酶水解哈氏仿對(duì)蝦蛋白提高咸味的研究

王欣，安燦，陳美齡，繆文華，羅成，鄧尚貴

(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

酶水解哈氏仿對(duì)蝦蛋白提高咸味的研究

王欣，安燦，陳美齡，繆文華，羅成，鄧尚貴*

(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

咸味是人類主要的味覺之一，是控制機(jī)體生理平衡最重要的因素之一。然而由于味覺的需要，人類食用鹽量普遍高于真正所需的量。為了研究水解海洋蛋白產(chǎn)生咸味肽，以便于開發(fā)適合于高血壓病人所需的無(wú)鈉調(diào)味劑。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 12135-2008感官分析方法，該研究建立了NaCl感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以用于咸味肽對(duì)應(yīng)食鹽濃度的感官評(píng)估。根據(jù)木瓜蛋白酶選擇性水解疏水氨基酸的特性，使用0.1%木瓜蛋白酶能使哈氏仿對(duì)蝦蛋白在0～2.5 h咸度從10 mmol/L提高到35 mmol/L，但仍保留多數(shù)哈氏仿對(duì)蝦20 kDa主蛋白及以下的蛋白。為了提高蛋白水解度以及提高咸度的可能性，使用1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶，雙酶水解在0～2.5 h幾乎所有蛋白都被消化，咸度由10 mmol/L提高到55 mmol/L，這些實(shí)驗(yàn)表明木瓜蛋白酶與中性蛋白酶一旦協(xié)同結(jié)合，既可充分地水解蛋白，也可釋放更多的咸味肽。而隨后咸味的下降應(yīng)該是進(jìn)一步水解成單氨酸，這些為咸味肽的工藝設(shè)計(jì)等提供了重要參考。

哈氏仿對(duì)蝦；感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)；雙酶水解；咸味肽；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶

食鹽(NaCl)所產(chǎn)生的咸味不僅可以改善人們的食欲，更重要的是，有調(diào)節(jié)人體機(jī)體體液和電解質(zhì)平衡以及體溫的平衡等重要功能。然而據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料，人類食用鹽普遍高于生理的實(shí)際需求。高鹽引起細(xì)胞及血管滲透作用異常，通常導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病、高血壓及不同的心血管疾病[1,2]。為了保持同樣的食鹽咸度，而又能減少食用的食鹽量一直是食品科學(xué)的使命。目前世界衛(wèi)生組織(WHO)建議的鹽攝入量為6 g/天/成人(70 kg)， 但我國(guó)人群實(shí)際上的鹽攝入量超過10 g[3]，如北京地區(qū)人日均食鹽攝入量為16～18 g，高血壓發(fā)生率為9.5/萬(wàn)人；而廣東地區(qū)人日均食鹽攝入量為6～7 g，高血壓發(fā)生率僅為2.5/萬(wàn)人[4,5]。為了減少食鹽攝入量，最有效的方法是減少Na+的攝入，而又能保持食品咸味。目前我國(guó)市場(chǎng)上有各種各樣的低鈉 (比如KCl替代部分NaCl)調(diào)味劑，但或是缺乏營(yíng)養(yǎng)，或?qū)嵸|(zhì)上是堿性添加物。

當(dāng)過量食鹽，血管中鹽濃度過高，血管中的水分就會(huì)增加，血容量增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)外鈉離子水平的增加可導(dǎo)致細(xì)胞水腫，血管平滑肌細(xì)胞腫脹，血管腔狹窄，外周血管阻力增大，進(jìn)而導(dǎo)致血管壁受到的壓力增強(qiáng)，最終使血壓升高，此外，鹽也可加重心臟、腎臟的負(fù)擔(dān)，所有這些原因都可能使高鹽導(dǎo)致各種心血管疾病[6]。咸味肽最早是Tada等于1984年在對(duì)酪蛋白水解物BPla(Arg-G1y-Pro-Pro-Phe-lle-Val)的N端類似物的合成過程中偶然發(fā)現(xiàn)的。因?yàn)檫@些肽除了鮮味，也有咸味。接著他們又通過合成發(fā)現(xiàn)了幾種呈咸味的二肽，其中L-Orn-β-Ala. HCl和L-Orn-Tau. HCl有著與NaCl相同甚至比NaCl咸味更強(qiáng)的味[7]。Seki于1990年研究了咸味二肽Orn-β-Ala的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)二肽的咸味與氨基的解離程度以及是否有相對(duì)離子有關(guān)。Seki等進(jìn)一步研究認(rèn)為多肽溶液的pH值與呈咸味的特性有很大關(guān)系[8]。

最近幾年從不同的蛋白酶水解短肽中發(fā)現(xiàn)，酶水解短肽，特別是魚精蛋白、奶蛋白，各種動(dòng)物肉蛋白的咸味增加明顯，而大米、豌豆蛋白的水解肽幾乎不產(chǎn)生任何咸味[9]，主要是由于前者包含大量L-賴氨酸和L-精氨酸，雖然其機(jī)理尚不完全清楚，但這些短肽特別是二肽所提高的咸味不增加苦味，非常適合于糖尿病(Ⅱ型)人或高血壓病人提供高營(yíng)養(yǎng)的無(wú)鈉咸味劑[10,11]。所以研究咸味肽，特別是從海洋漁業(yè)資源中尋找咸味肽，將有助于水產(chǎn)品的深加工。哈氏仿對(duì)蝦是舟山沿海重要的經(jīng)濟(jì)蝦，價(jià)格低廉[12]，因而極有可能成為尋找咸味肽的良好材料。

1 材料與方法

1.1 材料

自然捕撈的哈氏仿對(duì)蝦[Parapenaeopsishardwickii(Miers)]：購(gòu)買于舟山超市，由浙江海洋大學(xué)老師對(duì)哈氏仿對(duì)蝦進(jìn)行鑒定；牡蠣蛋白肽：用作水解蛋白對(duì)照，青島東易科技發(fā)展有限公司；中性蛋白酶(EC 3.4.24.4)：50 U/mg，酶活≥50 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)：級(jí)別為BR，酶活力為800000 U/g，上海研域生物工程有限公司；小牛血清白蛋白(BSA)：級(jí)別為BR，USA Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ-8812S-型電子恒溫振蕩器 常州諾基儀器有限公司；Bio-Rad 酶標(biāo)儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Delta 320 pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TGL-20M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DS-1 高速組織搗碎機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司；HH-S 型水浴鍋，85-2 型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；DHL-A 恒流泵，HD-3 紫外檢測(cè)儀，HD-A電腦采集器 上海瀘西分析儀器廠；AY120型分析天平；Himac CF 16RX離心機(jī) 日立公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味感官標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

首先利用無(wú)離子水及58.5 g食鹽(浙江祿海制鹽有限公司)制備1 mol/L NaCl，然后稀釋配成10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100 mmol/L。對(duì)每種濃度根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 12135-2008感官分析方法：排序法及Friedman檢驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)定[13]。即隨機(jī)利用連續(xù)3個(gè)濃度單盲正確地判斷出低、中、高濃度的測(cè)試者，測(cè)出其余的感官NaCl 濃度，并做出NaCl的感官標(biāo)準(zhǔn)曲線，用此曲線在測(cè)試人中形成自身的咸味刻度來測(cè)試未知咸度的對(duì)應(yīng)食鹽濃度。

哈氏仿對(duì)蝦購(gòu)買于舟山超市，酶解前保存于冰的環(huán)境。酶解條件：去離子水清洗后，經(jīng)去殼、稱重100 g，按 1∶5的蛋白質(zhì)量比加入0.01×PBS緩沖液，在DS-1高速組織搗碎機(jī)上打漿5～10 min，分別加入0.1%的木瓜蛋白酶、1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶，混合攪拌均勻，置于 50 ℃水浴鍋中，酶解過程中的pH不做調(diào)整(以防止引入鹽離子干擾咸度的鑒定)，酶解4 h；每0.5 h取樣1次，取樣后置于95 ℃水浴鍋中，滅酶15 min，冷卻，定容，12000 r/min離心10 min，取上清液備用。在水解過程中按設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣和感官評(píng)定。

1.3.2 蝦蛋白酶水解與咸度測(cè)定

哈氏仿對(duì)蝦經(jīng)過勻漿后，以1∶5與0.01×PBS緩沖液稀釋，然后以蛋白樣品0.1%的木瓜蛋白酶，或者1%的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶雙酶的酶量在50 ℃進(jìn)行酶消化。對(duì)0.01%的木瓜蛋白酶酶解消化后，每30 min取樣1次，當(dāng)場(chǎng)測(cè)量感官咸度，取得樣品用于SDS-PAGE樣品；對(duì)1%雙酶水解消化后，10 min 取樣1次，接下來每30 min取樣1次，當(dāng)場(chǎng)測(cè)量感官咸度，取得樣品用于SDS-PAGE樣品。

1.3.3 Bradford 蛋白濃度測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)G-250(1 g)，溶于50 mL 95%酒精，最后用無(wú)離子水定容到1000 mL。在96孔平板，按180 μL G-250+20 μL 設(shè)置，在595 mmol/L 波長(zhǎng)使用Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳

由于是2肽、3肽、寡肽，產(chǎn)生咸度更高，所以需展示可控的消化蛋白的變化過程。按照Bio-Rad方法配制5%的濃縮膠、15%的分離膠。SDS-PAGE凝膠電泳酶水解樣品，80 V，4 h。凝膠經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色1 h后進(jìn)行脫色，脫色約8 h后進(jìn)行照相。利用Photoshop(Adobe 6.0)捕捉蛋白帶灰度值，并使用微軟Excel(2010專業(yè)版)計(jì)算出相對(duì)蛋白濃度。

1.3.5 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗(yàn)對(duì)各組變異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)采用Excel(2010專業(yè)版)分析，做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽咸度的感官評(píng)定曲線

由于缺乏真正的儀器測(cè)量咸度，故采用感官評(píng)價(jià)方法。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，50 mmol/L的NaCl最接近肉湯的咸度。感官標(biāo)準(zhǔn)曲線感官濃度低于實(shí)際NaCl濃度 (R2=0.9921)，可能是溶解度帶來的誤差，也包括感官的不敏感帶來的系統(tǒng)誤差，見圖1。

圖1 食鹽(NaCl)感官曲線

注：誤差棒表示其標(biāo)準(zhǔn)誤差。

雖然檢測(cè)NaCl有專門的國(guó)標(biāo)法 GB/T 12457-2008，但不可能用于非NaCl 咸味劑的測(cè)定，而只能有感官評(píng)定法。人的感覺器官是非常精密的“生物檢測(cè)器”，它可以檢測(cè)到用化學(xué)分析儀器無(wú)法檢測(cè)到的微量成分，測(cè)試人是在校大學(xué)生和研究生，其測(cè)試閾值是5～10 mmol/L NaCl。利用高、中、低的單盲測(cè)試結(jié)果，或作者通過自己建立起的記憶感官標(biāo)準(zhǔn)曲線，可相對(duì)精準(zhǔn)地評(píng)定出對(duì)應(yīng)的NaCl 濃度，這一標(biāo)準(zhǔn)曲線被始終用在這一研究中，以用作酶水解蛋白不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的NaCl濃度與咸度的參照。

2.2 酶水解哈氏仿對(duì)蝦蛋白

酶水解前后總蛋白濃度變化利用考馬斯亮藍(lán)G-250在595 mmol/L對(duì)蛋白有吸收，蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線按照Bio-Rad公司提供方法進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀的OD值及蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出蛋白量。蛋白量從未消化時(shí)的0.92 mg/mL到3 h消化后的0.63 mg/mL，蛋白的降解趨于穩(wěn)定，0.1%木瓜蛋白酶水解的蛋白(總)濃度的變化進(jìn)程見圖2，即蛋白濃度的變化會(huì)反映水解的程度。

圖2 Bradford 法測(cè)定木瓜蛋白酶水解(0.1%)前后蛋白濃度

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)0.1%木瓜蛋白酶水解蛋白及咸味變化的感官評(píng)定

圖3 木瓜蛋白酶(0.1%)水解哈氏仿對(duì)蝦蛋白咸味的提高

注：A為SDS-PAGE 展示的 3 h的蛋白消化；帶1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2為未經(jīng)酶解的蛋白CK，3～8為0.1% 的木瓜蛋白酶水解的魚蛋白，依次為30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B為對(duì)應(yīng)的水解過程的咸味變化。

由圖3中A可知，0.1%的木瓜蛋白酶水解哈氏仿對(duì)蝦后的蛋白分布，大多數(shù)20 kDa位置的蛋白明顯未被水解，這個(gè)情況應(yīng)該與木瓜蛋白酶的選擇性切割蛋白肽的特征有關(guān)系，木瓜蛋白酶選擇性切割疏水性氨基酸如賴氨酸、精氨酸等。由圖3中B可知，其咸度從10 mmol/L增加到2.5 h 的最高咸度35 mmol/L，隨后咸度下降，但沒有產(chǎn)生其他味道，一方面應(yīng)該是酶量有限，不能水解更多的蛋白 (見圖3中A)，另一方面很有可能也受酶與蛋白的3D 空間影響，所以無(wú)3D 空間障礙的寡肽則會(huì)被繼續(xù)降解，所以造成咸度下降，這說明雖然木瓜蛋白酶的選擇性切割蛋白肽的特征導(dǎo)致水解不完全，但是其仍具有提高咸度的潛力。

2.4 SDS-PAGE 檢測(cè)雙酶水解蛋白及咸味變化的感官評(píng)定

圖4 木瓜蛋白酶與中性酶雙酶(1%)水解哈氏仿對(duì)蝦蛋白咸味的提高

注：A為SDS-PAGE 展示的10'～3 h的蛋白消化；帶1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2為未經(jīng)酶解的蛋白CK；3～9為1% 的雙酶水解的魚蛋白，依次為 10'，30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B為水解過程的咸味變化。

由圖4中A可知，1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶水解3 h可以基本全部消化哈氏仿對(duì)蝦的所有蛋白。由圖4中B可知，其咸度從10 mmol/L增加到2.5 h的最高咸度55 mmol/L，咸度增加幅度大，咸味明顯提升，在這個(gè)時(shí)間的咸味肽產(chǎn)生量最多，根據(jù)這一結(jié)果，我們可以選擇在酶解2.5 h時(shí)進(jìn)行滅酶，然后分離提純，獲取最終的咸味肽。而隨后咸度下降，咸味中夾雜苦澀味和甜味以及鮮味等，中性蛋白酶的水解產(chǎn)生了苦味肽、甜味肽以及鮮味肽等，這有可能是中性酶水解蛋白導(dǎo)致單氨基酸所產(chǎn)生的原因。

3 結(jié)論

肽優(yōu)于蛋白質(zhì)允許更快地與水吸附，咸味肽的發(fā)現(xiàn)有利于海洋水產(chǎn)品的深加工，提高經(jīng)濟(jì)效益，更主要的是有助于降低NaCl的攝入量，向高血壓病人提供無(wú)鈉咸味劑，從而降低高血壓、Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

使用0.1%木瓜蛋白酶單酶水解咸度從10 mmol/L增加到35 mmol/L，這很有可能也受酶與蛋白的3D空間影響，從而無(wú)3D空間障礙的寡肽則會(huì)被繼續(xù)降解，從而造成咸度下降。而使用各自1%的木瓜蛋白酶及中性蛋白酶雙酶水解，咸度從10 mmol/L增加到 55 mmol/L，這應(yīng)該由于結(jié)合了雙酶的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橹行缘鞍酌甘请S機(jī)水解任何蛋白中的任何肽鍵，而木瓜蛋白酶則只選擇性地切割咸味相關(guān)的肽，這既幫助了蝦蛋白的加快水解，也保證精氨酸、賴氨酸二肽的形成，提高了更多咸味肽的產(chǎn)生，當(dāng)然咸味肽需要有一定的二肽結(jié)構(gòu)。隨著蛋白或者肽的深度酶解，二肽也將被水解成單氨基酸，這很可能是水解2.5 h后咸度反而下降的原因。

這些結(jié)果為有效地生產(chǎn)具有咸味的精氨酰二肽，在工業(yè)化過程中可能需要的消化及控制條件等的設(shè)計(jì)提供基本信息，以積累更多產(chǎn)品。

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[13]GB/T 12135-2008，感官分析方法：排序法[S].

Enzymatic Hydrolysis of Parapenaeopsis hardwickii(Miers) Protein for Enhancing Saltiness

WANG Xin, AN Can, CHEN Mei-ling, MIAO Wen-hua, LUO Cheng, DENG Shang-gui*

(School of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022,China)

Saltiness is one of the basic tastes and plays a key role in human physiological balance. The adverse effects of excessive salt intake have forced the food industry to seek alternatives to reduce salt content in food while maintaining sufficient saltiness. This study is to develop salty peptides from enzymatically hydrolyzed shrimp proteins, aiming for type 2 diabetes and high blood pressure patients. According to the standard GB/T 12135-2008 sensory evaluation method, a standard curve plotting salinity against salt (NaCl) concentration is established, which is used for the saltiness evaluation of fish peptides. Since papains selectively hydrolyze hydrophobic amino acids, such as arginine and lysine, and they are also amino acids for salty peptides. In this study, the protein ofParapenaeopsishardwickii(Miers) is digested by 0.1% papain(EC 3.4.22.2), the salinity increases from 10 mmol/L to 35 mmol/L, but 20 kDa and lower proteins remain. In order to improve the protein hydrolysis and the salinity, 1% neutral protease and papain, double enzyme hydrolysis for 2.5 h, almost all of these proteins can be digested, salinity increases from 10 mmol/L to 55 mmol/L. The experimental results show that papain and neutral protease is a synergistic combination, can be used to fully hydrolyze protein, and generate more salty peptide. The decrease of saltiness after the peak could be the results of further hydrolysis of dipeptides. These results provide an important reference for the process design of salty peptides in industry.

Parapenaeopsishardwickii(Miers); sensory evaluation standard; double enzymes hydrolysis; salty peptides; papain; neutral protease

2016-11-16 *通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(31471609)；中國(guó)國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2012DFA30600)

王欣(1991-)，女，江蘇徐州人，碩士，研究方向：食品科學(xué)與水產(chǎn)品加工；

羅成(1958-)，男，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)；

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.004

1000-9973(2017)05-0012-05

鄧尚貴(1966-)，男，浙江舟山人，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)與水產(chǎn)品加工。