枳實及其主要活性成分促進脾虛模型大鼠胃腸運動的機制研究Δ

胡源祥，陳海芳，宋玉鵬，譚舒舒，羅小泉，楊武亮（江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌330004）

枳實及其主要活性成分促進脾虛模型大鼠胃腸運動的機制研究Δ

胡源祥＊，陳海芳，宋玉鵬，譚舒舒，羅小泉，楊武亮#（江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌330004）

目的：研究枳實及其主要活性成分促進脾虛模型大鼠胃腸運動的機制。方法：將170只大鼠隨機分為空白組（10只）和造模組（160只），造模組大鼠以苦寒瀉下+饑飽失常法復制脾虛模型。造模后，將大鼠隨機分為模型組，柚皮苷低、中、高劑量組（3.267、6.535、13.070mg/m L），新橙皮苷低、中、高劑量組（3.865、7.730、15.460mg/m L），辛弗林低、中、高劑量組（0.252、0.504、1.008mg/m L），3個單體成分（即柚-新-辛）低、中、高劑量配伍組和枳實水煎液低、中、高劑量組（0.104、0.208、0.416 g/m L，以生藥計），每天ig給藥1次，10m L/kg，連續(xù)7 d。末次給藥后，檢測大鼠血清胃泌素（GAS）和血漿乙酰膽堿（ACh）、胃動素（MTL）、P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠血清GAS水平和血漿ACh、MTL、SP水平降低（P＜0.01），血漿VIP水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，除柚皮苷高劑量組和辛弗林各劑量組大鼠血清GAS水平外，其余各給藥組均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；新橙皮苷高劑量組、辛弗林高劑量組和枳實水煎液低劑量組大鼠血漿ACh水平顯著升高（P＜0.01）；新橙皮苷中、高劑量組，辛弗林高劑量組，低、中劑量配伍組和枳實水煎液中、高劑量組大鼠血漿MTL水平顯著升高（P＜0.05）；柚皮苷低、中劑量組和新橙皮苷各劑量組大鼠血漿SP水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；柚皮苷低劑量組，辛弗林高劑量組和枳實水煎液低、中劑量組大鼠血漿VIP水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：枳實可能通過促進GAS、ACh、MTL的分泌和抑制VIP的分泌來促進脾虛模型大鼠的胃腸運動；其與3個單體成分對胃腸激素的調(diào)節(jié)作用有差異。

枳實；柚皮苷；新橙皮苷；辛弗林；胃腸激素；脾虛模型；大鼠

胃腸動力障礙性疾病是由多種原因?qū)е碌囊孕∧c推進減慢為特征的一組病癥，其既是眾多功能性消化道疾病的共同病理變化，又是加重疾病本身和產(chǎn)生繼發(fā)性病癥的因素[1]。據(jù)文獻報道，胃腸動力障礙性疾病與各種神經(jīng)遞質(zhì)和體液因子的釋放有關(guān)，許多胃腸疾病患者的胃腸激素水平與正常人存在著差異[2]。

枳實為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種或甜橙（Citrussinensis Osbeck）的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效[3]?，F(xiàn)代研究表明，枳實中黃酮類成分主要有柚皮苷、新橙皮苷，生物堿類成分主要有辛弗林[4-5]。本課題組前期研究已證實，柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林配伍對正常小鼠小腸具有推進作用[6]。近年來，枳實用于改善功能性消化不良的大鼠胃排空和小腸推進的研究已有報道[7]，但是其促胃腸運動的藥效物質(zhì)基礎及作用機制尚不明確。鑒于此，本研究通過觀察枳實水煎液及枳實主要活性成分對脾虛模型大鼠胃腸激素[血清胃泌素（GAS）及血漿乙酰膽堿（ACh）、胃動素（MTL）、P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）]的影響，以確定其作用的活性物質(zhì)基礎，并初步探討枳實的作用機制，為臨床上應用枳實治療胃腸動力障礙提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan MK3酶標儀（美國熱電公司）；Sigma-18高速冷凍離心機（離心半徑：6 cm，德國Sigma公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

大黃購于江西彭氏國藥堂飲片有限公司（批號：15120304）、枳實采于江西新干，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學賴學文教授鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）的干燥根莖和蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果；柚皮苷、新橙皮苷對照品[自制，批號：均為201612，采用核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）法進行結(jié)構(gòu)鑒定均符合要求，并采用高效液相色譜（HPLC）峰面積歸一化法測定其純度均不低于98%]；辛弗林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110727-201107，純度：＞98%）；大鼠ACh、GAS、MTL、SP、VIP酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號：1604204、1604122、1604121、1604101、1604071）；水合氯醛（上海青析化工科技有限公司，批號：20151003）。

1.3 動物

SD大鼠170只，SPF級，♀♂各半，體質(zhì)量為180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

2 方法

2.1 造模用藥的制備

稱取大黃藥材粗粉適量，加水浸泡30m in，煎煮2次，每次30m in，濾過，合并濾液，濃縮得質(zhì)量濃度為0.89 g/m L（以生藥計）的大黃水煎液[8]，冷藏，備用。

2.2 供試藥液的制備

2.2.1 枳實水煎液 枳實水煎劑劑量按成人（60 kg）處方日用量（10 g）的1、2、4倍設計。取枳實藥材粗粉適量，加水浸泡30m in，煎煮2次，每次30m in，濾過，合并2次濾液，濃縮得0.416 g/m L（以生藥計）的枳實水煎液，作為貯備液（經(jīng)HPLC含量測定，其中主要成分含量分別為：柚皮苷，3.141%；新橙皮苷，3.716%；辛弗林，0.240%）[8]。用此貯備液分別制備成質(zhì)量濃度分別為0.104、0.208、0.416 g/m L（以生藥計）的水煎液供試藥液，作為大鼠ig給藥的低、中、高劑量組用藥。

2.2.2 有效成分單體供試液和單體組合供試液 單體供試液劑量及單體組合供試液劑量根據(jù)其在枳實水煎液中的含量（柚皮苷，3.141%；新橙皮苷，3.716%；辛弗林，0.240%）等效量的1、2、4倍設計[8]。分別取柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林對照品適量，溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中，制備成質(zhì)量濃度分別為3.267、6.535、13.070 mg/m L的柚皮苷低、中、高劑量混懸液，質(zhì)量濃度分別為3.865、7.730、15.460mg/m L的新橙皮苷低、中、高劑量混懸液和質(zhì)量濃度分別為0.252、0.504、1.008mg/m L的辛弗林低、中、高劑量混懸液，以及參照枳實水煎液中3個單體成分含量進行擬合的單體組合物（即柚-新-辛）低、中、高劑量混懸液。

2.3 造模與給藥

2.3.1 造模 170只SD大鼠常規(guī)適應性飼養(yǎng)5 d，然后隨機分為空白組（10只）和造模組（160只）。造模組大鼠均采用苦寒瀉下+饑飽失常法復制脾虛模型[5，9]，即大鼠每天按（8.9 g/kg，以生藥計）ig大黃水煎液1次，10m L/kg，給藥當日禁食不禁水，次日飲、食均不限，連續(xù)14 d；空白組大鼠隔日ig等體積蒸餾水，其余條件相同。

2.3.2 給藥 造模結(jié)束后，將160只造模大鼠隨機分成16組，即模型組，柚皮苷低、中、高劑量組，新橙皮苷低、中、高劑量組，辛弗林低、中、高劑量組，柚-新-辛低、中、高劑量配伍組及枳實水煎液低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M和模型組大鼠ig等體積0.5%CMC-Na溶液，其余各組大鼠ig給予“2.2”項下相應藥液，給藥體積均為10m L/kg，每天1次，連續(xù)7 d。觀察并記錄造模及給藥期間大鼠的體質(zhì)量、糞便及精神狀態(tài)等一般情況。

2.4 標本采集與處理

末次給藥后大鼠禁食不禁水18 h，然后ip 10%水合氯醛溶液麻醉，用抗凝真空采血管于腹主動脈取血4 m L，在4℃條件下以4 000 r/m in離心10m in，分離上清（即血漿），置于－20℃冰箱中保存，待測。另取4m L血于空試管中，室溫放置2 h，在4℃條件下以4 000 r/m in離心10min，分離上清（即血清），－20℃保存，待測。

2.5 指標檢測

分別采用ELISA法測定大鼠血清GAS水平和血漿ACh、MTL、SP、VIP水平，具體操作按相應試劑盒說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況觀察結(jié)果

造模大鼠在造模第3天開始出現(xiàn)便溏，且一直持續(xù)到造模結(jié)束；在造模第5天后飲食量明顯減少；在造模第7天后出現(xiàn)消瘦、體質(zhì)量減輕，并且多數(shù)大鼠出現(xiàn)動作遲緩現(xiàn)象?？瞻捉M大鼠糞便無明顯變化，飲食量、體質(zhì)量有所增加，精神狀態(tài)良好。

3.2 大鼠胃腸激素水平測定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清GAS水平及血漿MTL、SP水平顯著降低（P＜0.01），血漿VIP水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柚皮苷低、中劑量組大鼠血清GAS水平和血漿SP水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而低、中、高劑量組大鼠血漿ACh水平和低劑量組大鼠血漿VIP水平顯著降低（P＜0.05）；新橙皮苷各劑量組大鼠血清GAS水平和血漿SP水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組大鼠血漿ACh、MTL水平以及中劑量組大鼠血漿MTL水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），低劑量組大鼠血漿ACh水平顯著降低（P＜0.05）；辛弗林高劑量組大鼠血漿ACh、MTL水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組大鼠血漿VIP水平、低劑量組大鼠血漿SP水平顯著降低（P＜0.05）；柚-新-辛各劑量配伍組大鼠血清GAS水平及低、中劑量配伍組大鼠血漿MTL水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），低、中劑量配伍組大鼠血漿ACh水平顯著降低（P＜0.05）；枳實水煎液各劑量組大鼠血清GAS水平和低劑量組大鼠血漿ACh水平以及中、高劑量組大鼠血漿MTL水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），低、中劑量組血漿VIP水平顯著降低（P＜0.05），結(jié)果詳見表1。

4 討論

胃腸動力障礙性疾病主要表現(xiàn)為胃腸動力障礙引起的一系列胃腸癥狀，但卻未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，該病包括功能性消化不良、胃輕癱、糖尿病性胃輕癱等，其發(fā)病機制較復雜，至今尚未被闡明，但許多學者認為該病的發(fā)生與胃腸激素分泌異常有關(guān)[10]。胃腸激素是由散在分布于消化道的內(nèi)分泌細胞和腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元所分泌的起激素作用的生物活性多肽，其既存在于胃腸道中，也存在于腦組織中，因此也稱之為腦腸肽。

ACh是胃腸道最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)與M受體結(jié)合，使平滑肌膜去極化，促使鈣離子內(nèi)流，刺激胃腸肌收縮和促進胃腸蠕動，對胃腸運動起主要調(diào)節(jié)作用。GAS除了能促進胃酸和胃蛋白酶分泌，還能引起胃底舒張、胃竇收縮，加快胃排空。MTL是腸道合成的一種多肽，可與胃腸道分布的相應受體結(jié)合，影響消化間期移行性復合運動，進而發(fā)揮其促進胃腸運動，提高胃腸道、膽道等的收縮力和張力的作用[11]。SP廣泛分布于胃腸道及神經(jīng)系統(tǒng)，也是胃腸運動調(diào)節(jié)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一。VIP是一種重要的抑制性胃腸肽，在腸道中廣泛分布，可通過直接作用于胃腸平滑肌上VIP受體發(fā)揮作用，使胃腸平滑肌及胃腸括約肌舒張，維持正常的胃腸下行蠕動[10，12]。

表1 各組大鼠血清GAS水平和血漿ACh、M TL、SP、VIP水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determ ination results of GAS level in serum and ACh，MTL，SP，VIP levels in p lasma of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清GAS水平和血漿ACh、M TL、SP、VIP水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determ ination results of GAS level in serum and ACh，MTL，SP，VIP levels in p lasma of rats in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組柚皮苷低劑量組柚皮苷中劑量組柚皮苷高劑量組新橙皮苷低劑量組新橙皮苷中劑量組新橙皮苷高劑量組辛弗林低劑量組辛弗林中劑量組辛弗林高劑量組柚-新-辛低劑量配伍組柚-新-辛中劑量配伍組柚-新-辛高劑量配伍組枳實水煎液低劑量組枳實水煎液中劑量組枳實水煎液高劑量組VIP，pg/mL 72.83±2.33 84.45±4.03＊70.12±5.60#73.73±7.60 76.15±7.99 84.01±8.02 78.24±5.69 77.27±5.82 73.30±8.53 70.55±6.70 65.27±8.10#78.02±5.28 75.71±6.87 70.69±5.62 67.50±7.59#68.95±5.36#74.74±6.46 GAS，ng/mL 2.78±0.29 2.00±0.28＊＊2.34±0.52#2.28±0.27#1.99±0.60 2.46±0.63#3.16±0.55##3.35±0.40##2.22±0.33 2.07±0.19 1.97±0.13 2.82±0.24##3.01±0.15##3.11±0.48##3.15±0.33##2.99±0.21##2.78±0.23##ACh，pg/mL 309.40±36.37 235.66±43.12 158.44±19.75##163.80±43.87##168.20±31.08##168.81±24.44##209.00±41.52 334.83±33.13##212.20±37.08 235.76±49.16 287.90±31.93##149.12±17.92##184.36±31.13##213.32±37.10 289.90±39.66##236.60±46.05 228.68±24.14 MTL，pg/mL 97.15±13.31 48.13±8.03＊＊54.01±10.81 52.49±5.16 47.45±4.90 43.17±4.64 58.50±6.84#61.74±6.59#48.51±8.15 48.52±9.72 63.04±6.57#62.42±8.84#59.53±7.31#52.35±10.32 55.78±8.54 59.45±6.36#63.07±5.00#SP，pg/mL 20.02±2.42 16.84±3.79＊＊22.05±2.97##19.90±3.34#14.68±3.05#18.77±1.46#21.14±0.76##21.65±2.89##12.88±2.07##15.17±2.37 17.34±2.13 17.08±2.48 16.53±0.87 15.68±0.26 18.14±1.89 17.75±2.08 17.46±2.06

本研究結(jié)果顯示，柚皮苷可升高脾虛模型大鼠血清GAS水平和血漿SP水平，降低血漿VIP水平；新橙皮苷可升高脾虛模型大鼠血清中GAS和血漿MTL、SP水平；辛弗林可升高脾虛模型大鼠血漿ACh、MTL水平并降低血漿VIP水平；上述3個單體成分的組合物可升高脾虛模型大鼠血清GAS水平和血漿MTL水平；枳實水煎液可升高脾虛模型大鼠血清GAS水平和血漿ACh、MTL水平，并降低血漿VIP水平。此外，筆者在前期實驗中還考察了橙皮苷、川陳皮素和橘皮素對脾虛模型大鼠胃腸激素的影響，發(fā)現(xiàn)三者均可影響ACh、MTL、SP的分泌，故筆者推測3種單體成分及其組合物與枳實水煎液對大鼠胃腸激素的影響趨勢不一致的原因，可能與枳實中還含有少量的橙皮苷、川陳皮素和橘皮素等成分有關(guān)。

綜上，枳實促進脾虛模型大鼠胃腸運動的機制可能與其促進GAS、ACh、MTL的分泌，抑制VIP分泌有關(guān)；柚皮苷的作用機制可能與其促進GAS、SP分泌，抑制VIP分泌有關(guān)；新橙皮苷作用機制可能與其促進GAS、MTL、SP的分泌有關(guān)；辛弗林的作用機制可能與其促進ACh、MTL的分泌和抑制VIP的分泌有關(guān)；而組合物的作用機制可能與其促進GAS、MTL的分泌有關(guān)。單體成分與枳實對胃腸激素的調(diào)節(jié)作用不同，這可能與單體作用靶點不同和枳實中還含有其他成分有關(guān)。

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Study on the M echanism of Aurantii Fructus Immaturus and Its M ain Active Ingredients in Promoting GastrointestinalM otility of M odel Ratsw ith Sp leen Deficiency

HU Yuanxiang，CHEN Haifang，SONG Yupeng，TAN Shushu，LUO Xiaoquan，YANG Wuliang（Key Laboratory of Modern Preparation of TCM of M inistry of Education，JiangxiUniversity of TCM，Nanchang 330004，China）

Aurantii fructus immaturus；Naringin；Neohesperidin；Synephrine；Gastrointestinal hormones；Spleen deficiency model；Rats

R965

A

1001-0408（2017）13-1747-04

2016-09-14

2016-11-07）

（編輯：林 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81460575，81260612）

＊碩士研究生。研究方向：中藥學。電話：0791-87118658。E-mail：943546377@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎與中藥質(zhì)量評價。電話：0791-87118658。E-mail：yangwuliang@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.06

ABSTRACTOBJECTIVE：To study themechanism of Aurantii fructus immaturus（AFI）and itsmain active ingredients in promoting gastrointestinalmotility ofmodel rats w ith spleen deficiency.METHODS：170 rats were random ly divided into blank group（10 rats）and modeling group（160 rats），rats in modeling group was induced models w ith spleen deficiency by bitter cold diarrhea+irregular diet.A fter modeling，rats were random ly divided into model group，naringin（NA）low-dose，medium-lose，high-dose groups（3.267，6.535，13.070 mg/m L），neohesperidin（NE）low-dose，medium-lose，high-dose groups（3.865，7.730，15.460 mg/m L），synephrine（SY）low-dose，medium-lose，high-dose groups（0.252，0.504，1.008 mg/m L），compatibility groups w ith 3 monomer ingredients（NA-NE-SY）low-dose，medium-lose，high-dose and AFI water decoction low-dose，medium-lose，high-dose groups（0.104，0.208，0.416 g/m L，calculated by crude drug），ig，once a day，10 m L/kg，for 7 d.A fter the last adm inistration，gastrin（GAS）in serum，and acetylcholine（ACh），motilin（MTL），substance P（SP），vasoactive intestinal peptide（VIP）levels in plasma were detected.RESULTS：Compared w ith blank group，GAS level in serum and ACh，MTL，SP levels in plasma in model group were reduced（P＜0.01），VIP level in plasma was increased（P＜0.05）.Compared w ith model group，except for the GAS level in serum showed no obvious change in NA high-dose group and SY doses groups，other medicine groups were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；the ACh levels in serum were obviouly increased in NE high-dose group，SY high-dose group and AFIwater decoction low-dose group（P＜0.01）.MTL levels in plasma were obviously increased in NEmedium-dose，high-dose groups，SY high-dose group，compatibility low-dose，medium-dose groups and AFI water decoction medium-dose，high-lose groups（P＜0.05）；SP levels in plasma were obviously increased in NA low-dose，medium-dose groups and NE doses groups（P＜0.05 or P＜0.01）；VIP levelswere reduced in NA low-dose group，SY high-dose group and AFIwater decoction low-dose，medium-lose groups（P＜0.05）.CONCLUSIONS：AFImay promote the gastrointestinalmotility ofmodel rats w ith spleen deficiency by promoting the secretion of GAS，ACh，MTL，and inhibiting the secretion of VIP；there are differences between AFIand the 3monomer ingredients in regulation of gastrointestinal hormones.