黃芩苷在原代心肌細(xì)胞氧化損傷中的保護作用及機制研究

邱麗滿，林婧，2，褚劍鋒，2，3，林久茂，2，彭軍，2，3

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建福州350122）

黃芩苷在原代心肌細(xì)胞氧化損傷中的保護作用及機制研究

邱麗滿1，林婧1，2，褚劍鋒1，2，3，林久茂1，2，彭軍1，2，3

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建福州350122）

目的通過體外實驗研究黃芩苷在心肌細(xì)胞氧化損傷中的保護作用及其機制。方法取SD乳鼠心肌細(xì)胞進行原代培養(yǎng)，按各實驗需要分組并干預(yù)。采用MTT法檢測不同劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型中細(xì)胞活力的影響，采用Western Blot法檢測不同劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型DNA雙鏈斷裂損傷指標(biāo)γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin表達的影響，并用Wnt／β-catenin信號通路激活劑LiCl干預(yù)，進一步探討黃芩苷在對心肌氧化損傷細(xì)胞模型的保護機制。結(jié)果心肌氧化損傷細(xì)胞模型的細(xì)胞活力顯著下降，γ-H2AX和核內(nèi)βcatenin的蛋白表達明顯上調(diào)；低劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型的細(xì)胞活力和γ-H2AX、核內(nèi)β-catenin的表達無明顯影響；而中、高劑量黃芩苷能夠明顯阻止受損心肌細(xì)胞活力下降，并下調(diào)心肌氧化損傷細(xì)胞模型的γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin的表達；且高劑量黃芩苷能夠下調(diào)Wnt／β-catenin信號通路激活劑LiCl干預(yù)下的原代心肌細(xì)胞γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin的表達水平。結(jié)論黃芩苷能夠通過抑制Wnt／β-catenin信號通路，阻止心肌細(xì)胞氧化損傷。

黃芩苷；心肌細(xì)胞氧化損傷；γ-H2AX；Wnt／β-catenin信號通路

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是嚴(yán)重危害人類健康與生命的心血管病急癥，其死亡率極高。在缺血心肌中，未修復(fù)的缺血損傷所引起的DNA損傷和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，被認(rèn)為是心肌細(xì)胞氧化損傷的主要機制［1-3］。DNA雙鏈斷裂是一種致命的DNA損傷，其斷裂部位產(chǎn)生的γ-H2AX能夠募集損傷修復(fù)相關(guān)蛋白到損傷位點，最終引起DNA修復(fù)等反應(yīng)［4，5］。H2O2是一種重要的ROS，它可作為第二信使刺激和調(diào)節(jié)DNA損傷的發(fā)生［6］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：抑制Wnt／β-catenin信號通路在阻止心肌缺血DNA損傷的發(fā)生及促進DNA修復(fù)中具有重要意義［7］。

中藥單體黃芩苷（baicalin）是一種從中藥黃芩干燥根部提取出來的活性成分。越來越多的研究表明，黃芩苷具有良好的心臟保護作用［8-10］，但其保護機制仍不明確。因此，我們擬用H2O2刺激原代心肌細(xì)胞建立心肌氧化損傷細(xì)胞模型，通過實驗明確黃芩苷對氧化損傷的心肌細(xì)胞的保護作用，并探討其可能的保護機制。

1材料

1.1藥物和動物黃芩苷購于成都曼思特生物科技有限公司；新生SD（Sprague-Dawley）乳鼠購于上海杰斯捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0006。

1.2試劑DMEM低糖培養(yǎng)基（維森特生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）、0.25%含EDTA胰酶、0.1%不含EDTA胰酶（美國Thermo公司）；LiCl（美國Sigma公司）；細(xì)胞核和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、DMSO（上海生工生物工程股份有限公司）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；β-catenin抗體、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；γ-H2AX抗體、TFIIB抗體（英國Abcam公司）；二抗（美國Thermo公司）。

1.3主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫磁力攪拌器（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；化學(xué)發(fā)光顯影儀（美國GE公司）。

2方法

2.1試劑配置黃芩苷用DMSO配制成儲存液，分裝于-20℃貯存?zhèn)溆?。DMEM低糖完全培養(yǎng)基含10%FBS和1%雙抗，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)及心肌氧化損傷細(xì)胞模型的建立取出生1～3 d SD乳鼠的心臟組織于預(yù)冷的PBS內(nèi)，清洗后剪碎，用0.01%不含EDTA胰酶分多次消化（37℃水浴，100 rpm，攪拌10 min），每次消化得到的細(xì)胞懸液于20%FBS的完全DMEM培養(yǎng)基（低糖）中和；離心1 000 rpm，7 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸后紗網(wǎng)過濾，將細(xì)胞鋪在φ10cm培養(yǎng)皿中；利用差異貼壁分離得到心肌細(xì)胞，接于φ3.5 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后用PBS清洗并更換培養(yǎng)基用于后續(xù)實驗。用H2O2刺激原代心肌細(xì)胞誘導(dǎo)心肌氧化損傷細(xì)胞模型的建立。

2.3采用MTT法檢測細(xì)胞活力將取得的原代心肌細(xì)胞分成對照組、低劑量組（10 μM黃芩苷）、中劑量組（25 μM黃芩苷）、高劑量組（50 μM黃芩苷）和模型組（200 μM H2O2）、模型＋低、中、高劑量組。黃芩苷預(yù)處理24 h后，用H2O2干預(yù)2 h，建立心肌氧化損傷細(xì)胞模型。PBS清洗細(xì)胞后每孔加0.1 mL的MTT（0.5 mg／mL）于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄MTT，加入DMSO后震蕩，通過酶標(biāo)儀測定570 mm波長下各孔吸光度值，并進行數(shù)據(jù)分析及圖表制作。

2.4采用Western Blot法檢測γ-H2AX和核內(nèi)βcatenin的表達將取得的原代心肌細(xì)胞分成對照組、模型組（100 μM H2O2）、模型＋低、中、高劑量組，用于檢測黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin表達的影響。將取得的原代心肌細(xì)胞分成對照組、黃芩苷組（50 μM黃芩苷）、LiCl組（10 mM LiCl）、黃芩苷＋LiCl組（50 μM黃芩苷＋10 mM LiCl），用于檢測黃芩苷對Wnt／βcatenin信號通路激活劑LiCl誘導(dǎo)下的γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin表達的影響。黃芩苷、LiCl預(yù)處理24 h后，用H2O2干預(yù)30 min，建立心肌氧化損傷細(xì)胞模型。提取細(xì)胞總蛋白、核蛋白，采用Western Blot法檢測各組細(xì)胞γ-H2AX和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達的影響，并用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像數(shù)據(jù)分析。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0版本軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

3結(jié)果

3.1黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型細(xì)胞活力的影響MTT結(jié)果表明：低、中、高劑量黃芩苷單獨干預(yù)對正常原代心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力無明顯影響，結(jié)果見圖1A。低、中、高劑量黃芩苷能夠明顯改善氧化受損心肌細(xì)胞的活力，尤其中、高劑量黃芩苷改善更為明顯，結(jié)果見圖1B。

圖1黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型細(xì)胞活力的影響

3.2黃芩苷對心肌損傷細(xì)胞模型細(xì)胞γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin蛋白表達的影響Western Blot結(jié)果顯示：與對照組相比，心肌氧化損傷細(xì)胞模型組的γ-H2AX和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達顯著上調(diào)；與模型組比較，低劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin的表達變化無明顯影響，而中、高劑量黃芩苷能夠顯著下調(diào)心肌缺血損傷細(xì)胞模型γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin的表達，提示黃芩苷可能通過抑制β-catenin，調(diào)控Wnt／β-catenin信號通路，進而下調(diào)心肌氧化損傷細(xì)胞模型γ-H2AX的表達。結(jié)果見圖2。

圖2黃芩苷對心肌氧化損傷細(xì)胞模型γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin蛋白表達的影響

3.3黃芩苷對LiCl誘導(dǎo)下的γ-H2AX和核內(nèi)βcatenin蛋白表達的影響Western Blot結(jié)果顯示：黃芩苷單獨干預(yù)能夠明顯下調(diào)心肌原代細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達，且對γ-H2AX的表達無影響；用Wnt／β-catenin信號通路的激活劑LiCl單獨干預(yù)能夠顯著上調(diào)心肌原代細(xì)胞γ-H2AX及其核內(nèi)βcatenin的表達，表明促進Wnt／β-catenin信號通路活化能夠增加原代心肌細(xì)胞γ-H2AX的表達；而與LiCl干預(yù)組比較，黃芩苷＋LiCl組的γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin的表達水平顯著降低，表明黃芩苷能夠抑制LiCl對Wnt信號通路的激活作用，進而下調(diào)氧化損傷心肌細(xì)胞γ-H2AX的表達，結(jié)果見圖3。

圖3黃芩苷對LiCl誘導(dǎo)下的γ-H2AX和核內(nèi)β-catenin蛋白表達的影響

4討論

目前，臨床上治療AMI的方法主要是抗血小板凝集、溶栓等藥物治療以及建立側(cè)枝循環(huán)的手術(shù)治療等［11-13］，這些急救措施主要局限于處理已經(jīng)閉塞的血管，使其再通，從而恢復(fù)心肌的血供，但是，這些治療手段并不能挽救已經(jīng)發(fā)生不可逆損傷的缺血組織。顯然，只有阻止細(xì)胞死亡，才能對其后續(xù)血管再通、血管新生的治療提供良好的治療基礎(chǔ)。

組織發(fā)生缺血時，短時間內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ROS大量增多，超過細(xì)胞抗氧化處理能力，導(dǎo)致機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)并誘發(fā)DNA氧化性損傷，DNA損傷是缺血導(dǎo)致的組織損傷最早出現(xiàn)的反應(yīng)［14］，過度的DNA損傷會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。阻止及修復(fù)DNA損傷，將有望阻止心肌發(fā)生不可逆性損傷，為心肌缺血的治療延長治療時機。

我們的研究發(fā)現(xiàn)：黃芩苷能夠明顯阻止心肌缺血損傷細(xì)胞模型中細(xì)胞活力的下降，下調(diào)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂指標(biāo)γ-H2AX及細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達，且黃芩苷能夠抑制LiCl所上調(diào)的Wnt信號通路的活性和γ-H2AX的蛋白表達水平。上述結(jié)果表明：黃芩苷能夠通過抑制Wnt／β-catenin信號通路的活化，阻止缺血所導(dǎo)致心肌細(xì)胞的DNA氧化損傷。

此外，黃芩苷在成藥方面具有兩大優(yōu)勢：①黃芩苷在多種急慢性炎癥的臨床治療中已經(jīng)有運用，其安全性及有效性已經(jīng)得到證實；②黃芩苷作為小分子化合物，成藥方便，造價較低。基于我們的研究發(fā)現(xiàn)及黃芩苷的成藥優(yōu)勢，我們認(rèn)為：黃芩苷將有望成為臨床上治療AMI的有效藥物。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0031-03

2016-12-28

陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金（CKJ2016005）；國家自然科學(xué)基金（81302884）。

邱麗滿（1990—），女，碩士研究生，主要從事中西結(jié)合心血管疾病的基礎(chǔ)研究。

彭軍（1969—），男，研究員，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師。

E-mail：pjunlab@hotmail.com