新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1

楊帆，李寅

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新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1

楊帆1,2，李寅1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

楊帆, 李寅. 新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(3): 361–371.Yang F, Li Y. The new generation tool for CRISPR genome editing: CRISPR/Cpf1. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 361–371

CRISPR/Cas系統(tǒng)幾乎存在于所有的細(xì)菌和古菌中，是用來(lái)抵御外來(lái)病毒和噬菌體入侵的獲得性免疫防御機(jī)制。2012年起CRISPR/Cas9被改造為基因編輯工具，并衍生出一系列高效、便捷的基因編輯工具，迅速在基礎(chǔ)理論、基因診斷和臨床治療等研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。然而，CRISPR/Cas9也存在細(xì)胞毒性、脫靶效應(yīng)和基因插入困難等一些亟待解決的問(wèn)題，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的應(yīng)用。Cpf1是2015年報(bào)道的一種新型CRISPR效應(yīng)蛋白，具有許多與Cas9不同的特性，有利于克服CRISPR/Cas9應(yīng)用中的一些限制。本文綜述了近兩年來(lái)對(duì)CRISPR/Cpf1的研究進(jìn)展和應(yīng)用，并對(duì)其應(yīng)用前景和發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

Cpf1，Cas9，CRISPR，基因編輯

CRISPR/Cas系統(tǒng) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein) 是細(xì)菌和古菌在抵御外來(lái)病毒和噬菌體入侵的過(guò)程中不斷進(jìn)化而來(lái)的一種獲得性免疫防御機(jī)制。CRISPR的研究始于1987年，于2002年被正式命名，至2011年其獲得性免疫防御機(jī)制基本研究清楚[1]。2012年，Jinek等證實(shí)了Cas9可以在體外條件下與DNA靶序列的特定位點(diǎn)結(jié)合并進(jìn)行剪切，由此揭開(kāi)了將CRISPR/Cas9改造為基因編輯工具的序幕[1-2]。

人類基因組計(jì)劃使人們能夠讀取“生命代碼”，CRISPR/Cas9及其衍生技術(shù)則是人類改寫(xiě)生命代碼的“神筆”。近5年來(lái)，CRISPR/Cas9技術(shù)為生物領(lǐng)域帶來(lái)了巨大的沖擊，2013年被雜志評(píng)為十大科學(xué)突破之一，2015年更是榮登榜首。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，科學(xué)家們能夠高效、精確地對(duì)DNA序列進(jìn)行修剪、替換或添加，可以快速地實(shí)現(xiàn)微生物基因組編輯、動(dòng)植物的品種優(yōu)化、動(dòng)物模型構(gòu)建，甚至推動(dòng)疾病治療的顛覆性革命[1,3-4]。

然而，隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas9也暴露了它的缺陷和局限性，例如嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[1,5-6]。如何改造CRISPR/Cas9，降低其脫靶效應(yīng)，提高基因編輯精確度，是目前科學(xué)家們關(guān)注和研究的重點(diǎn)[7]。

與此同時(shí)，科學(xué)家們也致力于尋找新的基因編輯系統(tǒng)。2015年，麻省理工學(xué)院(Massachusetts Institute of Technology，MIT) 的張峰小組報(bào)道了一種新的2類V型CRISPR效應(yīng)蛋白Cpf1，是在單鏈向?qū)NA引導(dǎo)下與靶DNA特定位點(diǎn)結(jié)合并切割的核酸內(nèi)切酶[8]。

與Cas9相比，Cpf1只需一段42?44個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA即可識(shí)別和剪切DNA，從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)步驟，更有利于多基因編輯；Cpf1能夠識(shí)別富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列 (Protospacer adjacent motif)，可以擴(kuò)展CRISPR的編輯范圍；此外，Cpf1剪切會(huì)產(chǎn)生黏性末端，可促進(jìn)目的基因通過(guò)非同源重組的方式插入靶定位點(diǎn)。CRISPR/Cpf1的開(kāi)發(fā)有利于突破和克服CRISPR/Cas9應(yīng)用中的一些限制[9]，因此被稱為是新一代的CRISPR基因組編輯工具。

1 CRISPR系統(tǒng)的分類和作用機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)存在于幾乎所有的古菌和大多數(shù)細(xì)菌中[10]。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白 (Cas1、Cas2、Cas4和效應(yīng)蛋白如Cas9、Cpf1等) 的編碼基因和一段CRISPR序列組成，后者由一段前導(dǎo)序列、許多重復(fù)序列和間隔序列順序排列組成。

根據(jù)Cas基因的組成和效應(yīng)蛋白的數(shù)量，CRISPR被分為了2類5型，共16種亞型[11-12]。1類為利用多個(gè)效應(yīng)蛋白復(fù)合物干擾靶基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2類為利用單一的效應(yīng)蛋白干擾靶基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究得最為清楚的CRISPR/Cas9為2類Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，2015年張鋒小組新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpf1屬于2類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)。

無(wú)論哪一類型的CRISPR系統(tǒng)，其抵御外來(lái)遺傳物質(zhì)入侵的免疫防御過(guò)程都可分為3個(gè)階段[13]：

第一為適應(yīng)階段，首次入侵的外源DNA的前間隔序列 (Protospacer) 被古菌或細(xì)菌中的Cas蛋白獲取，并作為間隔序列 (Spacer) 插入CRISPR中的兩段重復(fù)序列之間。

第二為表達(dá)階段，外源DNA再次入侵時(shí)，細(xì)菌開(kāi)始轉(zhuǎn)錄CRISPR，形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重復(fù)序列位點(diǎn)內(nèi)切割形成成熟的crRNA。

第三為干擾階段，成熟的crRNA與特異的CRISPR效應(yīng)蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合體，識(shí)別并切割能與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的外源DNA，造成雙鏈斷裂，激活細(xì)胞的非同源末端連接 (Non-homologous end joining，NHEJ) 或同源重組 (Homologous recombination，HR) 兩種修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或修飾。

2 Cpf1與Cas9的比較

Cpf1首先在新兇手弗朗西斯菌和普雷沃菌等微生物中被發(fā)現(xiàn)和Cas9同時(shí)存在，根據(jù)其基因組成及作用機(jī)制，CRISPR/Cpf1被確定為2類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)[8]。

然而，CRISPR/Cpf1的作用機(jī)制與同為2類的CRISPR/Cas9系統(tǒng)有很大的不同 (表1)。

第一，Cpf1的分子量比Cas9小。目前廣泛使用的Cas9來(lái)源于釀膿鏈球菌(下文簡(jiǎn)寫(xiě)為spCas9)，含有1 368個(gè)氨基酸；而新兇手弗朗西斯菌U112、氨基酸球菌sp. BV3L6和毛螺科菌ND2006來(lái)源的Cpf1 (下文分別簡(jiǎn)寫(xiě)為FnCpf1、AsCpf1和LbCpf1) 分別含有1 300、1 307和1 228個(gè)氨基酸。

第二，Cas9和Cpf1均是單鏈RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，但Cas9只具有DNA內(nèi)切酶活性，而Cpf1同時(shí)具有DNA和RNA內(nèi)切酶活性。

第三，CRISPR/Cas9初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA的成熟需要反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA) 與crRNA互補(bǔ)配對(duì)，在Cas9存在的條件下，由RNase Ⅲ加工完成。而CRISPR/Cpf1的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的參與[8,14]。

第四，Cas9與由crRNA和tracrRNA配對(duì)形成的RNA二聚體結(jié)合，形成Cas9-crRNA-tracrRNA核糖核蛋白復(fù)合體，識(shí)別和切割靶基因序列。將crRNA和tracrRNA融合成一條sgRNA (Single-guide RNA)，也可以引導(dǎo)Cas9切割DNA；sgRNA長(zhǎng)度一般大于100 nt，靶定不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的sgRNA。而Cpf1與成熟crRNA形成Cpf1-crRNA核糖核蛋白二元復(fù)合體，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的識(shí)別和剪切；Cpf1剪切DNA所需的crRNA長(zhǎng)度僅為42?44 nt，只需要替換CRISPR中的間隔序列就可以靶定不同基因，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)編輯，因此設(shè)計(jì)步驟可以顯著簡(jiǎn)化，實(shí)驗(yàn)成本也可以顯著降低，同時(shí)降低了將CRISPR/Cpf1系統(tǒng)遞送至編輯對(duì)象的難度。

第五，Cas9識(shí)別位于靶序列的3′端的富含胞嘧啶 (G) 的PAM序列 (5′-NGG-3′)，而Cpf1識(shí)別位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列。另外，不同來(lái)源的Cpf1識(shí)別的PAM序列也有所不同：FnCpf1識(shí)別的PAM序列為5′-YTN-3′，AsCpf1和LbCpf1識(shí)別的PAM序列為5′-TTTN-3′。Cpf1識(shí)別的PAM序列與Cas9不同，極大地?cái)U(kuò)寬了CRISPR系統(tǒng)基因組編輯的靶點(diǎn)范圍，尤其是富含AT的基因組。

第六，Cas9剪切位點(diǎn)離PAM序列很近，在其上游第3個(gè)核苷酸處進(jìn)行切割，若發(fā)生NHEJ修復(fù)，造成的核苷酸插入或缺失會(huì)改變PAM臨近序列，導(dǎo)致Cas9無(wú)法再次識(shí)別和切割靶位點(diǎn)，從而阻礙同源重組修復(fù)在靶位點(diǎn)引入正確的基因編輯；而Cpf1的剪切位點(diǎn)離PAM序列較遠(yuǎn)，在靶DNA鏈的PAM序列下游第23位核苷酸和非靶DNA鏈的第18位核苷酸處進(jìn)行切割，NHEJ修復(fù)造成的核苷酸插入或缺失，不會(huì)改變PAM臨近序列，Cpf1仍然可以識(shí)別和切割靶基因，同源重組修復(fù)依然可以在靶位點(diǎn)引入正確的基因編輯，從而提高了CRISPR系統(tǒng)的基因編輯效率，也便于對(duì)同一位點(diǎn)進(jìn)行多輪的基因編輯。

第七，Cas9切割DNA形成一個(gè)平末端；而Cpf1切割DNA形成一個(gè)有5個(gè)核苷酸突出的黏性末端。利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因插入時(shí)，需要在插入基因的兩端添加較長(zhǎng)的同源臂，通過(guò)同源重組的方式將其插入靶位點(diǎn)；而利用CRISPR/Cpf1進(jìn)行基因插入時(shí)，若在插入基因的兩端添加與靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的黏性末端，就可以使插入基因通過(guò)NHEJ修復(fù)以可控的方向插入靶位點(diǎn)，而不必依賴于同源重組。因此，對(duì)于同源重組發(fā)生概率較低的編輯對(duì)象，CRISPR/Cpf1是有利的基因編輯工具。

表1 Cpf1和Cas9的比較

3 Cpf1的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究

2014年，張峰小組解析了Cas9-sgRNA-DNA三元復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了Cas9識(shí)別和切割靶向DNA的分子機(jī)制，并為Cas9的改造和優(yōu)化提供了充分的依據(jù)[15]。

Cpf1呈現(xiàn)與Cas9不同的剪切特性，如具有RNA內(nèi)切酶活性、識(shí)別富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列、切割產(chǎn)生黏性末端等。為了研究Cpf1識(shí)別和剪切RNA以及DNA的分子機(jī)制，研究人員對(duì)Cpf1核糖核蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，并比較了Cpf1與Cas9識(shí)別和剪切目標(biāo)基因機(jī)制的異同。

3.1 Cpf1-crRNA二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析

2016年4月，哈爾濱工業(yè)大學(xué)的黃志偉教授課題組成功解析了LbCpf1-crRNA核糖核蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了Cpf1識(shí)別crRNA和剪切pre-crRNA的分子機(jī)制[16]。

與Cas9相似，LbCpf1與crRNA結(jié)合形成的二元復(fù)合物也為二裂片結(jié)構(gòu)，外觀呈三角形，中心形成一個(gè)帶正電荷的通道。LbCpf1在沒(méi)有crRNA結(jié)合的狀態(tài)下處于松散的構(gòu)象，crRNA的結(jié)合并不誘導(dǎo)LbCpf1寡聚化，而是引發(fā)Cpf1發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)變?yōu)榫o湊的三角形結(jié)構(gòu)，使得crRNA可以和靶基因序列在蛋白中心的正電荷通道內(nèi)形成異源雙鏈核酸分子。另外，該晶體結(jié)構(gòu)顯示LbCpf1的RNA酶活性與其H843、K852以及K869的3個(gè)氨基酸有關(guān)。

然而，sgRNA與crRNA長(zhǎng)度的差異，導(dǎo)致Cas9和sgRNA的結(jié)合方式與Cpf1和crRNA的結(jié)合方式有很大差別。除去與靶DNA互補(bǔ)配對(duì)的向?qū)蛄校瑂gRNA其余部分的長(zhǎng)度是crRNA重復(fù)序列的3.5?4倍，并含有多個(gè)結(jié)構(gòu)模塊，sgRNA以伸展的構(gòu)象與Cas9結(jié)合，擴(kuò)大了sgRNA和Cas9的接觸面積，增加了與Cas9之間的相互作用，以維持Cas9多個(gè)結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。crRNA則呈一種高度扭曲的構(gòu)象，被LbCpf1蛋白中部的寡聚核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Oligonucleotide binding domain，OBD) 識(shí)別。crRNA的長(zhǎng)度較短，Cpf1的多個(gè)結(jié)構(gòu)域不與crRNA相互作用，在結(jié)合目標(biāo)DNA時(shí)依然可以發(fā)生空間位移。

因此，Cpf1-crRNA二元復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，也為研究crRNA如何誘導(dǎo)Cpf1識(shí)別和結(jié)合DNA底物提供了一定的依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)Cpf1-crRNA-DNA三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析表明，Cpf1和crRNA、Cas9和sgRNA不同的結(jié)合方式也導(dǎo)致了兩者DNA底物識(shí)別機(jī)制的差異。

3.2 Cpf1-crRNA-targeted DNA三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析

為了闡述Cpf1如何識(shí)別和剪切DNA，MIT的張峰研究組和東京大學(xué)Osamu Nureki教授、中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的高璞研究組與紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究人員先后解析了AsCpf1-crRNA-DNA三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)[17-18]。

Cpf1和Cas9的核糖核蛋白三元復(fù)合物具有相似的整體結(jié)構(gòu)。AsCpf1與Cas9同樣采用二裂片結(jié)構(gòu)，外觀呈蟹鉗狀，分為識(shí)別葉 (Recognition lobe，REC) 和核酸酶葉 (Nuclease lobe，NUC)。但不同的是，Cas9核酸酶葉包含RuvC和HNH兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別負(fù)責(zé)切割非靶向和靶向DNA鏈，產(chǎn)生平末端；而AsCpf1的NUC葉沒(méi)有HNH結(jié)構(gòu)域，由RuvC結(jié)構(gòu)域和一個(gè)推定的新的核酸酶結(jié)構(gòu)域 (Nuc) 組成，分別負(fù)責(zé)切割非靶向及靶向DNA鏈，產(chǎn)生黏性末端。RuvC剪切非靶向DNA鏈?zhǔn)荖uc剪切靶向DNA鏈的先決條件。

另外，Cpf1-crRNA二元復(fù)合物和Cpf1- crRNA-DNA三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的比較也揭示了Cpf1與Cas9不同的DNA識(shí)別機(jī)制。

首先，sgRNA和crRNA上靠近PAM序列的區(qū)域均存在一段“種子序列”，可與靶DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)于Cas9和Cpf1識(shí)別和切割DNA至關(guān)重要。由于sgRNA和crRNA在二元復(fù)合體中呈現(xiàn)不同的構(gòu)象，“種子序列”在Cas9-sgRNA二元復(fù)合體中形成有序的A型結(jié)構(gòu)，而在Cpf1-crRNA二元復(fù)合體中是無(wú)序的，在Cpf1-crRNA-DNA三元復(fù)合體中才轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻腁型結(jié)構(gòu)。

其次，PAM互作裂縫在Cas9-sgRNA二元復(fù)合體中也已預(yù)先形成，是Cas9識(shí)別目標(biāo)DNA 的另一個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，但在Cpf1-crRNA二元復(fù)合體中還未形成，目標(biāo)DNA的結(jié)合誘導(dǎo)Cpf1內(nèi)部結(jié)構(gòu)重排，多個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生空間位移，PAM互作裂口經(jīng)歷一個(gè)“從開(kāi)到關(guān)”的構(gòu)象改變，以容納有序的A型種子序列和靶DNA在正電荷通道內(nèi)形成異源雙鏈核酸分子。

Cpf1識(shí)別目標(biāo)DNA時(shí)種子序列“從無(wú)序到有序”和PAM互作裂縫“從開(kāi)到關(guān)”的構(gòu)象變化，可能有利于降低其基因編輯的脫靶效應(yīng)。

4 CRISPR/ Cpf1的應(yīng)用研究

4.1 CRISPR/Cpf1在微生物基因編輯中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9在大腸桿菌[19-20]、酵母[21]等常用的微生物模式菌株中的應(yīng)用已經(jīng)趨于成熟，通過(guò)設(shè)計(jì)一段可與靶基因區(qū)域PAM序列上游20個(gè)核苷酸互補(bǔ)配對(duì)的向?qū)蛄?(N20)，就可以對(duì)宿主的任意基因進(jìn)行編輯。藍(lán)細(xì)菌是一種光合自養(yǎng)的原核生物，近年來(lái)越來(lái)越多地應(yīng)用于光合固碳和高附加值化學(xué)品生物合成的研究[22-24]。然而，和大腸桿菌、酵母等微生物相比，藍(lán)細(xì)菌的基因編輯工具單一，主要依靠其低概率的自發(fā)同源重組，且由于藍(lán)細(xì)菌的基因組拷貝數(shù)較高，插入基因也難以穩(wěn)定存在。

為了改變這一現(xiàn)狀，研究學(xué)者開(kāi)始嘗試將CRISPR/Cas系統(tǒng)改造為藍(lán)細(xì)菌適用的精確、高效的基因編輯工具。最近，CRISPR/Cas9被成功用于藍(lán)細(xì)菌模式菌株細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942和UTEX 2973中[25-26]。然而，研究發(fā)現(xiàn)Cas9對(duì)PCC 7942和UTEX 2973均存在不同程度的細(xì)胞毒性，推測(cè)是由Cas9在非靶位點(diǎn)切割DNA導(dǎo)致雙鏈斷裂而引起的細(xì)胞死亡。

2016年12月，Pakrasi研究組利用CRISPR/Cpf1對(duì)藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行基因編輯[27]。作者將FnCpf1蛋白及靶定目標(biāo)基因的crRNA克隆在廣譜宿主質(zhì)粒RSF1010上，成功地對(duì)UTEX 2973、集胞藻sp. PCC 6803和魚(yú)腥藻7120三種不同類型的藍(lán)細(xì)菌基因組進(jìn)行了基因的敲除、插入和點(diǎn)突變。作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)nCpf1對(duì)藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞毒性比Cas9低得多，因此對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因編輯而言，CRISPR/Cpf1的潛力更大。

4.2 CRISPR/Cpf1在植物基因編輯中的應(yīng)用

目前，CRISPR/Cas9在擬南芥、煙草、小麥和玉米等多種植物基因組編輯中都有廣泛的應(yīng)用[28-31]，也逐漸應(yīng)用于植物基因表達(dá)調(diào)控、表觀基因組學(xué)和遺傳育種等領(lǐng)域。盡管構(gòu)建的Cas9突變體能夠識(shí)別5′-NGA-3′、5′-NGCG-3′等非典型的PAM序列，但是CRISPR/Cas9可編輯的植物基因靶點(diǎn)范圍，依然局限于富含鳥(niǎo)嘌呤 (G) 的基因位點(diǎn)[32]。由于Cpf1識(shí)別的PAM序列與Cas9不同，CRISPR/Cpf1可以進(jìn)一步地?cái)U(kuò)展對(duì)植物基因組的編輯能力。

2016年12月，3個(gè)研究組先后利用CRISPR/Cpf1完成了對(duì)植物基因組的編輯[33-35]。日本學(xué)者Toki等證明了FnCpf1可成功地在煙草和水稻基因組中引入可遺傳的突變，且在水稻中引發(fā)的突變效率比在煙草中要高[35]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的王克劍小組和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的楊建波小組研究發(fā)現(xiàn)LbCpf1能夠?qū)λ净蚪M進(jìn)行有效編輯，但突變效率與靶基因的核苷酸組成有一定的關(guān)系，而AsCpf1則不能完成對(duì)水稻基因組編輯[33-34]。與Cas9一般造成1到2個(gè)核苷酸的插入和缺失不同，Cpf1在所有靶位點(diǎn)均產(chǎn)生6到38個(gè)核苷酸片段的缺失，因此Cpf1可能更適用于植物基因組中長(zhǎng)核苷酸片段的敲除。

有趣的是，Toki和楊建波小組的研究均發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cpf1得到的煙草和水稻突變株都存在雜合子或嵌合體，表明CRISPR/Cpf1誘導(dǎo)的基因突變可能只發(fā)生在1個(gè)等位基因上；或在胚胎細(xì)胞第一次分裂之后，只發(fā)生在部分體細(xì)胞中。在CRIPSR/Cas9對(duì)擬南芥進(jìn)行基因編輯中也報(bào)道過(guò)類似的結(jié)果，研究者發(fā)現(xiàn)用組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)Cas9可以減少嵌合體的產(chǎn)生。因此，利用誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子在時(shí)間和空間上控制Cpf1的表達(dá)，也許能夠減少雜合子或嵌合體的產(chǎn)生。

另外，上述3項(xiàng)研究都對(duì)Cpf1在水稻中潛在的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估。Toki等發(fā)現(xiàn)FnCpf1在煙草和水稻中都存在脫靶效應(yīng)，但脫靶位點(diǎn)的基因突變頻率為0?6.25%，比靶位點(diǎn) (21.4%?23.3%) 低得多。然而，中國(guó)的兩個(gè)研究組均沒(méi)有檢測(cè)到LbCpf1在水稻基因組的脫靶位點(diǎn)處產(chǎn)生的突變。這可能與LbCpf1識(shí)別的PAM序列(5′-TTTN-3′) 比FnCpf1的PAM序列 (5′-TTN-3′) 更長(zhǎng)有關(guān)。PAM序列越長(zhǎng)，基因組上潛在的脫靶位點(diǎn)則更少，Cpf1識(shí)別靶基因的準(zhǔn)確度也越高。

綜上所述，CRISPR/Cpf1是除CPRISPR/Cas9以外可供選擇的一種有效的植物基因組編輯工具，且脫靶效應(yīng)低。盡管如此，CRISPR/Cpf1仍然存在突變效率較低、形成雜合子或嵌合體[35]等亟待解決的問(wèn)題，還需要進(jìn)一步地改良和優(yōu)化，以提高CRISPR/Cpf1對(duì)植物基因組的編輯能力。

4.3 CRISPR/Cpf1在動(dòng)物基因編輯中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)在動(dòng)物研究中也有廣泛的應(yīng)用。目前，研究者們利用CRISPR/Cas9成功地在人體、小鼠、果蠅和羊等動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因編輯[36-39]和基因調(diào)控[40]，在動(dòng)物品種改良方面具有極大的潛力。更令人驚喜的是，越來(lái)越多的研究成果揭示了CRISPR技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景和無(wú)限可能性。例如，成功地構(gòu)建小鼠癌癥模型[41]、重現(xiàn)腫瘤染色體易位[42]、實(shí)現(xiàn)了將艾滋病毒從人類基因組中完全剔除[37]等。

CRISPR系統(tǒng)在動(dòng)物研究中的應(yīng)用仍存在一定問(wèn)題。首先，CRISPR/Cas9存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[1,6-7]，因?yàn)镃as9的特異性僅依賴于sgRNA上靠近PAM序列的10?12個(gè)核苷酸與靶基因的互補(bǔ)配對(duì)，而遠(yuǎn)離PAM序列的其余8?10個(gè)核苷酸發(fā)生堿基錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別沒(méi)有明顯的影響。其次，Cas9的運(yùn)送受限于病毒載體的容量大小，往往需要共轉(zhuǎn)多個(gè)表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的編輯，增加了將Cas9導(dǎo)入編輯對(duì)象的難度[1,43]。

2015年，張峰研究組在16種不同來(lái)源的Cpf1蛋白中發(fā)現(xiàn)AsCpf1和LbCpf1兩種可在人體細(xì)胞中引入片段的插入和缺失[8]。這兩種Cpf1蛋白一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，便被迅速地應(yīng)用于動(dòng)物基因編輯中[44-46]。

基因敲除小鼠模型是研究基因功能、疾病發(fā)生機(jī)理、尋找合適藥物靶標(biāo)的重要工具。2016年，韓國(guó)的兩個(gè)研究組分別將Cpf1 mRNA及其相對(duì)應(yīng)的crRNA[44]、預(yù)組裝的Cpf1核糖核蛋白[45](RNP) 通過(guò)顯微注射法導(dǎo)入小鼠胚胎中，成功獲得了基因突變的小鼠，突變效率與SpCas9相當(dāng)，且均沒(méi)有檢測(cè)到脫靶效應(yīng)。

Cpf1在動(dòng)物中也存在產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象。嵌合體動(dòng)物必須通過(guò)遠(yuǎn)交才能產(chǎn)生純合的、無(wú)嵌合性的突變個(gè)體，需要花費(fèi)數(shù)月或更長(zhǎng)的時(shí)間。與植物一樣，動(dòng)物的嵌合性也是由Cpf1誘導(dǎo)的細(xì)胞突變發(fā)生在胚胎細(xì)胞第一次分裂之后導(dǎo)致的，因此Cpf1在動(dòng)植物中發(fā)揮功能可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間。利用CRISPR/Cas9直接編輯無(wú)性系的供體細(xì)胞，再通過(guò)體細(xì)胞核移植到無(wú)核卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生的個(gè)體嵌合現(xiàn)象可大幅減少；或者利用CRISPR/Cas9直接在供體精子發(fā)生干細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯，也可避免胚胎發(fā)育的全能性和多能性狀態(tài)，從而消除嵌合突變體后代的產(chǎn)生[47]。減少CRISPR/Cpf1產(chǎn)生的嵌合現(xiàn)象也可采用與CRISPR/Cas9類似的方法。

2016年，有兩項(xiàng)研究先后評(píng)價(jià)了Cpf1在人體細(xì)胞中的脫靶效應(yīng)，并與Cas9進(jìn)行了比較[48-49]。首先，Cpf1對(duì)crRNA與靶DNA之間的堿基錯(cuò)配比Cas9更敏感。研究發(fā)現(xiàn)Cpf1對(duì)crRNA的間隔序列 (Spacer) 中靠近PAM序列的第1至18位核苷酸的堿基錯(cuò)配非常敏感，發(fā)生雙堿基錯(cuò)配即可導(dǎo)致Cpf1完全失去剪切活性，對(duì)遠(yuǎn)離PAM序列的第19至23位核苷酸的堿基錯(cuò)配具有較高的容忍度；而Cas9與靶DNA識(shí)別的特異性依賴于靠近PAM序列的前10?12個(gè)核苷酸，而離PAM序列較遠(yuǎn)的其余8?10個(gè)核苷酸的堿基錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別無(wú)顯著影響。其次，Cpf1的脫靶效應(yīng)比Cas9更低。研究人員利用Digenome-seq和GUIDE-seq兩種方法分別在體外和體內(nèi)條件下鑒定了LbCpf1和AsCpf1在人體基因組上的脫靶位點(diǎn)和突變頻率，結(jié)果均表明LbCpf1和AsCpf1在人體基因組上的潛在脫靶位點(diǎn)比spCas9更少，且脫靶位點(diǎn)的基因突變頻率也低于1%，遠(yuǎn)低于靶位點(diǎn)的突變頻率。因此，Cpf1的脫靶效應(yīng)比Cas9要小，對(duì)人類基因組的編輯具有更高的特異性。

如前所述，Cpf1在多基因編輯方面比Cas9更具優(yōu)勢(shì)。2016年，張峰研究組將CRISPR序列中的間隔序列分別替換成靶定不同目的基因的向?qū)蛄校cAsCpf1蛋白表達(dá)在同一個(gè)慢性病毒載體上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人體細(xì)胞中4個(gè)基因和小鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞中3個(gè)基因的同時(shí)編輯[43]。

綜上，CRISPR/Cpf1是一種更有效的動(dòng)物基因編輯工具，比CRISPR/Cas9更加適用于精確的基因組編輯。然而與CRISPR/Cas9一樣，CRISPR/Cpf1在動(dòng)物中也存在產(chǎn)生嵌合體的問(wèn)題，需要進(jìn)一步研究并加以解決。

5 展望

由于Cpf1相對(duì)于Cas9的諸多優(yōu)勢(shì)，CRRISPR/Cpf1的應(yīng)用正在不斷擴(kuò)展。CRISPR/Cpf1在水稻、小鼠和人體細(xì)胞基因編輯的應(yīng)用中都基本沒(méi)有脫靶效應(yīng)，證明了CRRISPR-Cpf1基因編輯的高度特異性，比CRISPR/Cas9更適用于精確的基因組編輯，顯示了CRRISPR/Cpf1在疾病模型建立、抗癌藥物研制、干細(xì)胞治療等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

CRISPR/Cpf1依然存在諸多待解決的問(wèn)題，例如，在植物和動(dòng)物中會(huì)產(chǎn)生嵌合突變體，突變效率可能與靶基因序列的核苷酸組成有關(guān)等。如何提高CRISPR/Cpf1的基因編輯效率？如何擴(kuò)大編輯對(duì)象和靶基因位點(diǎn)的范圍？如何進(jìn)一步提高基因編輯的精確度？如何在基因組水平上進(jìn)行應(yīng)用？如何將CRISPR/Cpf1技術(shù)應(yīng)用于疾病治療？以及由此引發(fā)的安全性和倫理問(wèn)題，也都需要更加深入的研究和規(guī)則的制定加以解決。

CRISPR/Cpf1是生物學(xué)領(lǐng)域非常有價(jià)值的新工具，對(duì)它的研究也才剛剛開(kāi)始，仍有許多發(fā)展、改造和利用的空間。相信在不久的將來(lái)，CRISPR/Cpf1及其衍生技術(shù)能夠和CRISPR/Cas9一起，為科學(xué)研究和生命健康領(lǐng)域提供強(qiáng)大的和多樣化的基因編輯工具。

致 謝：感謝趙同心斧正文章手稿。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

李 寅 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所研究員，《生物工程學(xué)報(bào)》副主編。主要從事微生物分子生理學(xué)與生物技術(shù)研究，在包括、在內(nèi)的國(guó)際期刊上發(fā)表文章120余篇，H因子為31。授權(quán)專利30余項(xiàng)，部分成果已經(jīng)在工業(yè)上獲得應(yīng)用。擔(dān)任、、等 5種國(guó)際期刊的編委，發(fā)展中國(guó)家科學(xué)院青年科學(xué)家網(wǎng)絡(luò)首屆執(zhí)委會(huì)主席，中國(guó)科學(xué)院-發(fā)展中國(guó)家科學(xué)院生物技術(shù)卓越中心主任，中國(guó)科學(xué)院國(guó)際化戰(zhàn)略專家咨詢委員會(huì)委員，獲2012年度發(fā)展中國(guó)家科學(xué)院地區(qū)科技發(fā)展獎(jiǎng)。

The new generation tool for CRISPR genome editing: CRISPR/Cpf1

Fan Yang1,2, and Yin Li1

1 CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Almost all archaea and many bacteria achieve adaptive immunity through a diverse set of CRISPR-Cas systems. From 2012, Cas9 has been harnessed by thousands of laboratories for genome editing applications in a variety of experimental model systems. Cas9 is driving innovative applications from basic biology to biotechnology and medicine. However, numerous challenges still remain, such as limited targeting range, toxicity, and potential for off-target mutagenesis. Cpf1 represents a class 2/type V CRISPR RNA-guided endonuclease that is distinct from the type II CRISPR Cas9 nuclease. Future exploration of strategies using Cpf1 is expected to bring solutions for some of the biggest challenges facing genome editing. Here, we review the development and applications of Cpf1 for a variety of research or applications, and highlight challenges as well as future directions.

Cpf1, Cas9, CRISPR, genome editing

January 28, 2017; Accepted:February 13, 2017

Yin Li. Tel: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

Supported by: Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. ZDRW-ZS-2016-3), National Natural Science Foundation of China (No. 31470231).

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(No. ZDRW-ZS-2016-3)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31470231) 資助。

2017-03-01

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170301.1110.001.html