熊果酸通過(guò)AMPK/STAT3/COX-2信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖*

焦 政 朱國(guó)琴 周逸嬋 徐 嫻 李曉林 李劍萍 何曉璞 徐 偉 邵 耘 孫為豪#

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化科1(210029)

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科2 鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科3

熊果酸通過(guò)AMPK/STAT3/COX-2信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖*

焦 政1朱國(guó)琴1周逸嬋1徐 嫻2李曉林1李劍萍3何曉璞1徐 偉1邵 耘1孫為豪1#

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化科1(210029)

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化科2鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科3

背景：前期研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸通過(guò)下調(diào)環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖，但熊果酸抑制COX-2表達(dá)的分子機(jī)制尚未完全明確。目的：探討單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)/COX-2信號(hào)通路在熊果酸抑制胃癌細(xì)胞增殖中的作用。方法：構(gòu)建AMPK-pLVX、AMPK-shRNA、STAT3-pLVX、STAT3-shRNA質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45，并給予不同濃度或不同培養(yǎng)時(shí)間的熊果酸進(jìn)行培養(yǎng)。以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)磷酸化AMPK、磷酸化STAT3和COX-2表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖。結(jié)果：在SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中，熊果酸呈劑量和時(shí)間依賴性地促進(jìn)AMPK磷酸化、抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)。敲除AMPK基因能阻斷熊果酸抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)的作用，過(guò)表達(dá)STAT3基因能逆轉(zhuǎn)熊果酸抑制COX-2表達(dá)的作用。敲除AMPK基因和過(guò)表達(dá)STAT3基因均可逆轉(zhuǎn)熊果酸抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。結(jié)論：熊果酸可能通過(guò)AMPK/STAT3通路下調(diào)COX-2表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞增殖。

熊果酸； 胃腫瘤； AMP活化蛋白激酶類； STAT3轉(zhuǎn)錄因子； 環(huán)氧化酶2； 細(xì)胞增殖

胃癌是嚴(yán)重影響我國(guó)人民生命健康的惡性腫瘤，術(shù)后總體5年生存率約20%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的5年生存率不到5%[1]。根治性手術(shù)是目前治療胃癌的最有效方法，但近70%的患者確診時(shí)已發(fā)生局部或全身轉(zhuǎn)移，而無(wú)法行手術(shù)切除。因此，尋求有效的輔助治療藥物十分必要，天然藥物及其提取物的抗癌作用近年已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。熊果酸具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和抗突變等生物學(xué)活性，已成為腫瘤化學(xué)預(yù)防的研究熱點(diǎn)[2-3]。本研究的前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶2(COX-2)在胃癌發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，熊果酸通過(guò)下調(diào)COX-2表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但熊果酸抑制COX-2表達(dá)的分子機(jī)制目前尚不明確。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)在人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[6-7]，與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)[8]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)是一種重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)分子，參與與細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞株敲除或過(guò)表達(dá)AMPK、STAT3的質(zhì)粒，旨在探討AMPK/STAT3/COX-2通路在熊果酸抑制胃癌細(xì)胞增殖中的作用。

材料與方法

一、主要材料

1. 藥物和試劑：熊果酸由中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京)提供；BCA試劑盒購(gòu)自Pierce公司；兔抗人AMPK和磷酸化AMPK(p-AMPK)、COX-2、β-actin單克隆抗體、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。ECL試劑盒購(gòu)自Amersham公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，AMPK-shRNA、AMPK-pLVX、STAT3-shRNA、STAT3-pLVX、NC-shRNA以及NC-pLVX質(zhì)粒購(gòu)自漢恒生物科技有限公司。

2. 細(xì)胞株：人胃腺癌中分化細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，人胃腺癌低分化細(xì)胞株MKN-45購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

二、研究方法

1. 藥物配制：熊果酸以DMSO溶解后加入RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度不超過(guò)0.1%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901和MKN-45細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，3 d傳代一次。

3. 質(zhì)粒提取：AMPK、STAT3特異性shRNA和pLVX寡核苷酸鏈合成以及DNA序列測(cè)定由漢恒生物科技有限公司完成，提取純化質(zhì)粒DNA。

4. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，以無(wú)抗菌藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)日細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)步驟行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組，分別給予未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染NC-shRNA或NC-pLVX、轉(zhuǎn)染敲除或過(guò)表達(dá)AMPK和STAT3的質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染與脂質(zhì)體配比為 1∶2.5)。轉(zhuǎn)染后37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 24 h，熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以熊果酸(0、10、20、30 μmol/L)干預(yù)24 h，或以30 μmol/L 熊果酸干預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)，或轉(zhuǎn)染24 h后，加或不加30 μmol/L熊果酸干預(yù)24 h，收集細(xì)胞。預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000×g離心30 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，4 ℃封閉 2 h，分別加入兔抗人AMPK、p-AMPK、STAT3、p-STAT3、COX-2和β-actin抗體(工作濃度均為1∶1 000)，4 ℃ 孵育過(guò)夜，加入二抗，4 ℃孵育2 h。ECL發(fā)光，使用全自動(dòng)熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)對(duì)蛋白電泳條帶行成像和半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5×103個(gè)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，換無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入熊果酸(0、10、20、30 μmol/L)干預(yù)24 h，或轉(zhuǎn)染24 h后，加或不加30 μmol/L 熊果酸干預(yù)24 h，然后每孔加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL和CCK-8溶液10 μL，作用2～4 h。以空白對(duì)照組調(diào)零，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞活力=(處理組A值-空白對(duì)照組A值)/(非處理組A值-空白對(duì)照組A值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、熊果酸對(duì)AMPK、STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)的影響

熊果酸可呈劑量和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)SGC-7901和MKN-45細(xì)胞AMPK磷酸化、抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)(圖1、圖2)。

二、熊果酸通過(guò)AMPK抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，AMPK敲除組SGC-7901和MKN-45細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)顯著降低，而AMPK過(guò)表達(dá)組顯著升高(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

在SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，熊果酸組p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，AMPK敲除組p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與熊果酸組相比，熊果酸+AMPK敲除組p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖4)。與AMPK過(guò)表達(dá)組相比，熊果酸+AMPK過(guò)表達(dá)組p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖5)。

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞0 μmol/L熊果酸組比較，*P<0.05，**P<0.01

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞0 h熊果酸比較，*P<0.05，**P<0.01

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 敲除或過(guò)表達(dá)AMPK對(duì)胃癌細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞陰性對(duì)照組比較，*P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞熊果酸組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖4 敲除AMPK基因?qū)π芄嵋种莆赴┘?xì)胞p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞AMPK過(guò)表達(dá)組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖5 過(guò)表達(dá)AMPK對(duì)熊果酸抑制胃癌細(xì)胞p-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

三、熊果酸通過(guò)STAT3抑制COX-2表達(dá)

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，STAT3敲除組p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而STAT3過(guò)表達(dá)組顯著升高(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖6 敲除或過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)胃癌細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

在SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，熊果酸組COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，STAT3敲除組COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與STAT3敲除組相比，熊果酸+STAT3敲除組COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與熊果酸組相比，熊果酸+STAT3過(guò)表達(dá)組顯著升高(P<0.05)(圖7)。

與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞陰性對(duì)照組比較，*P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞STAT3敲除組、熊果酸組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖7 敲除或過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)胃癌細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

四、熊果酸抑制胃癌細(xì)胞增殖作用的調(diào)控

熊果酸呈劑量依賴性地抑制SGC-7901和MKN-45細(xì)胞增殖。在SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，熊果酸組較陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，熊果酸+AMPK敲除組細(xì)胞活力顯著高于熊果酸組(P<0.05)，熊果酸+STAT3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活力顯著高于熊果酸組(P<0.05)(圖8)。

*與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞空白對(duì)照組比較，P<0.01；+與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞陰性對(duì)照組比較，P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細(xì)胞熊果酸組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖8 敲除AMPK或過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖作用的調(diào)控(CCK-8法)

討 論

近年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及新化療藥物的應(yīng)用，胃癌診治水平有了一定程度的提高，但其預(yù)后仍不盡如人意。防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的輔助治療越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于白花蛇舌草、夏枯草、女貞子和烏梅等天然植物中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3,10]顯示熊果酸在轉(zhuǎn)基因腫瘤動(dòng)物模型和裸鼠移植瘤模型中的抑瘤作用顯著，具有良好的臨床應(yīng)用前景。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，熊果酸通過(guò)激活A(yù)MPK誘導(dǎo)肝癌和膀胱癌細(xì)胞凋亡。AMPK是細(xì)胞能量代謝的主要調(diào)節(jié)器[13]，激活A(yù)MPK可誘導(dǎo)胃癌和胰腺癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-15]。白藜蘆醇(resveratrol)的抗腫瘤作用與AMPK活化有關(guān)[16]，另一種植物提取物小檗堿(berberine)通過(guò)激活A(yù)MPK減少COX-2表達(dá)而抑制黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[17]。

本研究結(jié)果顯示，熊果酸促進(jìn)胃癌細(xì)胞AMPK磷酸化，并抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(dá)。敲除AMPK基因和過(guò)表達(dá)STAT3基因均可逆轉(zhuǎn)熊果酸誘導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)下調(diào)，降低熊果酸對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。Yamaoka等[18]證實(shí)在大鼠、小鼠以及人類COX-2基因啟動(dòng)子內(nèi)含有一種GAS序列，該序列為STAT結(jié)合區(qū)域，提示STAT3可能參與COX-2的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程。本研究結(jié)果證實(shí)，過(guò)表達(dá)AMPK和敲除STAT3基因可進(jìn)一步促進(jìn)熊果酸誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)下調(diào)，從而增強(qiáng)熊果酸對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。熊果酸通過(guò)抑制TNF、佛波酯等引起的NF-κB激活作用，抑制NF-κB依賴性COX-2、MMP-9以及cyclin D1表達(dá)，從而產(chǎn)生抗腫瘤的作用[19]。文獻(xiàn)報(bào)道JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號(hào)途徑能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)[20-21]，而熊果酸能阻斷STAT3通路而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖[22]。STAT3在各種人胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中均具有較高的活性，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[23]。綜上所述，本研究推測(cè)熊果酸通過(guò)AMPK/STAT3通路下調(diào)COX-2表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖。當(dāng)然，由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，熊果酸抑制胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)尚不排除存在其他通路的作用，且不同通路之間可能存在關(guān)聯(lián)(如cross-talk等)，全面了解其機(jī)制還需行大量而深入的研究。

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22 Pathak AK, Bhutani M, Nair AS, et al. Ursolic acid inhibits STAT3 activation pathway leading to suppression of proliferation and chemosensitization of human multiple myeloma cells[J]. Mol Cancer Res, 2007, 5 (9): 943-955.

23 Huang W, Yu LF, Zhong J, et al. Stat3 is involved in angiotensin Ⅱ-induced expression of MMP2 in gastric cancer cells[J]. Dig Dis Sci, 2009, 54 (10): 2056-2062.

(2016-11-07收稿；2016-12-25修回)

Ursolic Acid Inhibits Gastric Cancer Cells Proliferation through AMPK/STAT3/COX-2 Signaling Pathway

JIAOZheng1,ZHUGuoqin1,ZHOUYichan1,XUXian2,LIXiaolin1,LIJianping3,HEXiaopu1,XUWei1,SHAOYun1,SUNWeihao1.

1DepartmentofGeriatricGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210029);2DepartmentofGastroenterology,NanjingFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing;3DepartmentofOncology,YanchengCityNo.1People’sHospital,Yancheng,JiangsuProvince

SUN Weihao, Email: swh@njmu.edu.cn

Ursolic Acid; Stomach Neoplasms; AMP-Activated Protein Kinases; STAT3 Transcription Factor; Cyclooxygenase 2; Cell Proliferation

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.004

國(guó)家自然科學(xué)面上項(xiàng)目(No.81372659)

#本文通信作者，Email: swh@njmu.edu.cn

Background: Previous study has found that ursolic acid (UA) inhibited the proliferation of gastric cancer cells by the down-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) expression. However, its molecular mechanism is not fully clear. Aims: To investigate the role of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)/COX-2 signaling pathway in UA-mediated inhibition of gastric cancer cells proliferation. Methods: AMPK-pLVX, AMPK-shRNA, STAT3-pLVX, STAT3-shRNA plasmids were constructed, and then were transfected into human gastric cancer cell lines SGC-7901 and MKN-45, respectively. Gastric cancer cells were cultured with different concentrations of UA for different times. The expressions of phosphorylated AMPK (p-AMPK), phosphorylated STAT3 (p-STAT3) and COX-2 were measured by Western blotting, and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Results: UA dose- and time-dependently increased p-AMPK expression, inhibited p-STAT3 and COX-2 expressions in SGC-7901 and MKN-45 cells. Knockdown of AMPK blocked UA-induced inhibition of STAT3 phosphorylation and COX-2 expression. Overexpression of STAT3 blocked UA-induced down-regulation of COX-2 expression. Knockdown of AMPK and overexpression of STAT3 blocked UA-induced inhibition of proliferation of gastric cancer cells. Conclusions: UA may inhibit the proliferation of gastric cancer cells via down-regulation of COX-2 expression through AMPK/STAT3 pathway.