人工基因元件的生理學(xué)研究進(jìn)展

季翔宇，趙會偉，婁春波

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人工基因元件的生理學(xué)研究進(jìn)展

季翔宇1,2，趙會偉1，婁春波1,2

1 中國科學(xué)院微生物研究所中國科學(xué)院微生物生理與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

季翔宇，趙會偉，婁春波. 人工基因元件的生理學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(3): 393–403.Ji XY, Zhao HW, Lou CB. Advances in synthetic physiology of artificial genetic parts. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 393–403.

按照工程學(xué)原理人工設(shè)計(jì)的基因元件應(yīng)該是模塊化的，同時具備可預(yù)測地組裝和再利用的屬性。然而，真正的細(xì)胞生理?xiàng)l件下各種層次的生理干涉效應(yīng)會嚴(yán)重地阻礙人工基因元件的功能性組裝，即大多數(shù)組裝后的人工系統(tǒng)完全或部分喪失預(yù)設(shè)功能。我們提出合成生理學(xué)的概念，將其定義為研究和控制人工生命系統(tǒng)與底盤細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的合成生物學(xué)分支領(lǐng)域。在此框架下，本文歸納了細(xì)胞生理系統(tǒng)與人工基因元件的相互干涉方式，并對表征和消除這種相互作用的技術(shù)方法和設(shè)計(jì)策略進(jìn)行綜述。

合成生物學(xué)，合成生理學(xué)，人工基因元件，底盤細(xì)胞，相互作用

合成生物學(xué)旨在用工程學(xué)原理指導(dǎo)人工生命系統(tǒng)設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)預(yù)想的功能，或經(jīng)由這種“創(chuàng)造去學(xué)習(xí)”的方式輔助我們深化對生命系統(tǒng)運(yùn)作方式的理解。在合成生物學(xué)興起的十幾年中，人工基因元件設(shè)計(jì)和組裝完成了許多重要突破：人工基因元件設(shè)計(jì)方面，大量工作積累了一批精細(xì)刻畫的優(yōu)質(zhì)元件，為復(fù)雜回路的設(shè)計(jì)提供了可靠的工具箱。在此基礎(chǔ)上近期研究者已可根據(jù)目標(biāo)真值表自動設(shè)計(jì)多輸入-輸出的復(fù)雜布爾邏輯電路并生成DNA序列，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了良好的預(yù)測性[1]；在組裝技術(shù)研究方面，Gibson assembly[2]、Golden gate[3]及酵母同源重組技術(shù)[4]代表的DNA組裝技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不同尺度的多片段組裝，使人工系統(tǒng)的快速構(gòu)建成為可能。

盡管在人工基因元件的設(shè)計(jì)和組裝中取得了巨大突破，合成生物學(xué)至今仍未解決的一個最主要瓶頸問題是人工基因元件“放入”底盤生物體后，對細(xì)胞生理產(chǎn)生不可預(yù)知的干涉性影響。反過來，這些干涉性影響導(dǎo)致理論上“模塊化”的生物元件的功能變得不可預(yù)知。依照工程學(xué)原理，人造生物系統(tǒng)在理想狀態(tài)下應(yīng)可以被拆解為功能上相互獨(dú)立的模塊，模塊間的拼裝不會導(dǎo)致模塊功能的改變[5]，使其構(gòu)建系統(tǒng)可以像電子系統(tǒng)一樣被擴(kuò)展和尺度放大 (Scale-up)[6]。鑒于此，合成生物學(xué)領(lǐng)域的大量工作都注重正交性元件的開發(fā) (Part-mining)[7–11]，致力于元件之間相互作用的最小化。然而近年來的工作表明，基因回路并不能嚴(yán)格地和宿主細(xì)胞隔離，而是與細(xì)胞的生理狀態(tài)耦合形成一個整體[12]，這就使我們陷入雖然擁有功能和行為經(jīng)過精細(xì)刻畫的元件，但仍然不能避免針對每個回路進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn) (Ad hoc)優(yōu)化[13]的窘境，元件一旦脫離了刻畫時的細(xì)胞生理狀態(tài)使用，其行為就有可能偏離預(yù)期，使得“由下而上” (Bottom-up) 的通路構(gòu)建陷入巨大工作量的“design-build-test-learn”循環(huán)[14]。

近期已有工作開始關(guān)注細(xì)胞生理系統(tǒng)對人工基因元件的影響并提出特定元件的設(shè)計(jì)原則。本文將對合成生物學(xué)人工生命系統(tǒng)與底盤細(xì)胞生理系統(tǒng)的相互作用方式及其不利影響進(jìn)行梳理，對表征和消除這種相互作用的技術(shù)方法、設(shè)計(jì)原則進(jìn)行綜述，并提出合成生理學(xué)的概念，為今后合成生物學(xué)構(gòu)建的人工系統(tǒng)與宿主或底盤細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的研究提供框架和方向。

1 合成生物學(xué)元件與底盤細(xì)胞生理系統(tǒng)的相互作用方式

合成生物學(xué)元件與底盤細(xì)胞的相互作用是緊密聯(lián)系、互為因果的，本章節(jié)根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)將其歸納為3點(diǎn)：1) 基因元件過表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長壓力；2) 基因元件特異調(diào)控會導(dǎo)致細(xì)胞毒性；3) 細(xì)胞體內(nèi)特殊生理機(jī)制會影響元件的內(nèi)稟參數(shù)。下文分別加以論述。

1.1 基因元件過表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長壓力

細(xì)胞利用有限的資源完成營養(yǎng)物質(zhì)攝取、能量代謝、DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂等諸多生理過程，為了優(yōu)化自身的生長，細(xì)胞需要根據(jù)環(huán)境平衡分配這些資源。由合成生物學(xué)原理設(shè)計(jì)并人為構(gòu)建的基因元件或系統(tǒng)則打破了這種平衡，引發(fā)細(xì)胞生長壓力 (Burden)。

首先，人工構(gòu)建的基因元件在DNA復(fù)制和蛋白表達(dá)過程中都占用了底盤細(xì)胞的資源。過多的內(nèi)源[15]或外源蛋白[16]過量表達(dá)都會造成細(xì)胞生長放緩。機(jī)制研究表明相比于能量和物質(zhì)消耗，這一現(xiàn)象更主要來源于底盤細(xì)胞RNA聚合酶和核糖體的占用[17–18]。過量表達(dá)蛋白導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，還會引起ppGpp等途徑激活細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[16]，造成細(xì)胞生理狀態(tài)的全局性切換，這也是下文提到的細(xì)胞體內(nèi)特殊生理機(jī)制會影響元件內(nèi)稟參數(shù)的原因之一。

細(xì)胞生長減緩對人工基因元件的利用造成諸多不良影響。除削弱元件預(yù)測性外，生長壓力帶來的負(fù)向篩選作用會減弱人工基因回路的遺傳穩(wěn)定性。盡管底盤細(xì)胞DNA的基礎(chǔ)突變率極低，如果突變體相對元件宿主具有生長優(yōu)勢便會很快占據(jù)群落的主體，使元件在群體層次上失效。例如，You等設(shè)計(jì)的控制細(xì)胞群體大小的元件在傳代培養(yǎng)3–6 d后就由于產(chǎn)生的逃脫調(diào)控的突變體具有生長優(yōu)勢，大量增殖而失效[19]。

1.2 基因元件特異調(diào)控會導(dǎo)致細(xì)胞毒性

基因元件除了跟預(yù)期目標(biāo)靶位點(diǎn)相互作用以外，還可能對未預(yù)料的特定基因發(fā)生特異調(diào)控作用，并對底盤細(xì)胞生理功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)胞毒性 (Toxicity)。雖然這種基于調(diào)控產(chǎn)生毒性的表現(xiàn)往往也是細(xì)胞生長緩慢乃至死亡，但由于這些元件的表達(dá)量不足以造成嚴(yán)重的細(xì)胞資源的占用，我們將其與生物元件過表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長壓力區(qū)別開來，稱之為細(xì)胞毒性。

為了構(gòu)造更為復(fù)雜的人工生命系統(tǒng)，獲取能夠同時使用而不相互干涉的正交元件庫是必需的[20]。獲取正交元件的思路之一是運(yùn)用生物信息學(xué)手段從不同物種挖掘?qū)儆谕患易宓脑捎谶@些元件和底盤細(xì)胞沒有經(jīng)過漫長的共同進(jìn)化，它們之間可能存在意料之外的相互作用[6]。如圖1A所示，Stanton等對tetR家族的阻遏蛋白進(jìn)行了挖掘，發(fā)現(xiàn)的一些元件在其表達(dá)量足夠?qū)芈份敵霎a(chǎn)生調(diào)控作用時，細(xì)胞的生長也開始受到影響[10]?？紤]到基因組序列上存在許多不活躍的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)[21]，這些阻遏蛋白的細(xì)胞毒性很可能來源于轉(zhuǎn)錄因子與宿主DNA序列特異性結(jié)合而導(dǎo)致的相互作用。另外，即使單個阻遏蛋白表現(xiàn)的細(xì)胞毒性較小，用多個阻遏蛋白構(gòu)建回路時其細(xì)胞毒性可能積累對細(xì)胞生長造成嚴(yán)重影響[1]。產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制不局限于調(diào)控蛋白-DNA序列互作層面，基于蛋白-蛋白互作設(shè)計(jì)的元件也可能造成細(xì)胞毒性。Rhodius等從ECF σ因子、抗σ因子 (Extracytoplasmic function σs，anti σs) 中挖掘轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件時,發(fā)現(xiàn)部分σ因子、抗σ因子在較高表達(dá)量時，由于與內(nèi)源RNA聚合酶競爭結(jié)合由α2ββ′ω亞基組成的核心酶(Core enzyme)，導(dǎo)致內(nèi)源基因異常表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞毒性[9]。

不只是一些新挖掘的元件，許多已經(jīng)在多種宿主中廣泛使用的優(yōu)質(zhì)元件其細(xì)胞毒性也限制了其作用的發(fā)揮和推廣。CRISPRi-dCas9 (CRISPR interference-dCas9) 調(diào)控系統(tǒng)被認(rèn)為是優(yōu)秀的可編程的調(diào)控元件，目前已被廣泛用于基因回路構(gòu)建和代謝工程調(diào)控[11,22]，然而dCas9隨其表達(dá)量升高、抑制效果增強(qiáng)會導(dǎo)致細(xì)胞生長遲滯的現(xiàn)象在多篇文章中都有所報道[23–24]，如圖1B所示。一些研究者認(rèn)為該毒性的來源是CRISPR具有的脫靶效應(yīng)[25]。CRISPRi-dCas9的毒性導(dǎo)致其在實(shí)際使用時，需要耗費(fèi)使用者大量精力平衡轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)的正面影響與其對細(xì)胞生長的負(fù)面影響。

合成生物學(xué)的元件設(shè)計(jì)最終要針對下游應(yīng)用問題的解決而調(diào)整，需要宿主細(xì)胞的健康快速生長，因此元件的細(xì)胞毒性是其應(yīng)用的瓶頸問題之一。

圖1 tetR家族的阻遏蛋白(A) 和dCas9 (B) 的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞毒性(圖1A源自文獻(xiàn)[10]；圖1B源自文獻(xiàn)[23])

1.3 細(xì)胞體內(nèi)特殊生理機(jī)制會影響元件內(nèi)稟 參數(shù)

元件的內(nèi)稟參數(shù)是指用于數(shù)學(xué)描述元件行為的參數(shù)，如啟動子的啟動強(qiáng)度，阻遏蛋白的解離常數(shù)、希爾系數(shù)等。由于這些參數(shù)都是在特定條件下由實(shí)驗(yàn)測定或擬合得到的，變更培養(yǎng)條件或更換元件宿主從而改變細(xì)胞的生理?xiàng)l件會影響元件的內(nèi)稟參數(shù)。影響元件內(nèi)稟參數(shù)的細(xì)胞體內(nèi)特殊生理機(jī)制主要包括：1) 細(xì)胞資源競爭導(dǎo)致內(nèi)稟參數(shù)耦合；2) 追溯效力 (Retroactivity)；3) 細(xì)胞生長狀態(tài)影響元件表達(dá)相關(guān)參數(shù)，本節(jié)將對這些機(jī)制分別展開介紹。

合成生物學(xué)元件和宿主細(xì)胞共同利用細(xì)胞內(nèi)的酶等有限資源，資源競爭會導(dǎo)致設(shè)計(jì)上互不干涉的構(gòu)建產(chǎn)生功能上的耦合。如圖2A所示，Cookson等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)帶有LAA蛋白降解標(biāo)簽的黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白在同一細(xì)胞中表達(dá)時，提高其中一個熒光蛋白的表達(dá)量會導(dǎo)致另一熒光蛋白熒光值提高。這是由于兩者共用內(nèi)源的ClpXP降解機(jī)器，蛋白過表達(dá)造成降解機(jī)器過載，使得其內(nèi)稟參數(shù)蛋白降解速率產(chǎn)生耦合。這一機(jī)制被稱為排隊(duì)效應(yīng) (Queueing-up effect)[26]。與此類似，RNA對核糖體的競爭也會導(dǎo)致翻譯層次的耦合。Tabor等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含有類似RBS序列的sRNA (Small RNA) 大量表達(dá)會結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的核糖體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的翻譯效率下降，表現(xiàn)為同時表達(dá)的GFP表達(dá)量降低。

追溯效力 (Retroactivity) 是指信號通路下游的系統(tǒng)給上游系統(tǒng)帶來信號反饋，從而影響上游系統(tǒng)功能的效應(yīng)[5]。以合成生物學(xué)系統(tǒng)中常用的，阻遏蛋白結(jié)合操作子序列介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程為例：上游模塊表達(dá)阻遏蛋白作為輸出信號分子，由于這個阻遏蛋白特異識別多個下游模塊的操作子序列，并結(jié)合到操作子DNA上完成轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此阻遏蛋白的濃度就作為下游模塊輸入信號影響其輸出信號。如果阻遏蛋白在上游模塊中還結(jié)合了其他模塊的操作子DNA序列，會導(dǎo)致作為下游模塊輸入信號的轉(zhuǎn)錄因子有效濃度下降，因此額外操作子的存在將影響上下游模塊組裝的可預(yù)測性。如圖2B所示，Jayanthi等利用一個簡易系統(tǒng)說明了回溯活性的影響[27]。在構(gòu)建上游模塊時，他們將融合了降解標(biāo)簽LVA的綠色熒光蛋白置于lacⅠ阻遏蛋白抑制的PLac啟動子表達(dá)下，lacⅠ則由誘導(dǎo)劑atc (無水四環(huán)素) 誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)添加1個相當(dāng)于其他模塊且含有l(wèi)acO操作子序列的質(zhì)粒時，待測試模塊的行為發(fā)生了變化：加入atc抑制綠色熒光蛋白表達(dá)和去除atc解開綠色熒光蛋白表達(dá)抑制時，該實(shí)驗(yàn)組相對于沒有額外lacO操作子的對照組都有一定程度的延遲，這就是由于其他模塊與上游待測模塊競爭了lacⅠ所導(dǎo)致的結(jié)果。

在細(xì)胞體內(nèi)，基因元件的相關(guān)參數(shù)會隨著細(xì)胞生長狀態(tài)改變而改變。細(xì)胞內(nèi)基因的實(shí)際拷貝數(shù)、RNA、蛋白豐度都受生長速率影響[28]；細(xì)胞內(nèi)外的信號則會對基因表達(dá)產(chǎn)生全局性的調(diào)控[29]。Zhang等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在的生長平臺期添加IPTG已經(jīng)無法有效誘導(dǎo)pTAC啟動子表達(dá)報告基因，正體現(xiàn)了細(xì)胞生長狀態(tài)對元件表達(dá)影響的復(fù)雜性[30]。

2 人工基因元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的刻畫和不利影響的消除方法

基于上述人工基因元件與細(xì)胞生理系統(tǒng)之間的相互干涉效應(yīng)，近年來不少研究者開始進(jìn)行這種相互干涉作用的定量刻畫工作并針對性地總結(jié)和驗(yàn)證人工合成生物系統(tǒng)的去干涉設(shè)計(jì)原則，使得合成生理學(xué)有了基本的框架和研究范式。本節(jié)將總結(jié)近期合成生理學(xué)范圍內(nèi)的代表性工作，并介紹目前如何通過工程化設(shè)計(jì)和生物物理模型消除或精準(zhǔn)考慮這些因素的影響。

2.1 元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的刻畫

傳統(tǒng)刻畫生長壓力的方法就是通過觀察宿主相對于對照的生長速率變化，然而該方法只有當(dāng)生長壓力足夠大時，才能在表型上表現(xiàn)出顯著差別。如圖3A所示，Ceroni等開發(fā)了一套基于熒光檢測的細(xì)胞生長壓力檢測方法，將一個常量表達(dá)的綠色熒光蛋白基因用噬菌體整合酶整合到基因組的特定位點(diǎn)上，考慮到綠色熒光蛋白的表達(dá)不受特異性調(diào)控，其表達(dá)量應(yīng)該能反映資源分配對細(xì)胞全局表達(dá)的影響。該工作中作者用單位細(xì)胞產(chǎn)生的熒光表征或監(jiān)測細(xì)胞資源的容量 (Capacity)，測試不同質(zhì)?？截悢?shù)、啟動子強(qiáng)度、RBS強(qiáng)度組合下的人工基因元件對細(xì)胞資源的占用情況，得出相比于DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程，其翻譯過程中人工基因元件對核糖體的占用是導(dǎo)致宿主生長壓力的主要來源[31]。該方法為優(yōu)化元件表達(dá)策略提供了開創(chuàng)性的定量和評價方法。除此之外，也有工作還關(guān)注利用無細(xì)胞系統(tǒng) (Cell-free system) 定量研究特定構(gòu)建對宿主資源的占用(圖3B)[32]。無細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)勢在于實(shí)驗(yàn)簡便，反應(yīng)體系小，便于高通量化，但由于只保留了轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，系統(tǒng)的循環(huán)能力較弱，諸如NTP水解以及酶降解的因素會導(dǎo)致蛋白合成的過早終止，使元件在系統(tǒng)中的行為與體內(nèi) () 的行為之間存在相當(dāng)大的差別。

對元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)的相互作用進(jìn)行刻畫，一方面為研究者在設(shè)計(jì)基因回路時比較不同設(shè)計(jì)方案提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持；另一方面該類工作能找出相互作用中的關(guān)鍵因素，有助于發(fā)現(xiàn)更多具有普適性的回路設(shè)計(jì)原則。

2.2 元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的消除

針對基因元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用導(dǎo)致其功能預(yù)測性削弱，研究者可以通過某些工程化設(shè)計(jì)方案消除這些影響；或通過強(qiáng)大的生物物理模型精準(zhǔn)考慮這些因素的影響，將其包含在元件行為的預(yù)測模型中，以提高對元件組裝后行為預(yù)測的準(zhǔn)確性。

關(guān)于減小人工基因元件對宿主細(xì)胞造成的生長壓力，最直接的方法是在完成同樣功能的設(shè)計(jì)中選擇消耗資源較少的一種。例如Arkin實(shí)驗(yàn)室利用fim整合酶系統(tǒng)構(gòu)建了一系列記憶存儲裝置，當(dāng)裝置接受誘導(dǎo)劑的輸入信號時重組酶的表達(dá)可以使特定的DNA序列反向，并利用這段DNA序列的方向儲存接收輸入信號的“記憶”[33–34]。選擇執(zhí)行記憶儲存功能的裝置時，這種利用重組酶系統(tǒng)的設(shè)計(jì)相比利用轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控實(shí)現(xiàn)的扳式開關(guān) (Toggle switch)[35]很可能是一個更好的選擇，因?yàn)楹笳邇Υ嫘畔⒁揽康氖翘囟ㄞD(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的高濃度，需要不斷地占用細(xì)胞的資源表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維持這一狀態(tài)。

解決基因元件特異調(diào)控導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，則可從3個方面入手：1) 在開發(fā)合成生物學(xué)元件時，注意測試元件的細(xì)胞毒性，舍棄具有毒性的元件，提升合成生物學(xué)工具箱的質(zhì)量。關(guān)于這一點(diǎn)，前文提到的Voigt實(shí)驗(yàn)室開發(fā)tetR家族的阻遏蛋白工具箱的工作提供了很好的范例[10]；2) 通過實(shí)驗(yàn)深入挖掘元件毒性的產(chǎn)生機(jī)理，據(jù)此在回路設(shè)計(jì)中進(jìn)行規(guī)避。如Kimelman等對無法在中得到克隆的DNA序列進(jìn)行分析，挖掘其中具有毒性 (或表達(dá)產(chǎn)物具有毒性) 的DNA序列，其中很重要的一部分是具有DnaA box的序列。在中DnaA蛋白結(jié)合到DnaA box上啟動DNA復(fù)制。該工作之后通過實(shí)驗(yàn)證明多拷貝的DnaA box與DnaA相互作用會導(dǎo)致細(xì)胞毒性。這一類的研究提供的信息能夠有效指導(dǎo)我們在設(shè)計(jì)中選擇可靠的元件；3) 表達(dá)具有潛在毒性的元件時，應(yīng)考慮采用誘導(dǎo)激活的表達(dá)方式，并采用諸如sRNA抑制等策略減小其泄露表達(dá)量[20]。

對于細(xì)胞體內(nèi)特殊生理機(jī)制會影響元件內(nèi)稟參數(shù)的問題，一個可行的解決辦法是將人工基因元件與細(xì)胞生理系統(tǒng)解耦合。利用與宿主細(xì)胞正交的外源表達(dá)系統(tǒng)可以將元件的表達(dá)從宿主細(xì)胞中隔離開來。這一方面應(yīng)用較為廣泛的是T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，T7家族RNA聚合酶來源于噬菌體，識別的啟動子序列特征與等宿主細(xì)胞內(nèi)源啟動子有相當(dāng)大的差別，保證了正交性，常被用于合成生物學(xué)元件的表達(dá)。如Kushwaha等使用T7 RNA聚合酶-啟動子構(gòu)建了一套基于反饋調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)，在、、中都實(shí)現(xiàn)了元件的穩(wěn)定表達(dá)[36]。另一個例子是Cameron等利用煙草病毒來源的Lon蛋白酶在中控制人工基因元件的降解，避免內(nèi)源的降解系統(tǒng)過載，如圖4所示[37]。追溯效力導(dǎo)致的影響則可以通過絕緣子元件的設(shè)計(jì)將上下游信號通路隔離而解決。Mishra等在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄因子濃度作為輸入-輸出的信號通路上下游間添加了基于磷酸化快反應(yīng)的絕緣裝置，削弱了由追溯效力導(dǎo)致的信號傳導(dǎo)延滯[38]。

另一種思路是通過強(qiáng)大的生物物理模型精準(zhǔn)考慮元件-細(xì)胞生理系統(tǒng)相互作用的影響，將其包含在元件行為的模型中提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。在這方面的成功范例是Salis實(shí)驗(yàn)室關(guān)于RBS calculator的一系列工作。RBS calculator基于熱力學(xué)原理考慮mRNA二級結(jié)構(gòu)、mRNA-rRNA相互作用計(jì)算不同轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始效率，輸入不同宿主的16S rRNA序列可以有效實(shí)現(xiàn)跨宿主的計(jì)算[39-40]。

圖4 利用與宿主細(xì)胞正交的外源系統(tǒng)可以將元件的表達(dá)和降解從宿主細(xì)胞中隔離開來(改編自文獻(xiàn)[38]和文獻(xiàn)[39])

3 結(jié)論與展望

過去十幾年間，合成生物學(xué)元件工具箱以及組裝方法的開發(fā)經(jīng)歷了“從零到一”的飛躍，然而元件-宿主細(xì)胞的相互作用卻阻礙了人工設(shè)計(jì)的生命系統(tǒng)的復(fù)雜度進(jìn)一步提升。近期許多研究者開始關(guān)注細(xì)胞生理系統(tǒng)對人工基因元件的影響以及相關(guān)元件設(shè)計(jì)原則等合成生物學(xué)領(lǐng)域基本工程科學(xué)問題。這些研究對未來合成生理學(xué)的方向很有啟發(fā)作用。未來合成生理學(xué)的研究應(yīng)在以下幾點(diǎn)展開：1) 注重刻畫元件在不同培養(yǎng)條件下功能和行為，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述和定量方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，便于數(shù)據(jù)的整合和分享；2) 開發(fā)基于轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等多層次高通量技術(shù)，降低獲取合成生物學(xué)構(gòu)建表型數(shù)據(jù)的資金和時間成本，并作針對性地?cái)?shù)據(jù)挖掘，為理解元件-宿主相互作用的產(chǎn)生機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持；3) 根據(jù)需要開發(fā)粗粒化和精細(xì)的全細(xì)胞模型，用于描述資源分配等細(xì)胞生理規(guī)律，增強(qiáng)人工合成生物系統(tǒng)的預(yù)測性；4) 研發(fā)元件-宿主隔離技術(shù)和策略，總結(jié)消除兩者相互作用影響的設(shè)計(jì)原則，例如前文提到的利用正交外源表達(dá)系統(tǒng)將元件表達(dá)從宿主細(xì)胞中隔離的策略。合成生理學(xué)的深入研究將使我們真正實(shí)現(xiàn)人工生命系統(tǒng)設(shè)計(jì)的精準(zhǔn)化，促進(jìn)合成生物學(xué)成果在應(yīng)用領(lǐng)域的高效轉(zhuǎn)化。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

婁春波 中國科學(xué)院微生物研究所研究員、博士生導(dǎo)師，2009年畢業(yè)于北京大學(xué)軟凝聚態(tài)物理專業(yè)，先后在美國加州大學(xué)舊金山分校和麻省理工學(xué)院從事合成生物學(xué)與基因線路，2014年入選中組部“青年千人計(jì)劃”。目前研究領(lǐng)域包括：1) 人工生命系統(tǒng)的安全性和可控性設(shè)計(jì)；2) 大尺寸天然產(chǎn)物基因簇激活和重新編輯；3) 亞基因組水平DNA高效組裝和編輯新技術(shù)；4) 基因線路的定量設(shè)計(jì)與微生物發(fā)酵智能開關(guān)設(shè)計(jì)；5) 調(diào)控元件的模塊化與正交化設(shè)計(jì)。已在、、、和等國際著名雜志發(fā)表文章20余篇，已申請國際專利3項(xiàng)、國內(nèi)專利5項(xiàng)?，F(xiàn)任北京生物工程學(xué)會理事，中國微生物學(xué)會分子微生物學(xué)與生物工程專業(yè)委員會委員，生物技術(shù)期刊編委。

Advances in synthetic physiology of artificial genetic parts

Xiangyu Ji1,2, Huiwei Zhao1, and Chunbo Lou1,2

1 CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Artificial genetic parts should be modularized and can be predictably scaled upassembly or reused in other contexts. Under intracellular physiological conditions, however, the functions of the assembled parts are severely impeded by multi-level physiological interference, i.e., most artificial assembled systems cannot be functional as predicted. Here we proposed a concept of synthetic physiology, defining it as the branch of synthetic biology to investigate and control interferences between artificial genetic parts and intracellular physiological system. Under such framework, we describe the part-host interactions and review the methods and strategies used to characterize and address these interactions.

synthetic biology, synthetic physiology, artificial genetic parts, chasis cell, interaction

January 9, 2017; Accepted: February 24, 2017

Chunbo Lou. Tel/Fax: +86-10-64806105; E-mail: louchunbo@im.ac.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31470818).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31470818) 資助。