八角多酚提取物對(duì)植物病原真菌的抑制作用研究

朱奇奇，張杰，謝平，余波，張馳翔，焦士蓉

(西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，成都 610039)

八角多酚提取物對(duì)植物病原真菌的抑制作用研究

朱奇奇，張杰，謝平，余波，張馳翔，焦士蓉*

(西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，成都 610039)

采用生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定八角多酚提取物對(duì)小麥赤霉菌(FusariumgraminearumSchw)、水稻立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、馬鈴薯晚疫病(Potato late blight)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)5種植物病菌的抑菌活性。初篩結(jié)果表明八角多酚提取物對(duì)小麥赤霉菌、水稻立枯絲核菌(水稻紋枯病菌)、番茄灰霉菌、馬鈴薯晚疫病、油菜菌核病菌的抑制率分別為42.19%，98.50%，90.19%，56.87%，95.01%。對(duì)抑制率在90%以上的3種病原菌進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，其EC50值分別為2.164，5.256，2.295 mg/L。

八角多酚提取物；植物病原真菌；抑制作用

八角是我國(guó)常見的香辛料，因其價(jià)格便宜、產(chǎn)量高而廣泛應(yīng)用于食品調(diào)味，已有文獻(xiàn)報(bào)道八角對(duì)部分細(xì)菌和真菌具有一定的抑菌作用[1-4]，但系統(tǒng)的針對(duì)八角提取物對(duì)植物病原真菌抑制作用的研究還未見報(bào)道。本研究以日常食用的八角為對(duì)象，采用不同的方法提取出其有效物質(zhì)，研究了其提取物對(duì)5種最具代表性的常見植物病原真菌的抑制作用，旨在找到更加高效、低毒的植物源殺菌劑或保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八角(市售)、硫酸鏈霉素原藥(Amresco.0382)、小麥赤霉菌(FusariumgraminearumSchw)、水稻立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、馬鈴薯晚疫病(Potato late blight)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，植物病原菌均由西華大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

乙醇(分析純)、無水碳酸鈉、沒食子酸 成都科龍化工試劑廠；福林-酚試劑 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；二苯代苦味酰肼自由基 Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2600A型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；自動(dòng)臺(tái)式滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；TGL-16G-高速冷凍離心機(jī) 上海滿賢經(jīng)貿(mào)有限公司；ST-02A型多功能粉碎機(jī) 永康市帥通工具有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)[5]方法配制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 八角多酚提取物的制備

稱取200.00 g八角，打粉，篩分，取80～100目粉末20.00 g，60%的乙醇，料液比1∶40，在80 ℃進(jìn)行冷凝回流提取2 h，抽濾，再冷凝回流1次，混合2次濾液，真空濃縮，冷凍干燥，得棕色粉末，得率為10.60 mg/g，總多酚含量為23.03 mg/g。

1.4.2 硫酸鏈霉素的配制

精確稱取硫酸鏈霉素0.05 g于25 mL比色管中，蒸餾水定容。

1.4.3 八角多酚提取物抑菌活性的初篩(平板生長(zhǎng)速率法)[6-8]

將八角提取物溶解于無菌水中，稀釋成濃度為50 mg/mL的溶液，加入到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，同時(shí)加入濃度為50 mg/L的鏈霉素。以不添加八角提取物的溶液作空白對(duì)照，配制成厚薄均勻的平板。在無菌操作臺(tái)用滅菌的打孔器打取Ф 6 mm生長(zhǎng)良好、無污染、長(zhǎng)勢(shì)均勻的實(shí)驗(yàn)菌的菌餅，分別接種到含藥和不含藥的對(duì)照培養(yǎng)基內(nèi)。25 ℃恒溫培養(yǎng)3天，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(時(shí)間為對(duì)照菌落直徑為50 mm左右的培養(yǎng)時(shí)間)，取其平均值。

通過以下公式計(jì)算其相對(duì)抑菌率：

菌落直徑=實(shí)測(cè)菌落直徑-6 mm(菌餅徑)；

1.4.4 八角總多酚提取物抑菌活性的穩(wěn)定性測(cè)定(二倍稀釋平板生長(zhǎng)速率法)

將經(jīng)初篩后抑菌活性達(dá)90%以上的植物病原菌作為實(shí)驗(yàn)菌種。將提取物采用二倍稀釋法制成一系列不同濃度的稀釋液，加入到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，同時(shí)加入鏈霉素(抑制細(xì)菌生長(zhǎng))，使其最終濃度為50 mg/L，測(cè)定方法同1.4.3。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角總多酚提取物抑菌活性初篩結(jié)果

將八角提取物配制成濃度為50 mg/mL的培養(yǎng)基，按照1.4.3的實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)小麥赤霉菌、水稻立枯絲核菌(水稻紋枯病菌)、番茄灰霉菌、馬鈴薯晚疫病菌、油菜菌核菌進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖1。

對(duì)照組1～5#

實(shí)驗(yàn)組6～10#

注：1～5#分別為小麥赤霉菌、水稻立枯絲核菌(水稻紋枯病菌)、 番茄灰霉菌、馬鈴薯晚疫病菌、油菜菌核菌空白對(duì)照；6～10#分別為加50 mg/mL提取物實(shí)驗(yàn)組。

由圖1可知，提取物對(duì)上述5種病原真菌的抑菌率分別為42.19%，98.50%，90.19%，56.87%，95.01%。

提取物對(duì)5種植物病原菌均有抑制作用，特別是對(duì)水稻立枯絲核菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)到90%以上。

2.2 八角總多酚提取物的抑菌穩(wěn)定性結(jié)果

2.2.1 八角總多酚提取物對(duì)水稻立枯絲核菌的抑菌穩(wěn)定性

由初篩結(jié)果可知八角總多酚提取物對(duì)水稻立枯絲核菌的抑制作用最佳，因此按1.4.4的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，測(cè)定其穩(wěn)定性，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度的八角總多酚提取物對(duì)水稻立枯絲核菌的抑制

注：對(duì)照從左到右濃度分別為50，25，12.5，6.25，3.125 mg/mL。

八角總多酚提取物的抑制率分別為97.84%，91.63%，87.43%，70.46%，60.78%，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.5軟件處理后，其線性回歸方程為Y=1.3887X+4.5343，EC50值為2.164 mg/mL，而且濃度與藥效間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.9721。經(jīng)卡方檢驗(yàn)(見表1)證明其結(jié)果是可靠的。

表1 八角總多酚提取物對(duì)水稻立枯絲核菌抑制卡方檢驗(yàn)

由表1可知，提取物的EC50值為2.16 mg/L，多菌靈的EC50值為0.9 mg/L，相差2.4倍。

2.2.2 八角總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑菌穩(wěn)定性

由初篩結(jié)果可知八角總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑制作用最佳，因此按1.4.4的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，測(cè)定其穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度的八角總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑制

注：對(duì)照從左到右濃度分別為50，25，12.5，6.25，3.125 mg/mL。

八角總多酚提取物的抑制率分別為90.11%，81.54%，73.27%，51.43%，37.21%，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.5軟件處理后，其線性回歸方程為Y=1.3752X+3.9977，EC50值為5.356 mg/mL，而且濃度與藥效間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.9087。經(jīng)卡方檢驗(yàn)(見表2)證明其結(jié)果是可靠的。

表2 八角總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌抑制卡方檢驗(yàn)

由表2可知，提取物的EC50值為5.36 mg/L，多菌靈的EC50值為20.80 mg/L，提取物的抑制作用高于多菌靈3.88倍。

2.2.3 八角總多酚提取物對(duì)油菜菌核菌的抑菌穩(wěn)定性

由初篩結(jié)果可知八角總多酚提取物對(duì)油菜菌核菌的抑制作用最佳，因此按1.4.3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，測(cè)定其穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度的八角總多酚提取物對(duì)油菜菌核菌的抑制

注：對(duì)照從左到右濃度分別為50，25，12.5，6.25，3.125 mg/mL。

八角總多酚提取物的抑制率分別為93.85%，88.98%，75.27%，71.68%，55.78%，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.5軟件處理后，其線性回歸方程為Y=1.1247X+4.5943，EC50值為2.295 mg/mL，而且濃度與藥效間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.9378。經(jīng)卡方檢驗(yàn)(見表3)證明其結(jié)果是可靠的。

表3 八角總多酚提取物對(duì)油菜菌核菌抑菌卡方檢驗(yàn)

由表3可知，提取物的EC50值為2.30 mg/L，多菌靈的EC50值為3.50 mg/L，提取物的抑制作用高于多菌靈1.52倍。

3 結(jié)論

通過初篩實(shí)驗(yàn)，表明提取物對(duì)5種植物病原真菌均有抑制活性，其中，對(duì)水稻立枯絲核菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌的抑制率高于90%。

分別對(duì)3種菌進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，并采用常用抑真菌劑作為對(duì)照，結(jié)果表明：提取物對(duì)番茄灰霉菌、油菜菌核菌的抑制作用優(yōu)于多菌靈，具有開發(fā)植物源農(nóng)藥或新型保鮮劑的前景。

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Research on Antibacterial Effect of Total Polyphenols from Anise on Plant Pathogenic Fungi

ZHU Qi-qi, ZHANG Jie, XIE Ping, YU Bo, ZHANG Chi-xiang, JIAO Shi-rong*

(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

The antibacterial activity of polyphenols from anise on five kinds of plant pathogenic fungi such asFusariumgraminearumSchw,Rhizoctoniasolani, Potato late blight,Botrytiscinerea,Sclerotiniasclerotiorumis detected with growth rate method. The results show that the inhibition rate of polyphenols from anise onFusariumgraminearumSchw,Rhizoctoniasolani,Botrytiscinerea, Potato late blight,Sclerotiniasclerotiorumis 42.19%, 98.50%, 90.19%, 56.87%, 95.01% respectively. The stability experiment is carried out for three kinds of pathogenic fungi with the inhibition rate above 90%, and the EC50is 2.164, 5.256, 2.295 mg/L respectively.

polyphenols extracts of anise; plant pathogenic fungi; inhibitory effect

2016-11-16 *通訊作者

2014年度省部級(jí)學(xué)科平臺(tái)開放課題(szjj2014-009)；教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(12205543)；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助(ycjj2015025)

朱奇奇(1990-)，男，山東荷澤人，碩士，研究方向：食品科學(xué)；焦士蓉(1968-)，女，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.002

1000-9973(2017)05-0005-04