杜仲不同部位總黃酮含量及抗氧化活性研究

鐘淑娟，楊 欣，李 靜，李詠梅，黎行山（.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 50700；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006）

杜仲不同部位總黃酮含量及抗氧化活性研究

鐘淑娟1＊，楊 欣1，李 靜2，李詠梅1，黎行山1（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510700；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

目的：比較杜仲皮、葉、雄花及籽中總黃酮含量與抗氧化活性。方法：采用紫外分光光度法測定各部位總黃酮含量；以半數(shù)清除/還原濃度（IC50）值為評價(jià)指標(biāo)，對各部位樣品進(jìn)行清除2，2′-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS+）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基試驗(yàn)以及對銅離子（Cu2+）的還原能力試驗(yàn)，并以維生素C為陽性對照。結(jié)果：杜仲不同部位總黃酮含量由高到低為葉＞雄花＞皮＞籽，其中除杜仲皮與籽總黃酮含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），其余各部位間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各樣品對ATBS+、DPPH自由基清除作用由強(qiáng)到弱為葉＞雄花＞籽＞皮，其中除杜仲葉與雄花比較各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），其余各部位間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各樣品對Cu2+還原能力由強(qiáng)到弱為葉＞雄花＞皮＞籽，其中葉、雄花與皮、籽比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：杜仲葉與雄花部位總黃酮含量較高、抗氧化活性較強(qiáng)，可進(jìn)行相應(yīng)的開發(fā)利用以彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥用部位杜仲皮資源的不足。

杜仲；皮；葉；雄花；籽；總黃酮；抗氧化活性

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是杜仲科杜仲屬植物，又名絲連皮、膠木、思仙、思杜等，是我國特有貴重中藥材，亦為我國二級珍稀瀕危保護(hù)品種。杜仲具補(bǔ)中益氣、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志、安胎之功效，在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均被列為藥之上品[1-2]。杜仲中含有黃酮類、木脂素類、苯丙素類、萜類、環(huán)烯醚萜類、多糖類等成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗炎、保肝、抗腫瘤等藥理作用[3-4]。但隨著杜仲的消耗量逐漸增加，且其傳統(tǒng)藥用部位為皮部，導(dǎo)致杜仲資源日益枯竭，故研究者開始發(fā)掘杜仲其他部位的利用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理研究表明，杜仲雄花、籽、皮、葉有相似的化學(xué)成分，提示其具有相似的藥理活性。目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道多單獨(dú)研究杜仲某部位的總黃酮含量或抗氧化活性[5-6]，而未綜合比較杜仲不同部位的總黃酮含量及其抗氧化活性，故本文對杜仲不同部位總黃酮含量及抗氧化活性進(jìn)行比較研究，為合理開發(fā)杜仲相關(guān)制劑及產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

8453E型紫外-可見分光光度計(jì)（美國安捷倫科技有限公司）；XT220A型分析天平（瑞士Precisa公司，d＝0.000 1 g）；BP211D型分析天平（德國Sartorius公司，d＝0.00 001 g）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：500W）；DFY-200型粉碎機(jī)（浙江溫嶺大德中藥機(jī)械有限公司）；M illi-Q型超純水儀[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]。

1.2 藥材、藥品與試劑

各批杜仲皮、杜仲葉、杜仲雄花和杜仲籽樣品產(chǎn)自陜西漢中、湖北宜昌和山西長治等地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林吉教授鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲的皮、葉、雄花和籽；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707，純度：92.5%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：QQQDM-KN，純度：97%]；2，2′-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS+）二銨鹽（ABTS二銨鹽，批號：20150315，純度：98%）、新亞銅試劑（批號：20141206，純度：98%）均來源于美國阿拉丁公司；維生素C（VC，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號：20151208，純度：＞99.7%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙酸銨、乙酸、無水乙醇等試驗(yàn)所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

藥材樣品來源信息見表1。

表1 杜仲不同部位樣品來源信息Tab 1 Source inform ation of different parts of the E. ulmoides sam ples

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對杜仲不同部位總黃酮含量及其抗氧化試驗(yàn)中的半數(shù)清除/還原濃度（IC50）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，用方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 總黃酮含量測定

按文獻(xiàn)[7-8]方法測定。

2.2.1 供試品溶液的制備 取杜仲皮、葉、雄花、籽粉末（過24目篩）各1 g，精密稱定，置于50m L具塞錐形瓶中，加入80%乙醇20m L，超聲提取30min，濾過；濾渣再加80%乙醇20m L，超聲提取20min，濾過；合并2次濾液，定容至50m L，即得。

2.2.2 蘆丁對照品溶液的制備 取蘆丁對照品50mg，精密稱定，置于25m L量瓶中；加甲醇適量，置于水浴上微熱使溶解；放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品母液。精密量取母液10m L，置于100m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1m L中含蘆丁0.2mg）。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6m L，分別置于25m L量瓶中，各加水至6.0m L，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法：先加入5%亞硝酸鈉溶液1m L，混勻，放置6min；后加入10%硝酸鋁溶液1m L，搖勻，放置6m in；然后加入4%氫氧化鈉溶液10m L，最后加水至刻度，搖勻，放置15min。以相應(yīng)的試劑為空白，同法顯色。在500 nm波長處測定吸光度（A），計(jì)算蘆丁質(zhì)量濃度（X，mg/m L）。以A為縱坐標(biāo)、X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝12.18X+0.085（r＝0.999 5），即蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.008 9～0.053 5 mg/m L。

2.2.4 方法學(xué)考察 按相關(guān)方法進(jìn)行方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度考察。結(jié)果，精密度考察中6次連續(xù)測定吸光度的RSD為0.56%（n＝6），表明儀器精密度良好；重復(fù)性考察中杜仲皮、葉、雄花和籽樣品中蘆丁吸光度的RSD分別為0.45%、0.5%、0.64%、0.78%（n＝6），表明試驗(yàn)重復(fù)性良好；穩(wěn)定性考察中杜仲皮、葉、雄花和籽樣品中蘆丁含量的RSD分別為0.85%、1.10%、0.94%、1.78%（n＝6），表明供試品顯色結(jié)果在30m in內(nèi)穩(wěn)定；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中杜仲皮、葉、雄花、籽樣品中蘆丁平均回收率為95.0%～101.0%（RSD均不超過1.50%，n＝6）。方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、簡便，可用于杜仲不同部位總黃酮的含量測定。

2.2.5 各部位樣品中總黃酮含量測定 取杜仲皮、葉、雄花和籽樣品各5份，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各供試品溶液分別吸取5.0、0.5、3.0、3.0m L置于25 m L量瓶中，照“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后測定A，計(jì)算杜仲不同部位總黃酮含量：總黃酮含量（%）＝（提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù)）/供試品質(zhì)量×100%，結(jié)果見表2。

表2 杜仲不同部位總黃酮含量比較（±s，n＝5）Tab 2 Com parison of total flavonoids content in differentpartsof E.ulmoides（±s，n＝5）

表2 杜仲不同部位總黃酮含量比較（±s，n＝5）Tab 2 Com parison of total flavonoids content in differentpartsof E.ulmoides（±s，n＝5）

注：同一指標(biāo)不同組別間，若字母相同，則代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；若字母不同，則代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）Note：if there are same letters in the same index among different groups，it indicates the difference is not statistically significant（P＞0.05）；if the lettersare different，then it indicates the difference is statistically significant（P＜0.05）

部位皮編號S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12總黃酮含量，% 1.42±0.01 1.44±0.02 1.48±0.01 8.20±0.09 8.96±0.03 9.91±0.04 2.88±0.02 3.21±0.04 3.09±0.01 1.27±0.01 1.30±0.01 1.10±0.01各部位總黃酮平均含量，% 1.45±0.03a葉9.02±0.85b雄花3.06±0.17c籽1.22±0.11a

由表2可見，杜仲皮、葉、雄花、籽總黃酮平均含量分別為1.33%、9.02%、3.02%、1.22%，排序?yàn)槿~＞雄花＞皮＞籽。杜仲皮與籽之間比較，P＝0.575＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；杜仲皮分別與葉、雄花比較，籽分別與葉、雄花比較，葉與雄花比較，P均小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 杜仲不同部位抗氧化活性測定

2.3.1 供試品溶液的制備 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備各樣品液，用80%乙醇將各部位樣品液分別制成質(zhì)量濃度為0.5、2.0、4.0、6.0、8.0mg/m L（以生藥量計(jì)）的供試品溶液，備用。

2.3.2 各部位樣品對ABTS+自由基的清除作用 分別取“2.3.1”項(xiàng)下各部位系列質(zhì)量濃度供試品溶液0.6m L置于具塞試管中，分別加入含ABTS+自由基的溶液[分別取ABTS二銨鹽（8.1mmol/L）、過硫酸鉀（3.2mmol/L）各5m L，混合后暗處放置12 h以上，使用時(shí)用80%乙醇稀釋至其在734 nm波長處A為0.83左右]3.0m L，室溫下放置6min。以80%乙醇為空白溶液，于734 nm波長處測定各樣品A；以VC（0.02mg/m L）為陽性對照，其測定方法與各部位樣品相同。每組平行測定3次，取平均值，計(jì)算自由基清除率[（1－A1/A01）×100%，A01為ABTS+自由基的A值，A1為樣品對ABTS+自由基作用后的A值]并計(jì)算IC50值，結(jié)果見表3。

表3 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Resultsof antioxidantactivity test（±s，n＝3）

表3 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Resultsof antioxidantactivity test（±s，n＝3）

注：同一指標(biāo)不同組別間，若字母相同，則代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；若字母不同，則代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）Note：if there are same letters in the same index among different groups，it indicates the difference is not statistically significant（P＞0.05）；if the lettersare different，then it indicates the difference is statistically significant（P＜0.05）

部位皮清除ABTS+自由基 清除DPPH自由基IC50，mg/mL 0.97±0.08 0.98±0.06 0.98±0.03 0.54±0.01 0.55±0.01 0.53±0.01 0.56±0.01 0.56±0.01 0.55±0.02 0.85±0.02 0.86±0.03 0.86±0.02 IC50，mg/mL 5.48±0.02 5.56±0.01 5.42±0.03 0.35±0.01 0.42±0.01 0.37±0.01 0.54±0.01 0.55±0.01 0.59±0.02 3.54±0.02 3.85±0.03 3.82±0.02 Cu2+還原能力IC50，mg/mL 6.59±0.26 6.64±0.35 6.79±0.15 0.98±0.42 1.06±0.38 1.08±0.40 1.21±0.35 1.15±0.29 0.11±0.32 7.21±0.27 7.56±0.23 8.26±0.25平均IC50，mg/mL 0.98±0.00a平均IC50，mg/mL 5.49±1.05a0.54±0.01b平均IC50，mg/mL 6.67±0.10a葉0.38±0.01b1.04±0.05b雄花0.56±0.01b0.56±0.03b1.16±0.05b籽0.06±0.29c編號S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 VC 0.86±0.01c3.74±0.41c7.68±0.53a0.12±0.00d0.08±0.02d

由表3可見，杜仲不同部位對ABTS+自由基的清除作用大小排序?yàn)槿~＞雄花＞籽＞皮。杜仲葉與雄花的IC50值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余兩兩比較，IC50值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.3 各部位樣品對DPPH自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)[9]方法試驗(yàn)，分別取“2.3.1”項(xiàng)下各部位系列質(zhì)量濃度供試品溶液3.0m L置于具塞試管中，加入DPPH溶液（精密稱取DPPH 16.0 mg，加入80%乙醇定容至200 m L，超聲10m in后于暗處放置2 h使其完全溶解，即得0.2mmol/L的DPPH自由基溶液。紫外分光光度計(jì)測定其A值在1.1～1.2之間，5 h內(nèi)穩(wěn)定）2.0m L，振蕩混合均勻，常溫下密封后避光靜置30m in，于517 nm波長處測定A。以VC（0.08mg/m L）為陽性對照，其測定方法與各部位樣品相同。每組平行測定3次，取平均值，計(jì)算自由基清除率[（1－A2/A02）×100%，A02為空白溶液的A值，A2為樣品溶液的A值]并計(jì)算IC50值，結(jié)果見表3。

由表3可見，杜仲不同部位DPPH自由基清除作用大小排序?yàn)槿~＞雄花＞籽＞皮。杜仲葉與雄花比較，IC50值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余兩兩比較，IC50值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；清除DPPH與ABTS+自由基作用結(jié)果一致。

2.3.4 各部位樣品對Cu2+的還原能力 參考文獻(xiàn)[10]方法試驗(yàn)，分別取“2.3.1”項(xiàng)下各部位系列質(zhì)量濃度供試品溶液0.5 m L置于具塞試管中，依次加入硫酸銅溶液（0.01 mol/L）0.25 m L、新亞銅試液（7.5 mol/L）0.25 m L與乙酸銨-乙酸緩沖液（0.12mol/L，pH＝7.5）3.0m L，振蕩混合均勻，室溫下靜置30min。以乙酸銨-乙酸緩沖液為空白，于450 nm波長處測定各供試品溶液的A。以VC（0.02mg/m L）為陽性對照，其測定方法與各部位樣品相同。每組平行測定3次，取平均值，計(jì)算Cu2+還原百分率[（A3－A03）/（Amax－A03）×100%，A3為樣品溶液的A值，A03為空白對照溶液的A值，Amax為本試驗(yàn)中A最高值]并計(jì)算IC50值，結(jié)果見表3。

由表3可見，杜仲不同部位Cu2+還原能力葉大小排序?yàn)椋拘刍ǎ酒ぃ咀选６胖偃~與雄花、杜仲皮與籽比較，IC50值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余兩兩比較，IC50值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，杜仲不同部位中以葉的總黃酮含量最高，雄花次之，而皮和籽中的總黃酮含量較低。在杜仲不同部位的體外抗氧化活性試驗(yàn)中，杜仲葉與雄花的抗氧化活性最強(qiáng)，且二者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；杜仲籽次之，而杜仲皮最弱。杜仲葉與雄花的總黃酮含量較高，且其抗氧化活性亦較強(qiáng)，但二者并非呈正相關(guān)趨勢，可見二者抗氧化活性的機(jī)制較復(fù)雜，故其抗氧活性作用的成分及其相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。杜仲皮的總黃酮含量較杜仲籽高，然而杜仲皮的抗氧化活性較杜仲籽弱，可能是因?yàn)槎胖俨煌课恢芯哂锌寡趸钚缘奈镔|(zhì)不完全相同所致。而杜仲籽中α-亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸的含量較高，具有一定的還原能力，故杜仲籽的抗氧化活性較杜仲皮強(qiáng)。

作為傳統(tǒng)藥材使用的杜仲皮中總黃酮含量及體外抗氧化活性都較弱，而杜仲葉的總黃酮含量及體外抗氧化活性遠(yuǎn)高于杜仲皮，且杜仲葉的生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高，可長期采收，資源較充足；杜仲雄花中總黃酮含量及體外抗氧化活性亦高于杜仲皮，且杜仲是雌雄異株，此部位藥材便于收集，可為醫(yī)療使用提供穩(wěn)定且質(zhì)量合格的藥材來源。因此，在開發(fā)杜仲相關(guān)抗氧化活性功能產(chǎn)品時(shí)，可首選杜仲葉和雄花。

[1] 姚麗娜，蘇艷芳.杜仲化學(xué)成分研究[D].天津：天津大學(xué)，2010.

[2] 丁艷霞，郭洋靜，任瑩璐，等.杜仲雄花中黃酮類化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].中草藥，2014，40（3）：323-327.

[3] 范彥博，周妍，劉大鵬，等.杜仲主要化學(xué)成分分類總結(jié)[J].中國藥師，2014，17（10）：1756-1759.

[4] Jin X，Am itaniK，Zamam iY，etal.Ameliorative effectof Eucommia ulmoides Oliv.leaves extract（ELE）on insulin resistance and abnormal perivascular innervation in fructose-drinking rats[J].J Ethnopharmacol，2010，128（3）：672-678.

[5] 楊芳，岳正剛，王欣，等.杜仲葉化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2014，39（8）：1445-1449.

[6] 邱高翔，董娟娥，馬希漢，等.杜仲雄花提取物的體外抗氧化活性評價(jià)[J].林業(yè)科學(xué)，2013，49（3）：63-69.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：355-356.

[8] 原江鋒，楊建雄，張志琪，等.產(chǎn)地和季節(jié)對柿葉中總黃酮、蘆丁和齊墩果酸含量的影響[J].中成藥，2006，28（12）：1757-1759.

[9] 曾丹，李旭，高佩，等.DPPH法評估火棘提取物抗氧化活性體系的建立[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（21）：79-83.

[10] 鄧亞運(yùn)，周綠穎，李元彬，等.沉香葉不同提取部位的體外抗氧化活性研究[J].中國藥房，2016，27（16）：2181-2184.

（編輯：劉 萍）

Study on the Total Flavonoids Content and Antioxidant Activity in Different Parts of Eucomm iae ulmoides

ZHONG Shujuan1，YANG Xin1，LI Jing2，LIYongmei1，LIXingshan1（1.Dept.of Pharmacy，F(xiàn)ifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China；2.School of TCM，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To compare the total flavonoids content and antioxidant activity in the barks，leaves，male flowers and seeds of Eucommiae ulmoides.METHODS：UV spectrophotometry was used to determ ine the total flavonoids content in different parts；tests was conducted to clear 2，2′-nitrilobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS+），1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）radicals and the reducing ability of Cu2+，using half clear/reduction concentration value（IC50）as evaluation indexes，and vitam in C was regarded as positive control.RESULTS：The total flavonoids content of the E.ulmoides from hight to low was as follows as leaves＞male flowers＞barks＞seeds，except there was no significant difference in barks and seeds（P＞0.05），the other parts had significant differences（P＜0.05）；the ability of different parts elim inating DPPH and ABTS+free radical was as follows as leaves＞male flowers＞seeds＞barks，except there was no significant difference in the indicators of leaves and male flowers（P＞0.05），the other parts had significant differences（P＜0.05）；the ability of reducing Cu2+free radical was as follows as leaves＞male flowers＞barks＞seeds，there was significant difference in leaves and males flowers w ith barks and seeds（P＜0.05）.CONCLUSIONS：The content of total flavonoids in leaves and male flowers is high，and the antioxidant activity is strong，which has a great prospect of exploitation and utilization tomake up for deficiencies in barks of E.ulmoides.

Eucommiae ulmoides；Bark；Leaf；Male flower；Seed；Total flavonoids；Antioxidant activity

R285.5

A

1001-0408（2017）13-1787-04

2016-09-29

2016-12-12）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)、醫(yī)院制劑。電話：020-82288145。E-mail：843118547@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.17