槲皮素鈣的合成及其生物活性研究

劉秋偉,張會麗,李陽杰,翟廣玉，2*

(1.鄭州工業(yè)應用技術學院 藥學院，河南 鄭州 451150;2.鄭州大學 護理學院，河南 鄭州 450052)

槲皮素鈣的合成及其生物活性研究

劉秋偉1,張會麗1,李陽杰1,翟廣玉1，2*

(1.鄭州工業(yè)應用技術學院 藥學院，河南 鄭州 451150;2.鄭州大學 護理學院，河南 鄭州 450052)

合成了槲皮素鈣，觀察了其生物活性。將槲皮素與醋酸鈣在pH=8.5的條件下加熱回流6h，生成了槲皮素鈣。分析發(fā)現(xiàn)槲皮素鈣紫外光譜帶Ⅰ和帶Ⅱ比槲皮素分別紅移了28nm和8nm；槲皮素鈣的羰基振動頻率υC=O為1647.52cm-1比槲皮素向紅移了15.58cm-1，在高場出現(xiàn)了新的吸收峰υM-O=640.64cm-1，說明有金屬配位鍵生成；氫譜中槲皮素鈣的3-OH和3'-OH上的氫消失，7-OH，5-OH，4'-OH上的氫依然存在，這說明槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。用DPPH法測定了槲皮素鈣與槲皮素的EC50分別是8.17和14.07mg/L，說明槲皮素鈣的清除自由基的能力沒有槲皮素強。

槲皮素；槲皮素鈣；合成；表征；自由基清除能力

前言

鈣是人體必需的營養(yǎng)元素,它能調(diào)節(jié)人體各系統(tǒng)、組織、器官的正常生理功能,人體中每個細胞的活動,都受鈣的制約。骨骼是人體的支架,鈣是骨、牙齒的主要成分。骨、牙齒是人體的鈣庫,它調(diào)節(jié)人體細胞外液的鈣離子濃度，并保持恒定。鈣離子是神經(jīng)和肌肉之間的介質(zhì),始終控制著肌肉的起動、舒張過程。鈣離子通過改變胞漿內(nèi)濃度而直接參與神經(jīng)末梢的傳導過程,神經(jīng)介質(zhì)的釋放、正常肌力的維持都需要鈣離子的參加。很多參與細胞代謝的酶活性都需要鈣離子激活，如三磷酸腺苷酶、脂肪酶、淀粉酶、腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二脂酶、色安酸羥化酶等。鈣離子在機體凝血過程中起著重要作用，機體缺鈣時可能出現(xiàn)出血不止或凝血過度、血液黏稠度過高的癥狀[1，2]。

槲皮素廣泛存在于水果（蘋果、草莓）、蔬菜（洋蔥、蕃茄）、飲料（茶葉、咖啡、紅酒）中[3]，它顯示出多方面的生物活性，是天然的抗氧化劑，特別是具有清除體內(nèi)自由基的性能，保護細胞氧化造成的損傷，能夠調(diào)整細胞內(nèi)信號，促進細胞的存活，還具有抗癌、抗炎、抗病毒、降血壓，改善肥胖[4～9]等作用。

槲皮素對金屬離子具有強烈的螯合作用，可生成穩(wěn)定的環(huán)狀化合物。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與不同金屬離子形成配合物，其生物活性得到了不同程度的改進[10]。Ferrer等[11]合成了槲皮素釩配合物，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素釩可以刺激I型骨生長，對磷酸酯酶有抑制作用，它可促進骨細胞的分裂、增殖，具有抗骨癌的作用。Bukhari等[12]合成了槲皮素鈷配合物，運用DPPH自由基清除法，研究其體外抗氧化活性，結(jié)果表明槲皮素鈷配合物清除自由基的活性明顯高于槲皮素。周晶等[13]合成了槲皮素銅，研究表明槲皮素銅能夠插入DNA的堿基對中，從而影響DNA分子的構(gòu)型，抑制了DNA分子的進一步復制與轉(zhuǎn)錄，最終達到抗癌效果。譚君等[14]發(fā)現(xiàn)槲皮素鋅和槲皮素鎳也能嵌入DNA的堿基對中，使細胞核皺縮，引起細胞凋亡。因此，近年來，對槲皮素金屬配合物的研究逐年增多，這對槲皮素的開發(fā)利用及尋找新藥開辟了新的途徑[15]。在我們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常食用一些含有槲皮素的黃酮類蔬菜和水果，如蕃茄、洋蔥、蘋果、柑橘等，可清除體內(nèi)的自由基，使機體免受自由基的損傷，對降低人體內(nèi)重金屬離子的含量起著重要的作用。

本文介紹了合成槲皮素鈣的方法，并對其結(jié)構(gòu)進行了表征，研究了其清除自由基的能力。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of quercetin

1 實驗

1.1 藥品與器材

槲皮素（自制：蘆丁酸水解，分離，甲醇純化），醋酸鈣（分析純），其他試劑均為分析純。

FTS-3000型紅外光譜儀（KBr壓片，美國尼高力）；德國耐馳 (Netzsch)STA 409 PC/PG差熱分析儀；UV-240型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；400MHz核磁共振儀（德國Brucker）。

1.2 槲皮素鈣的制備

按文獻[16]的方法適當改進，在三頸燒瓶中，取1mmol（302mg）槲皮素，加入25mL甲醇，攪拌使完全溶解，加入甲醇鈉調(diào)pH=8.5。加入預先溶于25mL甲醇中的1mmol（111mg）無水醋酸鈣溶液。在可加熱的磁力攪拌器上加熱回流6h。用硅膠G板監(jiān)控反應進程，待反應完成時停止回流。過濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，得棕黃色固體，用甲醇沖洗三次，真空干燥器中干燥，得深棕黃色固體。

槲皮素鈣為深棕黃色粉末，溶于甲醇、乙醇、DMSO，微溶于丙酮，乙酸乙酯，不溶于苯、甲苯和四氯化碳。

1.3 清除自由基實驗

1×10-4mol/L的DPPH溶液的配制：精密稱取10mg DPPH，置于250mL容量瓶中，加入少量無水乙醇，待溶解后再用無水乙醇定容至刻度，混勻，避光，置于冰箱保存。供試液的配制：精密取各樣品適量，以乙醇為溶劑，分別配制100mg/L，80mg/L，60mg/L，40mg/L，20mg/L的待測溶液。精確吸取不同濃度的樣品溶液1mL，分別與3mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液混合，避光放置30min，在517nm處測吸光度Ay。以相應溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為As，相應樣品溶液的吸光度為A0。DPPH自由基清除活性按下式計算：

式中Ay—1mL樣品溶液與3mL DPPH溶液混勻后的吸光度值；As—1mL乙醇溶液與3mL DPPH溶液混勻后的吸光度值；A0—1mL樣品溶液與3mL乙醇溶液混勻后的吸光度值；參考文獻[16]計算自由基半數(shù)清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜分析

槲皮素在258nm和360nm有兩個吸收峰，分別屬于n→π*（A環(huán)）電子躍遷和π→π*（B環(huán)）電子躍遷，分別對應兩個生色團組成：258nm吸收帶由苯甲酰生色團產(chǎn)生，為帶Ⅱ；360nm吸收帶由肉桂酰生色團產(chǎn)生，為帶Ⅰ[17]。

圖2 槲皮素的結(jié)構(gòu)及其紫外光譜特征Fig.2 The structure of quercetin and its UV spectrum signature

槲皮素鈣的UV吸收帶Ⅱ由258nm紅移至266nm，紅移8nm；帶Ⅰ由360nm紅移至388nm，紅移28nm。這是由于形成配合物后，共軛體系增大，能量降低，最大吸收向長波方向移動引起的。帶Ⅰ紅移遠遠大于帶Ⅱ，這說明Ca2+是在帶Ⅰ區(qū)域內(nèi)與槲皮素配位形成配合物的[18]。

圖3 槲皮素和槲皮素鈣的紫外光譜圖Fig.3 The UV spectra of quercetin and quercetin calcium

2.2 紅外光譜分析

槲皮素分子主要官能團紅外吸收歸屬：υC=O1663.10cm-1；苯環(huán)骨架振動頻率 υC=C1610.89cm-1，1449.49cm-1；δC3-OH1382.03cm-1；υC-O酚1319.41cm-1；υ-OH3408.74cm-1。

圖4 槲皮素的紅外光譜Fig.4 The IR spectrum of quercetin

槲皮素鈣的紅外光譜顯示，羰基吸收峰υC=O1663.10cm-1，紅移至1647.52cm-1，這是因為羰基形成了配合物引起的。槲皮素的特征吸收峰υ-OH3408.74cm-1，在槲皮素鈣中是3405.15cm-1幾乎沒有發(fā)生變化，這說明槲皮素的基本骨架沒有發(fā)生變化。

圖5 槲皮素鈣的紅外光譜Fig.5 The IR spectrum of quercetin calcium

槲皮素和槲皮素鈣的紅外圖譜特征吸收峰比較結(jié)果顯示：①槲皮素的υC=O1663.10cm-1羰基振動頻率移至1647.52cm-1，向紅移了15.58cm-1，可見槲皮素的4-羰基參與了槲皮素鈣配合物的形成[19]。②槲皮素鈣配合物在640.64cm-1出現(xiàn)了υM-O，說明有金屬配位鍵生成。③苯環(huán)骨架振動頻率υC=C1610.89cm-1，和υC-O-C1262.46cm-1，分別移至1596.11cm-1和1267.07cm-1，說明在形成配合物后，苯環(huán)骨架的存在，只是向紅移動了約幾個至幾十個波數(shù)[20]。

表1 槲皮素和槲皮素鈣的紅外吸收數(shù)據(jù)比較Table 1 The IR absorption data of quercetin and quercetin calcium

2.3 槲皮素鈣的氫譜

1H NMR譜是鑒定黃酮化合物的結(jié)構(gòu)類型、確定取代基的位置和進行結(jié)構(gòu)研究的有效方法。氫譜可以提供有關分子中不同種類氫原子的情況，如根據(jù)化學位移和偶合常數(shù)可以判斷有關氫原子的化學環(huán)境，每種不同環(huán)境下氫原子的數(shù)目以及每個氫原子相鄰的基團的結(jié)構(gòu)等。槲皮素和槲皮素鈣的氫譜如表2所示。

表2 槲皮素和槲皮素鈣的氫譜Table 2 The H-NMR spectrum data of quercetin and quercetin calcium

由上述氫譜數(shù)據(jù)可知，槲皮素鈣中的3-OH和3'-OH上的氫消失，而其它3個羥基（7-OH，5-OH，4'-OH）上的氫依然存在，這說明槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。這與紫外光譜和紅外光譜數(shù)據(jù)是一致的[21～22]。

根據(jù)上述UV、IR、H NMR可得出槲皮素鈣的結(jié)構(gòu)：

圖6 槲皮素鈣的結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of quercetin calcium

2.4 槲皮素鈣清除DPPH自由基的作用

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517nm處有最大吸收，當有自由基清除劑存在時，由于DPPH自由基的單電子被配對，從而使得在517nm處的吸光度減小，因此該法常被用來評價樣品的抗氧化能力[23～24]。

圖7 槲皮素和槲皮素鈣對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The DPPH free radical scavenging capacity of quercetin and quercetin calcium

從圖7可見，槲皮素和槲皮素鈣都隨著濃度的增大，對DPPH自由基的清除率也增大，但是很明顯槲皮素與鈣離子形成配合物后，其對DPPH自由基的清除能力略有降低。根據(jù)實驗結(jié)果，槲皮素鈣與槲皮素的EC50分別是8.17和14.07mg/L，進一步說明槲皮素在與鈣配位后，其清除DPPH自由基能力降低，這可能是形成配合物后，鄰二酚結(jié)構(gòu)的羥基與鈣離子配位，使其接受質(zhì)子的能力降低引起的。

3 結(jié)論

槲皮素與醋酸鈣在堿性條件下，生成了槲皮素鈣配合物。通過紫外、紅外、核磁等手段對槲皮素鈣進行了結(jié)構(gòu)表征。光譜數(shù)據(jù)闡明了配位的位點：槲皮素的3位羥基和4位羰基上的氧與鈣離子配位，3'和4'位羥基與鈣離子結(jié)合。通過DPPH法測定了槲皮素鈣清除自由基的能力。實驗結(jié)果顯示，槲皮素鈣清除自由基的能力沒有槲皮素強。

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Synthesis and Biological Activity of Quercetin Calcium Complexes

LIU Qiu-wei1,ZHANG Hui-li1,LI Yang-jie1and ZHAI Guang-yu1,2
（1.College of Pharmacy,Zhengzhou University of Industrial Technology,Zhengzhou 451150,Chnia;2.College of Nursing,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China）

The quercetin calcium is synthesized and its bioactivity is observed.The quercetin and acetate calcium are heated and refluxed for 6 hours at pH=8.5 to form quercetin calcium.The UV spectrum bandⅠandⅡof quercetin calcium has a red shifted by 28nm and 8nm respectively compared with that of quercetin;the carbonyl vibration frequency of quercetin calcium was 1647.52cm-1,which shifts to red about 15.58cm-1than that of quercetin,the new absorption peak υM-O=640.64cm-1appears in the high field,which indicates that there is a formation of metal coordination bond; the hydrogen spectrum of quercetin calcium shows that the 3-OH and 3'-OH hydrogen disappears,but the 7-OH,5-OH and 4'-OH still exists, which indicates that the oxygen at the 3-hydroxyl and 4-carbonyl groups of quercetin coordinates with the calcium ion and the hydroxyl groups at the 3'and 4'position combines with calcium ion.The free radical scavenging capacity of quercetin calcium and quercetin is measured by DPPH method, and their EC50are 8.17 and 14.07mg/L respectively,and this means the free radical scavenging capacity of quercetin calcium is worse than that of quercetin.

Quercetin;quercetin calcium complexes;synthesis;characterization;free radical scavenging capacity

TQ460.32

A

1001-0017（2017）01-0025-05

2016-08-01

劉秋偉（1984-），女，河南平頂山人，講師，從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及教學工作。

*通訊聯(lián)系人：翟廣玉（1954-），男，河南項城人，教授，碩士生導師，從事中草藥有效成分的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、藥物化學合成及教學工作。

E-mail:Zhaiguangyu1@sina.com。