大菱鲆脂聯(lián)素受體基因的克隆及飼料糖脂比對其表達的影響

韓冬冬苗淑彥,聶 琴苗惠君魏澤宏張文兵麥康森

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室, 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003; 2. 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 揚州 225009)

大菱鲆脂聯(lián)素受體基因的克隆及飼料糖脂比對其表達的影響

韓冬冬1苗淑彥1,2聶 琴1苗惠君1魏澤宏1張文兵1麥康森1

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室, 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003; 2. 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 揚州 225009)

脂聯(lián)素作為一種重要的細胞因子在哺乳動物中起到調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要作用, 為探究脂聯(lián)素在大菱鲆糖脂代謝中是否具有同樣的調(diào)節(jié)作用, 研究利用分子克隆和RACE技術(shù)克隆到了大菱鲆脂聯(lián)素AdipoR1受體和AdipoR2受體的基因全長序列。其中AdipoR1受體的核苷酸序列全長為1125 bp, 共編碼375個氨基酸, 氨基酸序列與其他脊椎的同源性都很高。AdipoR2受體的核苷酸序列全長為1940 bp, 共編碼380個氨基酸, 氨基酸序列與其他脊椎動物同源性也都很高。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7個明顯的跨膜區(qū), 最優(yōu)拓撲模型為N端在細胞內(nèi)側(cè)模型, 與其他脊椎動物相同。配制不同糖脂比(1：6, 1：2, 2：1和14：1)的飼料養(yǎng)殖大菱鲆9周, 利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測大菱鲆肌肉和肝臟中脂聯(lián)素受體基因的表達量。結(jié)果顯示, 在飼料糖脂比為1：2的處理組中, 大菱鲆肌肉中AdipoR1的表達量顯著低于糖脂比為1：6的處理組(P＜0.05), 但與其他2組無顯著差異。飼料糖脂比的變化對肌肉中AdipoR2和肝臟中這2種受體的表達量均沒有產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。由此可見, 飼料糖脂比的變化可能通過改變脂聯(lián)素受體的表達量, 從而間接影響大菱鲆體內(nèi)脂聯(lián)素的作用。AdipoR1和AdipoR2對飼料糖脂比變化的反應(yīng)不同步, 而且肌肉和肝臟中脂聯(lián)素受體對飼料糖脂比變化的反應(yīng)也存在不同。適量提高飼料糖脂比可以顯著下調(diào)肌肉中AdipoR1的表達。

大菱鲆; 脂聯(lián)素; 脂聯(lián)素受體; 糖脂比; 基因表達

脂聯(lián)素(Adiponectin)是哺乳動物脂肪組織特異性分泌的一種膠原樣細胞因子, 與C1q和TNF-α家族具有結(jié)構(gòu)同源性[1]。根據(jù)聚合度的不同, 可分為球型脂聯(lián)素和全長型脂聯(lián)素[2]。在哺乳動物中, 脂聯(lián)素作用廣泛, 參與機體糖脂代謝調(diào)控和炎癥抵抗等生理活動[3]。特別是在糖代謝調(diào)控方面, 其可增強胰島素敏感性, 改善高脂攝食引起的胰島素抵抗[4]。還具有阻礙細胞因子誘導(dǎo)的β細胞的凋亡, 修復(fù)β細胞功能紊亂的作用[5]。脂聯(lián)素能夠抑制肝臟中的糖異生過程, 減少內(nèi)源性葡萄糖的生成, 增加肌細胞對葡萄糖的攝取[6,7]。

脂聯(lián)素通過脂聯(lián)素受體的介導(dǎo)發(fā)揮作用, 后者包含2種亞型, 即AdipoR1和AdipoR2。脂聯(lián)素受體含有7個跨膜結(jié)構(gòu), 但與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)相反, 它們的N端在細胞內(nèi), 而C端在細胞外, 因此脂聯(lián)素受體可能不通過與G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用, 而是直接與下游信號分子作用。AdipoR1對球型脂聯(lián)素親和力高, 對全長型脂聯(lián)素親和力低。而AdipoR2對兩種脂聯(lián)素具有同等親和力。人體多種組織細胞表面都有脂聯(lián)素受體, 其中AdipoR1主要在骨骼肌細胞表達, AdipoR2主要在肝細胞中表達。這兩種受體的分布與不同類型的脂聯(lián)素在骨骼肌和肝臟中發(fā)揮不同的作用有關(guān)[8]。

目前在魚類中成功克隆到脂聯(lián)素基因的只有斑馬魚(Danio rerio)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[9,10]。在斑馬魚中克隆到脂聯(lián)素2種類型的基因, 但在虹鱒中只克隆到1種類型。斑馬魚和虹鱒脂聯(lián)素的基因表達受到禁食的影響。在斑馬魚、虹鱒和點帶石斑魚(Epinephelus coioides)中均成功克隆到2種亞型的脂聯(lián)素受體基因[9,11,12], 此外, 在GenBank數(shù)據(jù)庫中還發(fā)現(xiàn)了大西洋鮭(Salmo salar)、青鳉(Oryzias latipes)、羅非魚(Oreochromis niloticus)和紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)等魚類的2種亞型脂聯(lián)素受體的基因信息, 其中斑馬魚和紅鰭東方鲀的AdipoR1型受體又存在同源性較高的AdipoR1a和AdipoR1b兩個亞型。斑馬魚、虹鱒和點帶石斑魚中的研究表明, 脂聯(lián)素受體基因的表達量均受到禁食狀態(tài)的影響[9,11,12]。在虹鱒中的研究還表明, 胰島素、生長激素和炎癥反應(yīng)等會對脂聯(lián)素受體產(chǎn)生不同的影響, 并且脂聯(lián)素可以激活肌肉中的Akt信號因子, 可能與促進脂肪酸攝入和氧化的功能有關(guān)[12]。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于鰈形目(Pleuronectiformes), 鲆科(Bothidae)。作為肉食性魚類的一種, 其對飼料糖的利用能力較弱。當(dāng)飼料糖含量超過15%時就會抑制其幼魚的生長, 并會對內(nèi)臟器官產(chǎn)生不良的影響[13]。Nijhof和Bult[14]的研究表明大菱鲆糖類代謝系統(tǒng)并沒有缺陷, 聶琴[15]的研究也表明, 大菱鲆幼魚糖代關(guān)鍵謝酶的基因表達和活性均會對飼料糖水平的變化做出響應(yīng)。然而,大菱鲆不耐受高糖的機制仍不清楚。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù), 克隆大菱鲆AdipoR1和AdipoR2的cDNA全長序列, 同時利用實時熒光定量PCR技術(shù), 探討不同飼料糖脂比對AdipoR1和AdipoR2基因表達的影響, 為研究脂聯(lián)素及其受體在大菱鲆糖脂代謝中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2基因全長序列的克隆

基因核心片段序列的克隆 采用RNAiso PlusTrizol試劑(TaKaRa, 日本)提取大菱鲆肝臟總RNA, cDNA第一鏈合成使用PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒(TaKaRa, 日本)。

選取NCBI的GenBank中人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、羅非魚(Oreochromis mossambicus)和青鳉(Oryzias melastigma)等10個物種脂聯(lián)素受體氨基酸序列為模板, 通過引物設(shè)計軟件CODEHOP設(shè)計AdipoR1和AdipoR2的簡并引物, 見表 1。

PCR擴增體系總體積為25 μL, 包括: 12.5 μL的2×EsTaqMsterMix(北京康為世紀生物科技有限公司), 9.5 μL的dH2O, 1.0 μL的cDNA模板, 以及上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR擴增反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf,德國)中進行, 反應(yīng)條件如下: 94℃預(yù)變性3min, 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán), 最后72℃后延伸10min。

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物, 采用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)進行膠回收。選擇pEASY-T1載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)為連接載體, 將膠回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中, 用藍白斑篩選的方法和菌落PCR挑選含有目的片段的菌液,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

基因5′端和3′端序列擴增 根據(jù)克隆得到的大菱鲆AdipoR1和AdipoR2基因的核心片段, 利用Primer5軟件, 設(shè)計3′RACE和5′RACE PCR擴增所需要的內(nèi)、外套引物(表 1)。3′RACE和5′RACE PCR操作所需cDNA第一鏈的合成采用SMARTer RACE cDNA Amplication Kit試劑盒(Clontech, 美國)。RACE外套PCR擴增使用基因外套引物和試劑盒中提供的UPM引物, 內(nèi)套PCR擴增使用基因內(nèi)套引物和試劑盒中提供的NUP引物, 產(chǎn)物回收、純化和測序均同核心片段克隆。

1.2 AdipoR1和AdipoR2基因全長序列分析

受體基因序列的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列預(yù)測采用DNAMAN軟件, 使用在線軟件TMHMMServer v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)進行氨基酸序列的跨膜區(qū)預(yù)測, 蛋白質(zhì)分子量和等電點預(yù)測采用在線軟件Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/), 氨基酸多重序列比對采用BioEdit軟件中的Sequence Alignment Editor, 氨基酸序列的進化樹構(gòu)建采用MEGA 4.0 軟件的neighbor-joining方法。

一方面，盡管東昌區(qū)政府高度重視并采取一系列卓有成效的措施支持葫蘆文化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，卻沒有深刻認識到葫蘆文化在鄉(xiāng)村旅游中的發(fā)展地位，沒有充分抓住山東省全面開發(fā)鄉(xiāng)村旅游的良好機遇，利用本地豐富的葫蘆文化旅游資源，大力發(fā)展極具地域特色的鄉(xiāng)村旅游。另一方面，社區(qū)居民對種植、加工葫蘆的收入較為滿意，且因文化層次較低，缺少鄉(xiāng)村旅游開發(fā)經(jīng)驗，從而對開發(fā)葫蘆文化旅游缺乏足夠的信心和熱情。

1.3 AdipoR1和AdipoR2基因組織差異表達檢測

提取大菱鲆腦、眼、鰓、肝臟、胃、脾、腎、腸、幽門盲囊和肌肉10個組織的總RNA, 并利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, 日本)試劑盒進行cDNA第一鏈的合成, 用于反轉(zhuǎn)錄的RNA為1 μg。根據(jù)得到的基因全長序列, 利用Primer5.0軟件設(shè)計特異性定量引物, 選擇β-actin為內(nèi)參基因, 作為參照用于定量基因在每個組織中的mRNA水平, 并驗證每個組織cDNA模板的完整性, AdipoR1和AdipoR2定量引物和內(nèi)參基因引物及對應(yīng)退火溫度見表 1。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同基因核心序列擴增, 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織擴增產(chǎn)物, 根據(jù)條帶亮度推測基因在不同組織中的表達差異。

1.4 不同飼料糖脂比對大菱鲆肌肉中AdipoR1和AdipoR2表達的影響

實驗飼料的設(shè)計和配制 以糊精為主要糖源, 魚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源, 白魚粉、酪蛋白和明膠為蛋白源, 配制等氮等能的實驗飼料。對照組為不添加糊精的基礎(chǔ)飼料, 粗蛋白和粗脂肪含量分別為50%和12%。其他組分別添加糊精5%、15%和28%, 通過調(diào)節(jié)魚油含量使4組飼料糖脂比分別為1：6、1：2、2：1和14：1, 分別命名為Diet-1、Diet-2、Diet-3和Diet-4。飼料原料粉碎并過80目篩, 按飼料配方逐級放大混合均勻, 再加入大豆卵磷脂和魚油, 手工搓油后混勻, 最后加入蒸餾水揉成面團, 用制粒機(EL-260, 山東威海友誼機械廠)壓出直徑為1.5 mm的顆粒飼料, 50℃恒溫烘干后保存于–20℃?zhèn)溆?。飼料配方及成分分析見?2。

養(yǎng)殖實驗和取樣 實驗用大菱鲆為人工培育的同一批苗種。養(yǎng)殖實驗采用室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng), 位于青島鰲山衛(wèi)國家海洋科研中心。在正式實驗前, 用商品飼料(青島七好生物科技有限公司)飽食投喂2周, 使實驗用魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。禁食24h后, 將體重接近的大菱鲆幼魚[平均體重(8.06± 0.08) g]隨機分為4組, 每組3個重復(fù), 每個實驗桶(聚乙烯材料, 500 L)28尾魚。養(yǎng)殖實驗持續(xù)9周, 每日上午07:00和下午18:00各飽食投喂1次, 實驗期間水溫為(19±1)℃, pH為7.7±0.1, 鹽度為(25.2±1.0)%, 溶氧大于6.0 mg/L。

實驗結(jié)束取樣前, 實驗魚禁食24h, 每桶隨機取3尾魚用丁香酚麻醉后, 取肌肉和肝臟組織。取樣過程在冰上進行, 組織放入1.5 mL無RNase離心管中, 液氮速凍后–80℃保存。

實時熒光定量PCR檢測肌肉和肝臟中AdipoR1和AdipoR2基因表達水平 大菱鲆肌肉和肝臟組織總RNA提取, cDNA第一鏈合成, 以及定量引物同1.3。實時熒光定量PCR反應(yīng)在Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀中進行(Eppendorf, 德國),采用的熒光染料為SYBR Green I (北京康為世紀生物科技有限公司)。反應(yīng)體系包括: UltraSYBR Mixture 12.5 μL, cDNA 3 μL (50 ng/μL), 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL和dH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序為95℃ 10min后, 40個循環(huán)的95℃ 10s, 60℃ 10s, 以及72℃ 20s。反應(yīng)結(jié)束后進行溶解曲線分析: 95℃15s, 60℃ 15s, 然后用15min升溫到95℃并保持15s。選擇β-actin為內(nèi)參基因, 目的基因和內(nèi)參基因的定量引物的擴增效率一致且接近1, 基因的相對表達水平計算用“2–ΔΔCt”法[16]。

表 1 大菱鲆脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2全長序列克隆和基因表達量檢測所用引物Tab. 1 Primers for cloning and RT-PCR

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析, 當(dāng)差異顯著(P＜0.05)時, 用Tukey檢驗進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 AdipoR1和AdipoR2基因全長序列分析

大菱鲆AdipoR1核苷酸序列全長1514 bp, 包括開放閱讀框(ORF)1125 bp, 5′-非編碼區(qū)(5′-UTR) 120 bp, 3′-非編碼區(qū)(3′-UTR) 254 bp。GenBank序列號為KF201648。ORF從第121 bp到第1249 bp編碼由375個氨基酸構(gòu)成的前體蛋白, 預(yù)測其分子量為42.25 kD, 等電點為5.62。通過在線功能域預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)大菱鲆AdipoR1具有一個保守的Hly III結(jié)構(gòu)域(F130-F353)。經(jīng)NCBI blastx比對大菱鲆AdipoR1與其他脊椎動物的同源性, 結(jié)果顯示與人類、斑馬魚、大西洋鮭、紅鰭東方鲀、虹鱒、羅非魚和青鳉同源性分別為80%、81%、92%、93%、92%、97%和94%。結(jié)合多種脊椎動物AdipoR1氨基酸序列多重比對結(jié)果可以看出, AdipoR1在脊椎動物中的保守性非常高。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明, 大菱鲆AdipoR1與羅非魚、紅鰭東方鲀、青鳉和大西洋鮭聚為一支, 自展支持率為100%, 哺乳動物和鳥類各自聚為一支后與兩棲類共同聚為一支, 自展支持率為100% (圖 1)。

大菱鲆AdipoR2核苷酸序列全長1940 bp, 包括5′-UTR 356 bp, 3′-UTR 444 bp, ORF從第357 bp到第1497 bp, 共編碼380個氨基酸, GenBank序列號為KP204852。預(yù)測AdipoR2蛋白分子量為42.66 kD,等電點為5.73。通過在線功能域預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)大菱鲆AdipoR1具有一個保守的HlyIII結(jié)構(gòu)域(F134-F357)。經(jīng)NCBI blastx比對大菱鲆AdipoR2與其他脊椎動物的同源性, 結(jié)果顯示, 大菱鲆AdipoR2氨基酸序列與人類、非洲爪蟾、斑馬魚、羅非魚、紅鰭東方鲀和青鳉的同源性分別為78%、74%、93%、92%、89%和87%, 多種脊椎動物AdipoR2氨基酸序列多重比對結(jié)果表明, AdipoR2在脊椎動物中的保守性非常高。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn), 大菱鲆AdipoR2與所有魚類聚為一支, 哺乳動物和鳥類聚為一支(圖 2)。

表 2 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成Tab. 2 Ingredients and compositions of the experimental diets (%)

圖 1 大菱鲆與其他物種脂聯(lián)素受體AdipoR1氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of adiponectin receptor AdipoR1每個節(jié)點處的數(shù)字表示自展支持率, 自展值檢驗為1000次重復(fù)抽樣。GenBank序列號分別為: 人(NP_057083.2)、羊(NP_ 001272659.1)、雞 (NP_001026198.1)、蛙(AAH80374.1)、大西洋鮭 (NP_001133596.1)、紅鰭東方鲀a (XP_003973528.1)、紅鰭東方鲀b (XP_003973529.1)、羅非魚(XP_003441547.1)、青鳉(XP_004069161.1)Numbers at nodes indicate the bootstrap value (%) that obtained from 1000 replicates. GenBank Accession No.: Human (NP_ 057083.2); Goat (NP_001272659.1); Chicken (NP_001026198.1); Frog (AAH80374.1); Atlantic salmon (NP_001133596.1); Pufferfish a (XP_003973528.1); Pufferfish b (XP_003973529.1); Tilapia (XP_003441547.1); Japanese medaka (XP_004069161.1)

通過蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7個明顯的跨膜區(qū), 最優(yōu)拓撲模型為N端在細胞內(nèi)側(cè)模型。AdipoR1和AdipoR2氨基酸序列都可以分為4部分: 不保守的N端區(qū)、保守的N端區(qū)、HlyIII區(qū)域(編碼7個跨膜螺旋束)和C端區(qū)。

2.2 大菱鲆AdipoR1和AdipoR2組織差異表達

AdipoR1在所選10個組織中均有表達, 其中在鰓和腎臟中表達最多, 其次為胃、脾和幽門盲囊; AdipoR2在腸和腎臟中表達量最高, 其次為鰓、胃和幽門盲囊(圖 3)。

2.3 不同飼料糖脂比對大菱鲆肌肉和肝臟中AdipoR1和AdipoR2基因表達的影響

飼料糖脂比為1：2處理組肌肉中AdipoR1的表達量顯著低于對照組(糖脂比為1：6)(P＜0.05), 但與其他兩組無顯著差異(P＞0.05)(圖 4A)。飼料糖脂比變化對肌肉中AdipoR2的表達無顯著影響(P＞0.05,圖 4B)。飼料糖脂比變化對肝臟中AdipoR1和AdipoR2的表達均無顯著影響(P＞0.05, 圖 4C、4D)

3 討論

圖 2 大菱鲆與其他物種脂聯(lián)素受體2氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of adiponectin receptor AdipoR2每個節(jié)點處的數(shù)字表示自展支持率, 自展值檢驗為1000次重復(fù)抽樣。GenBank序列號分別為: 人類(NP_078827.2)、小鼠(AAI54263.1)、鴨(EOB08163.1)、紅鰭東方鲀(XP_003972858.1)、羅非魚(XP_003445015.1)、青鳉(XP_004083071.1)、斑馬魚(AAI54263.1)Numbers at nodes indicate the bootstrap value (%) that obtained from 1000 replicates. GenBank Accession No.: Human (NP_ 078827.2); Mouse (AAI54263.1); Duck (EOB08163.1); Pufferfish (XP_003972858.1); Tilapia (XP_003445015.1); Japanese medaka (XP_004083071.1); Zebrafish (AAI54263.1)

圖 3 大菱鲆脂聯(lián)素受體AdipoR1(AR1)和AdipoR2(AR2)的組織差異表達分析Fig. 3 The expression of turbot adipnectin receptor AdipoR1 (AR1) and AdipoR2 (AR2) in multiple tissuesL. 分子量梯度; 1. 眼; 2. 腦; 3. 鰓; 4. 胃; 5. 腸; 6. 肝; 7. 腎; 8. 脾; 9. 幽門盲囊; 10. 肌肉; N. 陰性對照。內(nèi)參基因β-actin (β-AC)用來驗證每個組織cDNA模板的完整性L. Ladder; 1. Eyes; 2. Brain; 3. Gill; 4. Stomach; 5. Intestine; 6. Liver; 7. Kidney; 8. Spleen; 9. Pyloric caeca; 10. Muscle; N. Negative control. β-actin (β-AC) was used as an internal control

圖 4 不同飼料糖脂比對大菱鲆肌肉和肝臟中脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2基因表達的影響Fig. 4 Effects of dietary carbohydrate-to-lipid ratios on turbot AdipoR1 and AdipoR2 expression in muscle and liver實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準誤(n=3)表示, 不同字母表示不同處理間有顯著差異(P＜0.05)Each bar represents the mean ±SEM of three replicates. Significant difference among the diets are indicated by different letters (P＜0.05)

與哺乳動物相同, 大菱鲆脂聯(lián)素受體有AdipoR1和AdipoR2亞型, 其包括N端結(jié)構(gòu)域、HlyIII結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。HlyIII結(jié)構(gòu)域在脊椎動物中保守性很高, 可能是脂聯(lián)素受體形成特殊拓撲結(jié)構(gòu)和發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示, 大菱鲆脂聯(lián)素受體的最優(yōu)拓撲模型為N端在細胞內(nèi), C端在細胞外的模型, 這與小鼠等動物中的研究一致[8], 因此, 脂聯(lián)素只能與受體在細胞外的C端結(jié)合, 進而通過受體在細胞內(nèi)的N端激活下有信號因子發(fā)揮作用。已報道的哺乳動物脂聯(lián)素受體可以與多種銜接蛋白結(jié)合, 激活不同信號通路, 包括亮氨酸拉鏈基元和蛋白激酶CK2 β亞基等[17,18]。與點帶石斑魚[11]中的結(jié)果相似, 大菱鲆AdipoR1和AdipoR2的N端區(qū)可以明顯劃分為兩個區(qū)域: 一個不保守N端區(qū)和一個保守的N端區(qū)。與其他區(qū)域不同, 魚類不保守的N端區(qū)與其他脊椎動物的同源性很低, 這表明魚類可能具有一些不同于其他物種的脂聯(lián)素受體結(jié)合蛋白, 魚類脂聯(lián)素受體下游信號通路及生理功能可能與其他脊椎動物存在差異。

與其他脊椎動物的脂聯(lián)素受體一樣, 大菱鲆兩種脂聯(lián)素受體組織表達廣泛, 說明脂聯(lián)素受體可以在多種組織中發(fā)揮生理功能。在人和小鼠中的研究顯示, 脂聯(lián)素水平與腎臟疾病具有一定相關(guān)性,脂聯(lián)素在腎臟氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[19]。與點帶石斑魚相似, 大菱鲆AdipoR1在腎臟中的表達量最高, 表明大菱鲆脂聯(lián)素在腎臟中同樣具有重要的作用。此外AdipoR1在大菱鲆鰓中也具有較高的表達水平, 在其他魚種還未見類似報道, 脂聯(lián)素在大菱鲆鰓部的功能還需進一步探究。與哺乳動物脂聯(lián)素受體在肌肉中大量表達不同[8,20], 大菱鲆脂聯(lián)素受體在肌肉中的表達量較少, 與AdipoR1相比, AdipoR2在肌肉中mRNA水平更低, 推測大菱鲆脂聯(lián)素主要通過AdipoR1在肌肉中發(fā)揮作用。

脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2的表達受到胰島素的調(diào)控。在AdipoR1和AdipoR2高表達的小鼠骨骼肌中, 補充胰島素后會引起這兩種受體表達的減少[21]。發(fā)生胰島素抵抗的糖尿病小鼠中研究也表明, 血漿胰島素水平和脂聯(lián)素受體的表達呈負相關(guān)[22]。在本研究中, 隨著糖添加量的增加, 大菱鲆血清胰島素水平從(9.19±0.89) ng/mL上升到(22.20±0.58) ng/mL(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 肌肉中AdipoR1表達的下調(diào)可能與上升的胰島素水平有關(guān)。此外,在給予胰島素后, 糖尿病小鼠骨骼肌和C2C12肌細胞中都發(fā)現(xiàn)AdipoR1表達量大幅減少, 但AdipoR2的表達沒有顯著變化[23]。Staiger等[24]在正常葡萄糖耐量的人類肌細胞中的研究也表明, 胰島素分泌與AdipoR1的表達有關(guān), 而可能與AdipoR2的表達無關(guān)。與哺乳動物相似, 虹鱒腹腔注射胰島素后, 肌肉中AdipoR1表達受到抑制, 但AdipoR2的表達沒有顯著變化[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn), 飼料糖變化引起血清胰島素水平的改變雖然下調(diào)了肌肉中AdipoR1的表達, 卻并沒有引起肌肉AdipoR2表達量的變化, 推測大菱鲆脂聯(lián)素可能主要通過AdipoR1在肌肉中發(fā)揮與胰島素或糖代謝相關(guān)的作用。

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MOLECULAR CLONING OF ADIPONECTIN RECEPTORS IN TURBOT SCOPHTHALMUS MAXIMUS AND ITS EXPRESSION RESPONSE TO DIETARY RATIOS OF CARBOHYDRATE TO LIPID

HAN Dong-Dong1, MIAO Shu-Yan1,2, NIE Qin1, MIAO Hui-Jun1, WEI Ze-Hong1, ZHANG Wen-Bing1and MAI Kang-Sen1
(1. The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds, Ministry of Agriculture, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The present study cloned the full-length cDNA sequences of adiponectin receptors (AdipoR1, AdipoR2) in turbot. The cDNA sequence of AdipoR1 was 1125 bp, encoding 375 amino acids. The deduced amino acid sequence of AdipoR1 was conserved with the vertebrate’s AdipoR1, such as human (80%) and tilapia (97%). The cDNA sequence of AdipoR2 was 1940 bp, encoding 380 amino acids. The amino acid sequence of AdipoR2 was 78% identical to human and 92% to tilapia. Like invertebrates, both AdipoR1 and AdipoR2 had 7 transmembrane domains, and the N-terminal of the optimal topological structure was inside cells. Turbot adiponectin receptors were widely expressed in all detected tissues. The highest mRNA level of AdipoR1 was found in gill and kidney. The high level of AdipoR2 was found in gill, stomach, intestine, kidney and pyloric caeca. A 9-week feeding trial using diets with different ratios of carbohydrate to lipid (1：6, 1：2, 2：1 and 14：1) indicated that 1：2 dietary carbohydrate-to-lipid ratio but not other two diets significantly decreased the expression of AdipoR1 (P＜0.05) in turbot muscle. All 3 diets had no significant effect on the AdipoR2 expression in muscle and the expressions of AdipoR1 and AdipoR2 in liver (P＞0.05). These results suggest that the dietary carbohydrate-to-lipid ratios may influence the function of adiponectin through changing the adiponectin receptors expression in muscle.

Turbot; Adiponectin; Adiponectin receptor; Carbohydrate-to-lipid ratio; Gene expression

S965.3

A

1000-3207(2017)03-0565-08

10.7541/2017.73

2015-12-07;

2016-03-14

國家973計劃項目(2014CB138600)資助 [Supported by the National Program on Key Basic Research Project (973 Program, 2014CB138600)]

韓冬冬(1990—), 女, 山東濱州人; 碩士; 研究方向為水生動物營養(yǎng)與飼料學(xué)。E-mail: douyonghero@163.com

張文兵, E-mail: wzhang@ouc.edu.cn