炎癥性腸病血清學(xué)抗體的臨床意義

朱蘭香 陳彥君 嚴(yán) 蘇 金月紅

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215006)

炎癥性腸病血清學(xué)抗體的臨床意義

朱蘭香*陳彥君#嚴(yán) 蘇 金月紅

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215006)

背景：對于炎癥性腸病(IBD)，迄今尚無疾病診斷和監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn)。鑒于免疫系統(tǒng)在IBD發(fā)病中的重要作用，檢測血清免疫特異性抗體水平對于IBD的診斷和鑒別診斷可能有一定價(jià)值。目的：探討血清抗釀酒酵母抗體(ASCA)和核周型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(pANCA)在IBD中的臨床意義。方法：連續(xù)納入2015年2月—2016年5月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的IBD患者91例，其中克羅恩病(CD)52例，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)39例，36例排除IBD的胃腸道疾病患者作為對照組。分別采用ELISA法和間接免疫熒光法檢測血清ASCA-IgG、IgA和pANCA。以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表對ASCA、pANCA進(jìn)行診斷試驗(yàn)評價(jià)；采用ROC曲線、Pearson χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)分析兩種血清學(xué)抗體與IBD、CD、UC以及病變部位的關(guān)系。結(jié)果：血清ASCA-IgG和IgA均與CD相關(guān)(AUC=0.626 和0.614)，而UC僅與ASCA-IgA相關(guān)(AUC=0.486)。血清pANCA與IBD(r=0.342)、CD(r=-0.262)、UC(r=0.614)均相關(guān)，對IBD和UC的診斷敏感性和特異性優(yōu)于CD(P<0.05)。CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關(guān)(P<0.05)，pANCA與病變累及結(jié)腸相關(guān)(P<0.05)；UC患者的ASCA-IgG、IgA均與病變累及回腸末端相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：血清ASCA、pANCA有助于在IBD診斷確立的基礎(chǔ)上區(qū)分CD與UC，并可能對病變部位具有提示作用。ASCA可能與病變累及回腸末端相關(guān)，而pANCA則可能與病變累及結(jié)腸相關(guān)。

炎癥性腸??； Crohn??； 結(jié)腸炎，潰瘍性； 抗釀酒酵母抗體； 核周型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體； 診斷，鑒別

近年來我國炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的發(fā)病率呈上升趨勢，關(guān)于其病因，目前普遍認(rèn)為是腸道菌群在易感宿主中觸發(fā)異常免疫反應(yīng)，引起腸道慢性炎癥。鑒于免疫系統(tǒng)在IBD發(fā)病中的重要作用，檢測血清免疫特異性抗體水平對于IBD的診斷和鑒別診斷可能有一定價(jià)值。既往研究提出抗釀酒酵母抗體(anti-Saccharomycescerevisiae antibody, ASCA)和核周型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic anti-body, pANCA)分別對克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)有一定的診斷敏感性[1]。本研究旨在進(jìn)一步探討血清IgG型、IgA型ASCA和pANCA在IBD中的臨床意義。

對象與方法

一、病例來源

連續(xù)納入2015年2月—2016年5月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科住院和門診IBD患者91例，其中CD 52例，男性38例，女性14例，平均年齡(38.32±4.51)歲；UC 39例，男性12例，女性27例，平均年齡(36.83±4.52)歲。CD和UC的診斷符合2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)IBD學(xué)組制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。同期36例排除IBD的其他胃腸道 疾病(慢性非萎縮性胃炎、慢性結(jié)腸炎等)患者作 為對照組，男性12例，女性24例，平均年齡(39.75±6.75)歲。

二、方法

1. 標(biāo)本采集：所有受檢者采集晨起空腹靜脈血2 mL，離心收集血清。

2. 血清抗體檢測：ASCA-IgG、IgA的檢測采用ELISA法，pANCA的檢測采用間接免疫熒光法，試劑盒為德國歐蒙公司產(chǎn)品。

①ASCA-IgG、IgA：于微孔板各孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)血清(Cal1 200 U/mL、Cal2 20 U/mL、Cal3 2 U/mL)、陽性對照、陰性對照和1∶101稀釋的待測血清各100 μL，室溫孵育30 min，300 μL洗滌緩沖液洗滌4次；分別于ELISA微孔內(nèi)加入100 μL HRP標(biāo)記抗人IgG或IgA抗體，室溫孵育30 min，300 μL洗滌緩沖液洗滌4次；加入100 μL底物，避光室溫孵育15 min，加入100 μL終止液。以酶標(biāo)儀(比色波長450 nm，參考波長620 nm)測定吸光度(A)值，以Cal2的A值為界值對結(jié)果進(jìn)行定性分析。ASCA-IgG和(或)IgA陽性判定為ASCA陽性。

②pANCA：取11.1 μL待測血清樣本，加入PBS 100 μL，旋渦混合器振蕩25 s；取25 μL稀釋血清加于反應(yīng)板上，覆上包被抗原基質(zhì)的基質(zhì)片，室溫孵育 30 min；基質(zhì)片以PBS沖洗1 s后浸泡5 min；于清潔加樣板的反應(yīng)區(qū)滴加20 μL羊抗人IgG熒光抗體，從PBS中取出基質(zhì)片，5 s內(nèi)以吸水紙擦拭，將覆有基質(zhì)的一面朝下蓋在加樣板凹槽內(nèi)，避光孵育30 min；取出基質(zhì)片，沖洗、浸泡；于蓋玻片上滴加甘油/PBS 10 μL，從PBS中取出基質(zhì)片、擦拭，將覆有基質(zhì)的一面朝下蓋在蓋玻片上，熒光顯微鏡下定性觀察，滴度>1∶10 判定為陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表進(jìn)行診斷試驗(yàn)評價(jià)，分別計(jì)算ASCA、pANCA在IBD、CD、UC中的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)和陰性預(yù)測值(NPV)并作χ2檢驗(yàn)。ASCA、pANCA與IBD、CD、UC關(guān)系的分析：計(jì)數(shù)資料ASCA繪制ROC曲線，分析曲線下面積(AUC)；計(jì)量資料pANCA行Pearson χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)。ASCA、pANCA與病變部位關(guān)系的分析采用Pearson χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ASCA、pANCA診斷試驗(yàn)評價(jià)

IBD、CD、UC患者血清ASCA-IgG、ASCA-IgA、pANCA檢測陽性例數(shù)見表1。四格表分析顯示，ASCA在IBD、CD、UC中的敏感性均在40%左右，特異 性分別為88.89%、74.67%和71.59%，提示ASCA對排除非IBD患者有一定意義；而pANCA在UC中的敏感性和特異性相對較高，分別為61.54%和94.32%，提示其為輔助診斷UC的特異性指標(biāo)(表2)。

表1 IBD、CD、UC患者血清ASCA、pANCA檢測陽性例數(shù)(n)

表2 血清ASCA、pANCA診斷試驗(yàn)評價(jià)

二、ASCA、pANCA對IBD、CD、UC的診斷意義

血清ASCA-IgG、ASCA-IgA分別診斷IBD、CD、UC的ROC曲線見圖1。分析顯示，IBD與ASCA-IgG相關(guān)(AUC=0.365,P=0.018)，UC與ASCA-IgA相關(guān)(AUC=0.486,P=0.002)，CD與ASCA-IgG(AUC=0.626,P=0.016)和ASCA-IgA(AUC=0.614,P=0.030)均相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)提示IBD分型與ASCA分型可能相關(guān)。

Pearson χ2檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)顯示，血清pANCA與IBD(r=0.342,P=0.000 082)、CD(r=-0.262,P=0.003)、UC(r=0.614,P=0.000 1)均有一定相關(guān)性，其對IBD和UC的診斷敏感性和特異性優(yōu)于CD(χ2=27.672,P=9.797×10-7)。

三、ASCA、pANCA對IBD病變部位的提示作用

結(jié)合蒙特利爾分型[2]對本組CD和UC患者的病變部位進(jìn)行分類：CD分為較多累及回腸末端型(L1/L4)和較多累及結(jié)腸型(L2/L3)，L1/L4和L2/L3型分別為23例和29例；UC分為僅累及遠(yuǎn)端結(jié)腸型(E1/E2)和較多累及結(jié)腸和回腸末端型(E3)，E1/E2和E3型分別為24例和15例。

19例血清ASCA-IgG陽性CD患者中12例為累及回腸末端型(L1/L4)，Pearson χ2檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)顯示，CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關(guān)(χ2=4.348,P=0.036)。5例血清pANCA陽性CD患者均為累及結(jié)腸型(L2/L3)，Pearson χ2檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)顯示，CD患者的pANCA與病變累及結(jié)腸相關(guān)(χ2=4.387,P=0.046)(表3)。

12例血清ASCA-IgG陽性UC患者中9例為累及回腸末端型(E3)，6例血清ASCA-IgA陽性UC患者 均為累及回腸末端型(E3)，Pearson χ2檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)顯示，UC患者的ASCA與病變累及回腸末端相關(guān)(ASCA-IgG: χ2=9.777,P=0.003; ASCA-IgA: χ2=11.345,P=0.002)(表3)。

討 論

對于IBD，迄今尚無疾病診斷和監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床實(shí)踐中，CD與UC的鑒別有一定難度，特別是在患者的臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡和病理特征不典型或有疑惑時(shí)，而一些血清生物學(xué)標(biāo)記物如免疫特異性抗體可能有助于部分解決這一問題[3]。

ASCA是針對釀酒酵母菌細(xì)胞壁磷肽甘露聚糖的抗體，在部分CD患者的血清中特異性升高[4]，腸內(nèi)細(xì)菌的胞壁成分與釀酒酵母菌胞壁甘露聚糖成分同源。ASCA有IgG和IgA兩種免疫球蛋白亞型。

圖1 血清ASCA診斷IBD、CD、UC的ROC曲線

表3 血清ASCA、pANCA對IBD病變部位的提示作用

抗體CD(n)L1/L4L2/L3Pearsonχ2Fisher單側(cè)P值UC(n)E1/E2E3Pearsonχ2Fisher單側(cè)P值A(chǔ)SCA?IgG1274．3480．036399．7770．003ASCA?IgA632．2210．1310611．3450．002pANCA054．3870．04612123．5100．061

本研究以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，對血清ASCA進(jìn)行診斷試驗(yàn)評價(jià)，結(jié)果顯示其在IBD、CD、UC中的敏感性均較低(約40%)，特異性為71.59%～88.89%。ROC曲線分析顯示ASCA與IBD、CD、UC均相關(guān)，具體表現(xiàn)為ASCA-IgG與IBD相關(guān)，ASCA-IgA與UC相關(guān)，兩類抗體均與CD相關(guān)，提示IBD分型與ASCA分型可能相關(guān)。國內(nèi)樣本量較大的病例對照研究均顯示ASCA對CD的敏感性較低，與本研究結(jié)果一致[5-7]。有研究顯示CD患者的父母以及一級親屬血清ASCA水平升高，可能與CD相關(guān)NOD2基因突變有關(guān)[8]，表明ASCA是有罹患CD傾向者免疫系統(tǒng)過度應(yīng)答的血清學(xué)表現(xiàn)形式。

50%～80%的UC患者外周血中可檢出ANCA，UC相關(guān)ANCA在乙醇固定的中性粒細(xì)胞中呈核周染色形式，即pANCA[9]。pANCA系由腸黏膜B細(xì)胞所產(chǎn)生，以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞質(zhì)成分為抗原，可作用于毛細(xì)血管中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞，引起溶菌酶釋放，導(dǎo)致大面積血管和腸組織損害[10-12]。本研究中血清pANCA對UC的敏感性和特異性分別為61.54%和94.32%，敏感性與國內(nèi)同類研究接近(54.7%～56.7%[5-7])。國外研究中pANCA在UC中的陽性率/敏感性亦均在55%～60%[12-14]，但也有超過65%者[15]。本研究結(jié)果顯示pANCA在CD中的診斷價(jià)值顯著低于UC和IBD，其與UC相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.614)，其次為IBD(r=0.342)，與CD相關(guān)性最弱(r=-0.262)，提示pANCA可在IBD診斷確立后UC與CD的鑒別中發(fā)揮作用，為UC特異性血清學(xué)標(biāo)記物。

本研究相關(guān)性分析還顯示，CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關(guān)，pANCA與病變累及結(jié)腸相關(guān)，而UC患者的ASCA-IgG、IgA均與病變累及回腸末端相關(guān)。既往研究亦表明累及回腸末端型CD(L1/L4)血清ASCA多為陽性，UC反向累及回腸(E3)時(shí)，ASCA亦可呈陽性，而累及結(jié)腸的CD(L2/L3)ASCA陽性率較低[3，8]。上述相關(guān)性可能與腸道局部免疫、食物抗原以及腸道菌群的變化有關(guān)。

IBD遺傳易感個(gè)體的機(jī)體免疫機(jī)制缺乏規(guī)律性，先天免疫敏感性以及腸道共生細(xì)菌的再激活可能激活一系列炎癥反應(yīng)通路，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放，炎癥細(xì)胞激活，血液中的淋巴細(xì)胞、炎癥性白細(xì)胞和單核細(xì)胞募集至腸道。回腸腸壁較薄，管徑較小，腸系膜內(nèi)血管弓多、直血管短，有大量孤立和集合淋巴濾泡，且多見于回腸下段，是腸道局部免疫應(yīng)答的重要場所。而結(jié)腸內(nèi)除與動(dòng)靜脈伴行的淋巴系統(tǒng)外，并無此種特殊的淋巴濾泡，免疫應(yīng)答潛能較回腸弱。因此，累及回腸的病變可能釋放更多炎癥因子，共生細(xì)菌再激活程度加劇，細(xì)菌胞壁中與ASCA針對的釀酒酵母菌胞壁甘露聚糖同源的成分相應(yīng)增多。ASCA可能是對菌體本身的抗原反應(yīng)所致，也可能是由目前尚未被鑒定的交叉抗原所引起[16]。而ANCA是一組以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞質(zhì)成分為抗原的自身抗體，根據(jù)免疫熒光檢測時(shí)的分布可分為胞質(zhì)型(cANCA)、斑點(diǎn)型(sANCA)和核周型(pANCA)。目前觀點(diǎn)認(rèn)為ANCA只是免疫調(diào)節(jié)紊亂的標(biāo)志，可能與感染相關(guān)[10-12]。與回腸相比，結(jié)腸更易暴露于外界病原體，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，故結(jié)腸病變pANCA表達(dá)增多。

腸道部位不同，抗原種類不同，相應(yīng)抗體亦存在差異。小腸內(nèi)以食物抗原為主，激活腸黏膜異常免疫應(yīng)答，淋巴細(xì)胞聚集，ASCA表達(dá)增加。胃腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量從胃至結(jié)腸呈遞增趨勢，結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高水平[17]，因此結(jié)腸內(nèi)以細(xì)菌抗原為主。pANCA能識(shí)別結(jié)腸細(xì)菌表位和肥大細(xì)胞胞質(zhì)抗原，對共生微生物產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答[10-12]，因此在結(jié)腸炎癥時(shí)表達(dá)增加。此外，不同腸道部位菌群構(gòu)成的差異亦可能影響ASCA、pANCA表達(dá)水平。小腸菌群的構(gòu)成介于胃與結(jié)腸之間，近端與胃相近，能分離出大腸桿菌和厭氧菌；遠(yuǎn)端則與結(jié)腸相近，大腸桿菌恒定存在，厭氧菌如類桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬亦有相當(dāng)數(shù)量。不同菌群種類所含抗原成分的差異導(dǎo)致相應(yīng)抗體表達(dá)水平的差異。確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IBD分型與ASCA分型可能相關(guān)，而pANCA在UC中的診斷價(jià)值高于CD，因此這兩個(gè)血清學(xué)抗體有助于在IBD診斷確立的基礎(chǔ)上區(qū)分CD與UC。更為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)血清ASCA、pANCA可能對IBD病變部位具有提示作用。血清ASCA-IgG與CD病變累及回腸末端相關(guān)，UC反向累及回腸時(shí)，ASCA-IgG、IgA亦可呈陽性，提示ASCA可能與IBD病變累及回腸末端相關(guān)，而血清pANCA則可能與病變累及結(jié)腸相關(guān)。上述相關(guān)性有待進(jìn)一步研究證實(shí)，目前僅依靠血清學(xué)抗體檢測仍難以鑒別結(jié)腸型CD(L2/L3)與累及回腸末端的UC(E3)。

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(2016-10-06收稿；2016-12-17修回)

Clinical Significance of Serum Antibodies in Inflammatory Bowel Disease

ZHULanxiang,CHENYanjun,YANSu,JINYuehong.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

CHEN Yanjun, Email: 614695437@qq.com

Inflammatory Bowel Disease; Crohn Disease; Colitis, Ulcerative; Anti-SaccharomycescerevisiaeAntibody; Perinuclear Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody; Diagnosis, Differential

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.009

*Email: zhulanxiang0125@163.com

#本文通信作者，Email: 614695437@qq.com

Background: There is no gold standard for the diagnosis and monitoring of inflammatory bowel disease (IBD). As immune system plays crucial role in the pathogenesis of IBD, some immune-specific serum antibodies are considered to be useful tools for the diagnosis and differential diagnosis of the disease. Aims: To investigate the clinical significance of serum antibodies, including anti-Saccharomycescerevisiaeantibody (ASCA) and perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody (pANCA) in IBD. Methods: Serum samples were obtained from 91 consecutive IBD patients from Feb. 2015 to May 2016 at the First Affiliated Hospital of Soochow University. Of them, 52 were Crohn’s disease (CD) and 39 were ulcerative colitis (UC). Serum samples of 36 non-IBD patients were served as controls. ASCA-IgG and ASCA-IgA were detected by ELISA, and pANCA by indirect immunofluorescence assay. Using clinical diagnosis as gold standard, crosstabs statistics was performed to measure the diagnostic accuracy of ASCA and pANCA, and ROC curve, Pearson Chi-square test and Fisher’s exact test were employed for analyzing the correlations of these two serum antibodies with IBD, CD, UC, and the location of the disease. Results: Both serum ASCA-IgG and IgA were correlated with CD (AUC=0.626 and 0.614), while UC was correlated with ASCA-IgA only (AUC=0.486). Serum pANCA had relevance to IBD (r=0.342), CD (r=-0.262) and UC (r=0.614); its sensitivity and specificity for IBD and UC were superior to those for CD (P<0.05). In CD patients, ASCA-IgG was associated with terminal ileal disease (P<0.05), and pANCA was associated with colonic involvement (P<0.05). In UC patients, both ASCA-IgG and IgA were correlated with terminal ileal disease (P<0.05). Conclusions: Serum ASCA and pANCA may be helpful for discrimination between CD and UC when the diagnosis of IBD is established. Furthermore, they are closely associated with the disease location, ASCA is related with the terminal ileal disease and pANCA is related with colonic involvement.