用。

云南松松針多糖；DPPH自由基；抗氧化；脂質(zhì)過氧化

云南松（Pinus yunnanensis Franch.），又稱飛松、長毛松、青松，為松科松屬常綠喬木。主要分布于云南、西藏、四川、貴州等省區(qū)〔1〕。松針的藥用歷史悠久，明《本草綱目》、魏晉《名醫(yī)別錄》、漢《別錄》、《日華子本草》等歷史文獻(xiàn)明確記載我國用松針來治療疾病，歷史文獻(xiàn)中松針有祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢等功效，治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打腫痛、夜盲癥、高血壓，提高免疫力。目前人們對松針的化學(xué)成分（糖類、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量礦物元素、維生素、抗菌素、生物黃酮類物質(zhì)、莽草酸、精油、葉綠素、木脂素、不飽和脂肪酸、酶與輔酶等〔2〕）、毒理、病理、藥理、生理等方面做了基礎(chǔ)研究工作，并取得豐碩的成果〔3〕。但松針的應(yīng)用多局限于食用、飼用、生產(chǎn)化工原料等方面，因此應(yīng)對豐富的松針資源的藥用價值進(jìn)一步開發(fā)利用。本研究從云南松松針中提取分離得到多糖提取物，采用 DPPH法〔4〕與TBARS法〔5〕相結(jié)合，系統(tǒng)研究多糖提取物清除氧自由基能力和抗脂質(zhì)過氧化的作用效果，并與維生素C的抗氧化性相對比，為云南松松針的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 材料 云南松松針采自云南省大理市大理蒼山；SD昆明大鼠，180~220 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（批號：43004700017373）。

1.1.2 試劑 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京化成工業(yè)株式會社，批號：217-591-8）；硫代巴比妥酸（TBARS，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20150123）；維生素C（上?；瘜W(xué)試劑分裝廠，批號：84-01-10）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2儀器UV2500紫外可見分光光度計（日本島津）；LC-4012型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DFY-200型搖擺高速萬能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；D2KW-4型恒溫水浴鍋（上海科析試驗(yàn)儀器廠）；FDU-2100型冷凍干燥機(jī)（東京理化）；101A-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1松針多糖的提取云南松松針采集后，除雜并切為5~6 cm長，于60℃干燥17 h，自然冷卻，粉碎，備用。以水為溶劑，按料液比1：10（g/mL）進(jìn)行回流提取2 h，過濾，取濾液減壓濃縮、石油醚脫脂脫色，回收石油醚，水層轉(zhuǎn)移至1 000 mL燒杯，加5倍量95%乙醇醇沉24 h，離心沉降，取沉淀，反復(fù)溶解精制2次，得白色沉淀，取提取物加適量蒸餾水溶解，加一定量的氯仿和正丁醇萃取2~3次進(jìn)行脫蛋白。將萃取后的溶液減壓濃縮、冷凍干燥，得白色粉末，即為松針多糖提取物，低溫保存?zhèn)溆谩?〕。

2.2溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的配制 精密稱取“2.1”項(xiàng)制備的松針多糖提取物適量，用蒸餾水配置成1 mg/mL的儲備液，用蒸餾水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的測試液。

2.2.2 DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH 2.2 mg，用無水乙醇配制0.2 mmol/L的溶液，臨用新配。

2.2.3 10%硫代巴比妥酸溶液的配制 精密稱取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中，加少量1 mol/L NaOH溶液溶解，再用10%三氯乙酸定容至刻度，搖勻，即得，臨用新配。

2.2.4 維生素C溶液的配制 精密稱取維生素C 1.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，即得濃度為0.01 mg/mL的儲備液，臨用新配，用時用水稀釋成不同濃度的測試液。

2.3云南松松針多糖對DPPH自由基的清除作用

實(shí)驗(yàn)在10 mL棕色容量瓶進(jìn)行，分為空白管、對照管、藥物底管及藥物管，藥物底管和藥物管中精密加入樣品溶液1.0 mL，空白管和藥物底管精密加入2.0 mL無水乙醇，對照管和藥物管中精密加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，密封，混勻，暗處放置30 min，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，于517 nm下測定吸光度值，按下式計算自由基的清除率：

DPPH·清除率：I（%）=［1－（A樣品－A空白）/A對照］×100%

2.4云南松松針多糖對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用將禁食12 h健康大鼠麻醉后，迅速取肝臟，剪去脂肪及筋膜組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱重后，剪碎。以生理鹽水為勻漿介質(zhì)，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制得10%大鼠肝勻漿（肝臟：生理鹽水=1：9），低溫3 000 r/min離心10 min，取上清液于冰箱中冷凍備用〔7〕。實(shí)驗(yàn)分為空白管、對照管、藥物底管及藥物管，各管所加試劑見表1。

表1 自發(fā)性脂質(zhì)過氧化試驗(yàn)加樣表

將各管搖勻，于37℃恒溫水浴振蕩1 h，對照管和藥物管分別加入10%硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，各管在80℃恒溫水浴加熱15 min，冷卻，3 000 r/min離心10 min，以空白校正，取上清液于532 nm處測定吸光度值，平行操作3次，按下式計算抑制率：

I（%）=［A對-（A藥物管-A藥物底管）］/A對×100%

其中：A對為對照管的吸光度，A藥物管為加入藥物溶液的吸光度，A藥物底管為不加大鼠肝組織勻漿藥物溶液本底的吸光度。

3 結(jié)果

3.1維生素C對DPPH的清除作用維生素C具有很強(qiáng)的抗氧化活性，常被用來作為評價抗氧化能力強(qiáng)弱的參照〔8〕。用“2.2.3”項(xiàng)方法測定維生素C對DPPH自由基的清除曲線。見圖1。根據(jù)計算，IC50值為0.033 6 mg/mL。

圖1 維生素C對DPPH自由基的清除曲線

3.2云南松松針多糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其無水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收。DPPH自由基與松針多糖溶液反應(yīng)后，DPPH自由基的量會減少，在517 nm處的吸光度值會降低，通過計算反應(yīng)后DPPH自由基的清除率評價抗氧化劑的抗氧化能力〔9〕。云南松松針多糖對DPPH自由基清除曲線見圖2。

圖2 云南松松針多糖對DPPH自由基清除曲線

由云南松松針多糖對DPPH自由基清除曲線可知，云南松松針中多糖對DPPH自由基有較強(qiáng)清除能力，但弱于維生素C。隨多糖濃度的增大，其自由基清除率也增大，當(dāng)多糖溶液濃度達(dá)到1.0 mg/mL時對自由基清除能力63.59%，明顯減緩，由此可推測當(dāng)多糖達(dá)到一定濃度時，其清除能力達(dá)到最大。用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)得出松針多糖對DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）為0.6 mg/mL。

3.3云南松松針多糖抗脂質(zhì)過氧化作用丙二醛（MDA）是一種脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。MDA在酸性和高溫條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBARS）反應(yīng)生成紅棕色的三甲雙酮（3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮），其最大吸收波長在532 nm。用TBARS法考察抗氧化劑對MDA的抑制作用，以此評價抗氧化劑抗脂質(zhì)過氧化活性〔10〕。測定0.1、0.6、1.0 mg/mL 3個濃度的云南松松針中多糖對大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的抑制作用。見表2。

表2 云南松松針多糖對大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響

表2 云南松松針多糖對大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響

組別對照管云南松松針多糖溶液質(zhì)量濃度/（mg/m L）—0.1 0.6 1.0抑制率/%—14.70±1.92 31.01±1.84 49.73±1.06

隨著多糖濃度增加，對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化抑制作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)多糖溶液的濃度為1.0 mg/mL時，抑制率為49.73%，可見云南松松針多糖具有一定的抗脂質(zhì)過氧化作用，但作用不強(qiáng)。

4 討論

以維生素C作對照，測定松針多糖對DPPH自由基的清除能力及抗脂質(zhì)過氧化能力，評價其抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南松松針多糖具有一定的抗氧化活性，對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用和抗氧化能力，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除能力都呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但其清除率弱于維生素C。

目前，松針的應(yīng)用情況有松針酒、松針茶、保健飲品、畜牧飼料、香料提取和化工產(chǎn)品制備等。國內(nèi)利用松針中生物活性物質(zhì)的功效試制出的產(chǎn)品有松針口服糖漿、護(hù)膚美容膏、護(hù)膚凍瘡膏、松針跌打油等〔11〕。但是松針內(nèi)的很多功能性成分并沒有得到開發(fā)和利用，如松針具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌等作用〔12〕，并沒有相關(guān)制劑開發(fā)。云南松為西南地區(qū)的鄉(xiāng)土樹種，也是荒山綠化造林先鋒樹種，有著豐富的資源和開發(fā)利用潛力。松針是可持續(xù)利用的再生資源，不受季節(jié)影響，來源廣泛。植物多糖對人體有獨(dú)特的保健功效，許多植物多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染、抗?jié)兊榷喾N生理功能〔12〕。因此云南松松針在保健品開發(fā)和制藥方面具有很好的發(fā)展前景和潛力。

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Research on Pinus yunnanensis Franch Pine Needle Polysaccharide's Effectof Scavenging Free Radical and Anti-lipid Peroxidation

Li Yongfei1,Fu Wenpeng1,Ding Lu1,Ma Zengyan1,Yang Yongshou2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide's effect of scavenging free radical and antilipid perxidation.Methods:DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals of Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide.TBARS was used to study the inhibition effect of Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide on MDA in the mice liver tissue homogenate.The effect was compared with the antioxidation of vitamin C,and its anti lipid peroxidation ability was evaluated as well.Results:Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide extract had certain scavenging effect on DPPH and could inhibit MDA in the mice liver tissue lipid oxidation products of spontaneous generation.Conclusion:Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide extract has scavenging effects on DPPH free radicals,and inhibition effect on rat liver homogenate spontaneous lipid peroxidation,showing that Pinus yunnanensis Franch pine needles polysaccharide has good anti-oxidation action.

Pinus yunnanensis Franch pine needles polysaccharide;DPPHfree radical;lipid perxidation;antioxidant

R285

A

2096-2266（2017）04-0028-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.008

（責(zé)任編輯 李 楊）

大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2015105）；大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃資助項(xiàng)目（CXCY201616）

2016-06-12

2016-09-23

李永飛，2013級藥學(xué)專業(yè)本科生.

*通信作者：楊永壽，高級實(shí)驗(yàn)師.