當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)提取方法及SDS-PAGE技術(shù)體系研究Δ

張延紅，高素芳，王 燕，李金田，杜 弢（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000）

當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)提取方法及SDS-PAGE技術(shù)體系研究Δ

張延紅＊，高素芳，王 燕，李金田，杜 弢#（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000）

目的：建立適用于當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)提取及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的技術(shù)體系，為當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)研究和品種純度檢測(cè)提供技術(shù)支撐。方法：以蛋白質(zhì)含量和電泳條帶數(shù)量等為指標(biāo)，采用濃縮膠法、鹽溶蛋白法、電極緩沖液法、二巰基蘇糖醇（DTT）法、尿素法、巰基乙醇法、三羥甲基氨基甲烷（Tris）法、丙酮沉淀法等8種方法提取當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)，篩選最優(yōu)提取方法；再以最優(yōu)提取方法為基礎(chǔ)，考察不同料液比、樣品稀釋倍數(shù)（上樣量）和分離膠濃度對(duì)當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)提取及SDS-PAGE效果的影響。結(jié)果：8種提取方法中以巰基乙醇法提取蛋白質(zhì)的含量較高（29.931mg/g），且電泳條帶數(shù)目多、泳道背景清晰；當(dāng)以巰基乙醇法為最優(yōu)提取方法時(shí)，料液比為1∶10、上樣量為5倍、分離膠濃度為15%條件下電泳效果最好，共得到18條條帶。結(jié)論：建立的蛋白質(zhì)提取方法和SDS-PAGE技術(shù)體系適用于當(dāng)歸種子純度的檢測(cè)。

當(dāng)歸；種子；蛋白質(zhì)提取；SDS-PAGE

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，能反映生物DNA組成上的差異，幾乎所有植物種子都具有特異性種子蛋白，其電泳譜帶具有高度的穩(wěn)定性、專一性。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)就是根據(jù)種子蛋白的這些特點(diǎn)，利用電泳譜帶的多態(tài)性來鑒定品種的真實(shí)性和純度。此外，種子蛋白作為遺傳標(biāo)記常被用于種屬間關(guān)系、品種鑒定及植物繁育系統(tǒng)的鑒別。種子檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的重要措施，采用電泳分離的蛋白圖譜檢測(cè)農(nóng)作物種子純度已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]。利用種子蛋白質(zhì)電泳圖譜鑒定種子純度具有不需將種子萌發(fā)、送檢樣品可及時(shí)進(jìn)行分析、電泳后的染色步驟相對(duì)簡單等優(yōu)點(diǎn)。此外，該技術(shù)還可用于測(cè)定蛋白質(zhì)分子量和蛋白質(zhì)濃度，是許多研究領(lǐng)域的重要分析技術(shù)。當(dāng)歸為傘形科多年生草本植物當(dāng)歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根[3-4]，是甘肅特色藥材之一。本試驗(yàn)以當(dāng)歸種子為研究材料，對(duì)其蛋白質(zhì)的提取方法及電泳條件進(jìn)行研究，旨在建立適宜于當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)提取和電泳的技術(shù)體系，為當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)研究和品種純度檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

DYY-10C型電泳儀、DYCZ-23A型垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）；BX7200HP超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TGL16M型高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 種子與試劑

當(dāng)歸種子由甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院劉效瑞老師提供，經(jīng)晉玲教授鑒定為當(dāng)歸種子；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、二巰基蘇糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、丙酮、甘油、考馬斯亮藍(lán)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、冰醋酸、甲醇、甘氨酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)提取

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[5-13]及預(yù)試驗(yàn)確定選用以下蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行篩選比較。

2.1.1 濃縮膠法 在文獻(xiàn)[5]方法上加以改進(jìn)。稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加稀釋4倍的濃縮膠緩沖液（0.5mmol/L的Tris-HCl，pH 6.7）2m L冰浴研磨，超聲震蕩30m in，離心（3 500 r/m in，離心半徑5 cm，下同）30m in，取上清液，加入等體積40%的蔗糖溶液，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 鹽溶蛋白法 稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加入1.5mol/L的氯化鈉溶液2m L，在冰浴條件下研磨，離心20m in，取上清液，4℃貯存?zhèn)溆肹5]。

2.1.3 電極緩沖液法 在文獻(xiàn)[6]方法上加以改進(jìn)。稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加入樣品提取液[40%的蔗糖10m L，電極緩沖液（3.03 g Tris，14.4 g甘氨酸，1.0 g SDS，加雙蒸水溶解定容至1 000m L，pH 8.3）2m L，加水8m L混勻]2m L在冰浴條件下研磨，離心20m in，取上清液，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 DTT法 稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加入50 mmol/L Tris-HCl（含1.5%DTT和0.6mmol/L的EDTA緩沖液，pH 8.0）樣品提取液2m L（4℃預(yù)冷備用），室溫浸泡1 h，然后研磨至糊狀后4℃下離心（10 000 r/min）20min，離心2次[5]，上清液即為蛋白質(zhì)提取液。

2.1.5 尿素法 取32.43 g尿素、120μL乙二醇溶于1 000 m L雙蒸水中得到提取液。稱取冷藏30m in后的當(dāng)歸種子0.2 g，研磨后裝入離心管中，加入提取液（料液比為1∶10），室溫下提取1 h后渦旋混合約1min，再于4℃下離心（10 000 r/min）10min，取上清液備用[7]。

2.1.6 巰基乙醇法 在文獻(xiàn)[8]方法上加以改進(jìn)。稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加入pH 8.0的50mmol/L Tris-HCl（含1%SDS、1%巰基乙醇、40%的蔗糖溶液）提取液2 m L，置沸水中加熱3min，立即置于冰上冷卻，取上清液備用。

2.1.7 Tris法 稱取樣品0.2 g，加入pH 8.0的0.15mol/L Tris-HCl提取液2m L，4℃浸泡6 h，離心（4 000 r/m in）15min，取上清液備用[8]。

2.1.8 丙酮沉淀法 稱取當(dāng)歸種子0.2 g，加入樣品提取液（pH 8.0的62.5 mmol/L Tris-HCl、0.5%SDS、10%甘油、5%巰基乙醇）2m L，渦旋混合30 s，4℃放置1 h。樣品搖勻后，在4℃下離心（12 000 r/m in）20min，上清液轉(zhuǎn)移至3 m L離心管中，加入1 m L預(yù)冷丙酮，搖勻，－20℃放置1 h沉降蛋白質(zhì)，4℃下離心（5 000 r/m in）10m in，棄上清液。沉淀在－20℃放置1 h，使丙酮充分揮發(fā)，沉淀備用[5]。

2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定與電泳

蛋白質(zhì)含量和純度是評(píng)價(jià)提取方法的重要指標(biāo)，蛋白純度不同，對(duì)電泳的影響也不同。較多的雜質(zhì)將嚴(yán)重影響電泳結(jié)果。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上述8種方法提取的蛋白質(zhì)含量[14]；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)[15]，比較各方法提取的蛋白質(zhì)電泳的條帶數(shù)目和泳道干凈程度，篩選適宜的蛋白質(zhì)提取方法。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2003作圖，SPSS 18.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較。

2.2.1 電泳技術(shù)操作步驟 （1）電泳槽的安裝：將2塊玻璃板垂直插入玻璃槽固定好，將溶化的1.5%瓊脂趁熱注入電泳槽平板玻璃底部，以防漏液。（2）聚合：取配制好的分離膠（濃度10%）混勻后小心注入電泳槽的玻璃板間，留出約3 cm左右的空間以灌注濃縮膠[濃度3%，配制方法：蒸餾水2.7m L、30%丙烯酰胺（29.2 g）/N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（0.8 g）0.67 m L、濃縮膠緩沖液0.5 m L、10%SDS 50μL、10%過硫酸銨50μL、四甲基乙二胺4μL；濃縮膠緩沖液是0.5 mmol/L Tris-HCl（pH＝6.7）。將上述試劑混勻后，倒入玻璃板間（分離膠上方），插入梳子，室溫靜置聚合2 h左右。（3）電泳：待濃縮膠完全聚合后，取出梳子，吸去多余的水，用微量注射槍向加樣孔內(nèi)點(diǎn)樣，在電泳槽中加電極緩沖液（將3.03 g Tris、14.4 g甘氨酸、1.0 g SDS溶入900m L超純水中，然后定容至1 000m L即為電極緩沖液）適量，并在上樣緩沖液中加7～8滴溴酚藍(lán)指示劑。接上電泳儀，恒壓60 V，待藍(lán)色溴酚藍(lán)移至分離膠時(shí)，轉(zhuǎn)換電壓至120V；待藍(lán)色的溴酚藍(lán)移至下端1～1.5 cm時(shí)，停止電泳。（4）染色和脫色：取出膠板后放入考馬斯亮藍(lán)G-250染色液，染色1 h。然后再用蒸餾水沖洗2遍，倒入脫色液，期間多次更換至背景清晰為止，拍照。

2.2.2 分離膠配方 配方見表1。

表1 分離膠配方（m L）Tab 1 Solution formula of separating gel（m L）

2.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定及電泳結(jié)果 當(dāng)歸種子8種提取方法的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果見表2，電泳圖見圖1。

表2 不同提取方法蛋白質(zhì)含量比較Tab 2 Com parison of protein contentsby different extractionm ethods

圖1 不同提取方法蛋白質(zhì)電泳圖Fig 1 Protein electrophoretogram by different extractionm ethods

由表2及圖1可知，丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)含量最高，與其余7種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但圖譜顯示該法電泳條帶較模糊；巰基乙醇法與DTT法提取的蛋白質(zhì)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鹽溶蛋白法提取出的蛋白質(zhì)含量較低，其電泳圖譜條帶較寬、條帶顏色淺淡；Tris法提取出的蛋白質(zhì)含量最低，圖譜也顯示其條帶較寬、顏色較淡。故當(dāng)歸種子不同提取方法的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果與蛋白質(zhì)電泳圖譜二者有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

總的來說，8種方法電泳條帶多分布于中下部，其中巰基乙醇法電泳效果最好，總條帶數(shù)10條，明帶8條、暗帶2條，泳道背景清晰。尿素法、DTT法、電極緩沖液法、鹽溶蛋白法、濃縮膠法電泳條帶的數(shù)目和亮度差異不大，均為4～5條，其中鹽溶蛋白法的條帶明顯變寬。丙酮法和Tris法電泳條帶較模糊，數(shù)目較少。因此，巰基乙醇法是當(dāng)歸種子最適宜的蛋白質(zhì)提取方法。

2.3 提取與電泳條件的優(yōu)化

在采用巰基乙醇法提取蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上對(duì)提取條件（料液比）及電泳條件（上樣量、分離膠濃度）進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.1 料液比 稱取當(dāng)歸種子0.2 g，分別加入1、2、3、4、 5m L樣品提取液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。按“2.1.6”項(xiàng)下方法提取，將提取的蛋白質(zhì)樣品用上樣緩沖液（濃縮膠緩沖液1 m L、10%SDS 1.6m L、50%甘油0.8 m L、巰基乙醇0.4m L、0.05%溴酚藍(lán)0.2 m L、雙蒸水4.0m L，混合均勻）按1∶4稀釋[9]，比較蛋白質(zhì)含量、電泳條帶數(shù)目和泳道干凈程度，篩選適宜的料液比，結(jié)果見表3、圖2A。

表3 不同料液比條件下蛋白質(zhì)含量比較Tab 3 Com parison of p rotein contents under differentmaterials-liquid ratios

圖2 不同條件下蛋白質(zhì)的電泳圖譜比較Fig 2 Com parison of protein electrophoretogram under different conditions

由表3可知，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，提取液中的蛋白含量最高，與其余料液比比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提取效果最好。由圖2A可見，不同料液比對(duì)電泳效果的影響顯著。料液比為1∶5時(shí)泳道顏色濃重，背景不干凈，條帶不清晰、拖尾嚴(yán)重，提取液的泳道顏色最深，且條帶較寬。其原因是提取液體積太少，蛋白質(zhì)提取不充分，雜質(zhì)太多，此結(jié)果與蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果相一致。當(dāng)料液比為1∶10和1∶15時(shí)，電泳效果較好，泳道干凈，條帶清晰、數(shù)目多，泳道上方有極細(xì)的暗帶分出。當(dāng)料液比為1∶20和1∶25時(shí)，泳道下部條帶顏色變淡；且料液比為1∶25時(shí)，條帶變模糊，第4、5條明帶間已無暗帶。因此，料液比優(yōu)選1∶10。

2.3.2 樣品稀釋倍數(shù)（上樣量） 在“2.3.1”項(xiàng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用巰基乙醇法提取蛋白質(zhì)，以料液比為1∶10提取種子蛋白質(zhì)。取提取后的蛋白質(zhì)樣品30μL用上樣緩沖液分別稀釋3、4、5、6、7、8、9、10、11、12倍，比較電泳條帶數(shù)目和泳道干凈程度，篩選適宜的稀釋倍數(shù)，結(jié)果見圖2B。

由圖2B可知，稀釋3倍的蛋白質(zhì)液拖尾較嚴(yán)重，可能因蛋白質(zhì)濃度太高所致。稀釋4、5、6、7倍的條帶數(shù)最多，總數(shù)11條，亮帶8條、暗帶3條，從下向上第4、5帶間可清晰看到2條暗帶。稀釋8～12倍的條帶顏色變淡變細(xì)，且有些暗帶消失。因此，樣品稀釋倍數(shù)優(yōu)選5倍。

2.3.3 分離膠濃度 在“2.3.2”項(xiàng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用巰基乙醇法提取蛋白質(zhì)，按料液比為1∶10、樣品稀釋5倍上樣。配制3%的濃縮膠及10%、12%、15%的分離膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，比較電泳條帶數(shù)目和泳道干凈程度，篩選適宜的分離膠濃度，詳見圖2C。

由圖2C可知，15%分離膠與10%、12%分離膠電泳效果比較，前者條帶數(shù)目明顯更多，且主要是在下部分離出更多清晰的亮帶和暗帶，中上部的亮帶差異不大，但有新的暗帶出現(xiàn)。因此，15%的分離膠可使蛋白質(zhì)分離更完全，電泳得到18條帶，其中11條亮帶、7條暗帶。計(jì)算其分子量[8]介于11.88～30.18KD之間。

篩選后的當(dāng)歸種子提取方法為巰基乙醇法，料液比為1∶10，電泳上樣量為稀釋5倍，分離膠濃度為15%。

3 討論

通過本次試驗(yàn)建立了適合當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)電泳的技術(shù)體系。不同提取方法對(duì)蛋白質(zhì)含量及電泳效果的影響很大，本試驗(yàn)采用8種提取方法，其中巰基乙醇法蛋白質(zhì)提取和電泳效果均最好。其原因可能是提取液中的SDS使蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵和二硫鍵斷裂，并中和蛋白質(zhì)表面電荷；同時(shí)加入的巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，其可使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解并與SDS定量結(jié)合[16-17]。由于SDS和巰基乙醇的雙重作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個(gè)肽鏈，因此，蛋白質(zhì)溶解性增加、提取量增加、電泳效果好。而丙酮沉淀法的提取液中也含有SDS和巰基乙醇，也取得了較好的提取效果，但丙酮沉淀法耗時(shí)長、方法復(fù)雜。在本試驗(yàn)中該法圖譜顯示電泳條帶較模糊，其原因是該法提取的蛋白質(zhì)呈固體狀，故上樣時(shí)將蛋白質(zhì)沉淀用上樣緩沖液稀釋了8倍，而其余方法樣品只稀釋了5倍，故丙酮沉淀法的稀釋倍數(shù)大于其他方法。

本課題組通過黨參、大黃、紅芪、苦豆子、甘草、黃芪、板藍(lán)根和柴胡9種藥材種子蛋白質(zhì)提取及SDSPAGE研究發(fā)現(xiàn)（待發(fā)表），巰基乙醇法均有很好的提取和電泳效果，適用性很廣，而且用時(shí)短，方法簡單易行，可供其他植物種子借鑒使用。

當(dāng)歸種子蛋白質(zhì)分子量較小，采用15%的分離膠較12%、10%的分離膠蛋白質(zhì)電泳圖譜分離出的條帶更多，分離效果更好。在對(duì)9種藥材的種子蛋白質(zhì)電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)，15%的分離膠可獲得更多的電泳條帶。另外，在研究過程中本課題組發(fā)現(xiàn)利用冷藏和冷凍兩種方式保存了1周的蛋白質(zhì)提取液，在電泳時(shí)冷凍法保存的蛋白質(zhì)提取液其電泳條帶分離得更清晰，且在冷凍保存1個(gè)月后仍能取得良好的電泳效果。其原因可能是溫度越低越有利于蛋白質(zhì)的保存。因此，冷凍法能夠更長時(shí)間地保存蛋白質(zhì)提取液，不會(huì)導(dǎo)致蛋白變性。

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Study on the Protein Extraction M ethod in Angelicae sinensis Seed and Its SDS-PAGE Technical System

ZHANG Yanhong，GAO Sufang，WANG Yan，LIJintian，DU Tao（School of Pharmacy，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China）

OBJECTIVE：To establish the technical system that is suitable for protein extracting in Angelicae sinensis seed and sodium dodecyl sulfate-polyacrylam ide gel electrophoresis（SDS-PAGE），and provide technical support for detecting the protein quality and variety purity.METHODS：Using protein content and number of electrophoretic bands as indexes，8 methods，including voncentrated gel method，salt-soluble protein method，electrode buffer method，dimercaptosyl alcohol（DTT）method，urea method，mercaptoethanolmethod，trimethylolaminomethane（Tris）method，and acetone precipitation method，were conducted to extract the protein in A.sinensis seed and screen the optimal extraction method.Then based on optimal extraction method，effects of differentmaterials-lipid ratios，sample dilution times（sample volume）and separate gel concentration on SDS-PAGE were investigated.RESULTS：Mercaptoethanolmethod extracted the highest protein contents（29.931 mg/g），w ith many electrophoretic bands and clear background.When mercaptoethanolmethod was used as optimal extraction method，electrophoresis effects were the best in the conditions ofmaterials-lipid ratio of 1∶10，sample volume of 5 times，separate gel concentration of 15%，which obtained 18 bands totally.CONCLUSIONS：Established protein extraction method and SDS-PAGE technical system are suitable for detecting the purity of A.sinensis seed.

Angelicae sinensis；Seed；Protein extraction；SDS-PAGE

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1751-04

2016-08-27

2016-11-08）

（編輯：劉 萍）

國家中醫(yī)藥管理局“國家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設(shè)”基金資助項(xiàng)目（No.國中醫(yī)藥辦規(guī)財(cái)發(fā)〔2013〕41號(hào)）

＊副教授，博士。研究方向：藥用植物育種和組織培養(yǎng)方面的教學(xué)和研究。E-mail：zhyh456789@163.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥用植物育種的教學(xué)和研究。E-mail：gslzdt@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.07