AAPBA@KCC-1的合成及其對血清中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的分析應(yīng)用

田華君, 薛 蕓, 陳巧梅, 王 彥, 閻 超

(上海交通大學藥學院, 上海 200240)

研究論文

AAPBA@KCC-1的合成及其對血清中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的分析應(yīng)用

田華君, 薛 蕓, 陳巧梅, 王 彥*, 閻 超*

(上海交通大學藥學院, 上海 200240)

將3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)修飾在介孔二氧化硅KCC-1的表面,合成AAPBA@KCC-1材料,并通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、N2吸附解吸附測試和X射線光電子能譜對其進行表征;將AAPBA@KCC-1材料作為分散固相萃取(dSPE)的吸附劑,對血清樣品中的唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂(GLS)進行提取和富集;采用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法和超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜法分別對AAPBA@KCC-1材料吸附得到的唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂進行分析。結(jié)果表明,AAPBA@KCC-1材料能夠有效吸附唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂,簡化了樣品前處理的操作,可以進一步應(yīng)用于生物樣品中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的研究。

分散固相萃取;介孔二氧化硅KCC-1;3-丙烯酰胺基苯硼酸;N-乙酰神經(jīng)氨酸;唾液酸;神經(jīng)節(jié)苷脂

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的無機多孔材料得以開發(fā),并因其具有較大的比表面積和特殊的骨架結(jié)構(gòu),在吸附、催化、傳感、光電磁及生物等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[1]。Polshettiwar等[2]在2010年首次提出了一種新型的放射狀介孔二氧化硅微球(KCC-1),其具有沿著中心輻射方向排列的二氧化硅纖維或褶皺,構(gòu)成了放射狀孔道,孔道的尺寸也由內(nèi)向外逐漸增大。這一特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠防止納米纖維或褶皺重疊,因此具有比表面積高、孔體積大和內(nèi)表面可接觸的優(yōu)點。研究者們對放射狀介孔二氧化硅的研究逐漸增多,提出了不同的合成方法與合成機理,并將制備的材料應(yīng)用于催化合成、生物醫(yī)學、環(huán)境等領(lǐng)域[3]。但由于KCC-1材料的本質(zhì)是二氧化硅微球,無機基質(zhì)缺乏反應(yīng)活性中心,應(yīng)用上受到一定限制,因此需要對材料進行改性。目前,介孔材料的改性方法主要有引入不同類型的有機官能團、固載金屬原子(離子)和雜原子取代無機骨架等[4]。其中引入有機官能團是最常用的改性方法,利用材料表面一定數(shù)量的硅羥基,通過嫁接法或共縮聚法進行化學改性,接枝有機官能團,拓展材料的應(yīng)用范圍。

唾液酸(sialic acid)是一類含有9個碳原子的酸性氨基糖,具有吡喃糖結(jié)構(gòu),在高等動物和微生物中已發(fā)現(xiàn)近50多種[5]。人體中最常見的唾液酸為5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(俗稱N-乙酰神經(jīng)氨酸,Neu5Ac),其含量占唾液酸家族的99%以上,目前研究的唾液酸多指Neu5Ac。研究表明,在腫瘤或細胞惡性轉(zhuǎn)化時,細胞膜合成的唾液酸增多,其脫落或分泌進入血液的量也同時增多,因此血清中唾液酸的變化在一定程度上可反應(yīng)細胞的惡變、癌癥轉(zhuǎn)移及浸潤等[6]。另外唾液酸是神經(jīng)節(jié)苷脂(gangliosides, GLS)重要的結(jié)構(gòu)組成部分,而GLS是一類神經(jīng)鞘糖脂,由親水的寡糖鏈(含唾液酸)和親脂的神經(jīng)酰胺組成,參與細胞膜組成、大腦神經(jīng)發(fā)育等活動[7]。在腫瘤的形成過程中,腫瘤細胞表面原有GLS的種類和含量均會發(fā)生改變,所以血清神經(jīng)節(jié)苷脂也能夠作為潛在的疾病標志物在診斷治療中起到關(guān)鍵作用[8]。楊銘等[9]通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測正常人和肝癌患者血清中GLS的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者血清中GLS的含量存在顯著性差異,說明可以用于肝癌診斷的初步篩選。但是血清成分復(fù)雜,唾液酸和GLS(尤其是GLS),在血清中的含量極低,對其提取、檢測十分困難。因此發(fā)展一種高效簡單的吸附血清中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的方法十分必要。

硼酸親和富集法是利用硼酸基團與化合物結(jié)構(gòu)中順式二羥基間的結(jié)合作用進行富集,不會引入其他干擾物質(zhì)而影響后續(xù)研究[10],相較于凝集素親和、肼化學方法等,具有可操作性強、不破壞糖基結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢[11]。劉麗婷等[12]采用硼酸功能化的介孔納米材料,在非糖肽的干擾下選擇性地吸附糖肽,為生物體內(nèi)的糖肽研究奠定基礎(chǔ)。苯硼酸與唾液酸結(jié)構(gòu)中順式二羥基有特異性親和作用,具有吸附唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的可能性。Zhang等[13]將生物素化的苯硼酸修飾在金納米粒子表面,使其特異性識別癌細胞表面的唾液酸,用于癌細胞的檢測。但目前尚未檢索到利用苯硼酸吸附和提取血液中神經(jīng)節(jié)苷脂的研究。

本文將3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)修飾在KCC-1表面,合成具有硼親和特性的AAPBA@KCC-1材料,并通過掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、N2吸附解吸附、X射線光電子能譜(XPS)等測試手段對AAPBA@KCC-1材料的形貌、比表面積、孔徑、表面元素等進行考察。將AAPBA@KCC-1材料作為分散固相萃取(dSPE)的吸附劑用于人血清樣品的前處理,并采用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-MS)檢測血清中的Neu5Ac;采用超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-IMS-QTOF MS)檢測血清中的GLS。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-10ADvp高效液相色譜儀(日本島津公司); 7.0 T SolariX傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀,配有Bruker Compass DataAnalysis 4.2SR1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(德國Bruker Daltonics公司); ACQUITYⅠClass超高效液相色譜-離子淌度-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司); S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社); ASAP2020 C+M比表面積孔隙度及化學吸附分析儀(美國麥克儀器公司); AXIS UltraDLD多功能X射線光電能譜儀(日本島津Kratos公司); DM36-12馬弗爐(上海德恭實業(yè)有限公司); LSP01-2A單通道注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司); THZ 82氣溶恒溫振蕩器(上海喬楓實業(yè)有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

Neu5Ac標準品(純度98%)、溴代十六烷基吡啶(CPB)購自上海阿拉丁有限公司;無水乙醇、環(huán)己烷、尿素、氨水、正硅酸四乙酯(TEOS)、γ-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(KH-560)、鹽酸、甲酸、乙酸、氫氧化鈉、丙酮、無水乙醚、甲苯(用前除水)均購自國藥集團化學試劑公司;聚乙烯亞胺(PEI600,純度99%)、丙烯酰氯(純度96%,含0.02%(質(zhì)量分數(shù))氫醌甲基醚)購自上海晶純生化科技股份有限公司;間氨基苯硼酸一水合物購自北京中勝華騰科技有限公司;乙腈、甲醇、異丙醇(質(zhì)譜純)購自德國Merck公司;人血清樣品(批號H04Q00F, AB型)購自加拿大Gemini公司。

精密稱取10 mg Neu5Ac標準品,用少量超純水溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Neu5Ac標準儲備液,于4 ℃冰箱中保存,備用。

圖 1 AAPBA@KCC-1材料的合成示意圖Fig. 1 Synthesis schematic of the AAPBA@KCC-1KCC-1: mesoporous silica; KH-560: γ-(2,3-epoxypropoxy)propyltrimethoxysilane; PEI600: polyethyleneimine; AAPBA: 3-acrylamidophenylboronic acid; AAPBA@KCC-1: AAPBA functionalized KCC-1.

1.2 KCC-1微球的制備

根據(jù)文獻[14]提供的微乳液法合成KCC-1。稱取1.1 g CPB、0.6 g尿素,置于250 mL圓底燒瓶中,加入30 mL水,超聲5 min后,加入30 mL環(huán)己烷、0.94 mL異丙醇,超聲混勻。在磁力攪拌的條件下,使用注射泵逐滴滴加3 mL TEOS。將反應(yīng)混合物于70 ℃磁力攪拌回流20 h。反應(yīng)結(jié)束后,依次用50 mL丙酮、水、無水乙醇以7 000 r/min離心10 min,將得到的微球于60 ℃烘箱中干燥12 h后,于500 ℃馬弗爐中煅燒3 h,除去表面活性劑,最終得到KCC-1微球。

稱取煅燒好的KCC-1微球1 g,置于250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL 1 mol/L鹽酸溶液,超聲分散2 min,于80 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,加入大量超純水抽濾洗滌至中性,最后用無水乙醇抽濾洗滌,所得固體于60 ℃真空干燥12 h,備用。

1.3 AAPBA@KCC-1的制備

第一步:稱取1 g干燥后的經(jīng)鹽酸活化的KCC-1微球,置于250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL無水甲苯,超聲分散2 min后,置于油浴鍋中,在磁力攪拌的條件下逐滴加入3 mL KH-560,于115 ℃氮氣保護下加熱回流24 h,隨后冷卻至室溫,依次用50 mL甲苯、丙酮、無水乙醚抽濾洗滌,得到的固體于60 ℃烘箱中干燥,備用。

第二步:取上述得到的固體1 g置于250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL無水乙醇,超聲分散2 min;另取0.4 g PEI600置于另一250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL超純水,超聲分散2 min。將上述兩種溶液混勻后置于油浴鍋中,于65 ℃磁力攪拌、氮氣保護下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,依次用50 mL超純水、無水乙醇、無水乙醚抽濾洗滌,得到的固體于60 ℃烘箱中干燥,備用。

第三步:取上述得到的固體1 g置于250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL超純水,超聲分散2 min;另取0.3 g制備好的AAPBA[15],置于另一250 mL圓底燒瓶中,加入40 mL甲醇,超聲分散2 min。將上述兩種溶液混勻后置于油浴鍋中,于65 ℃磁力攪拌、氮氣保護下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,依次用50 mL超純水、甲醇、無水乙醚抽濾洗滌,得到的固體即為AAPBA@KCC-1(具體合成過程見圖1),于60 ℃烘箱中干燥,備用。

1.4 分散固相萃取

稱取20 mg AAPBA@KCC-1材料,加入1 mL超純水,以7 000 r/min離心10 min。取100 μL Neu5Ac標準品或血清樣品,用緩沖溶液(pH 7.0)稀釋至一定濃度。取1 mL上述溶液加入清洗過的AAPBA@KCC-1材料,渦旋混勻,振蕩10 min,以8 000 r/min離心10 min,所得上清液記為上樣液(loading solution);用1 mL緩沖溶液(pH 7.0)清洗材料,以8 000 r/min離心10 min,所得上清液記為清洗液(washing solution);取1 mL緩沖溶液(pH 11.0)-乙腈溶液(80∶20, v/v)對AAPBA@KCC-1材料上吸附的物質(zhì)進行洗脫,振蕩混勻10 min,以8 000 r/min離心10 min,所得上清液記為洗脫液(elution)。將得到的3份上清液用N2吹干后,用流動相復(fù)溶,并通過0.22 μm濾膜過濾,備用。

本文所用緩沖溶液均由乙酸和氨水配制而成。

1.5 唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的提取

唾液酸的提取:取200 μL血清樣品,加入200 μL 1 mol/L的鹽酸溶液,振蕩混勻,于80 ℃烘箱中靜置1 h后,加入200 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì),以12 000 r/min離心15 min,移取上清液,用氮氣吹干。用緩沖溶液(pH 7.0)復(fù)溶血清樣品,按1.4節(jié)dSPE條件進行處理,得到洗脫溶液,用氮氣吹干,然后用200 μL甲醇復(fù)溶,于4 ℃冰箱保存。

神經(jīng)節(jié)苷脂的提取:取500 μL血清,加入1 mL甲醇,振蕩混勻,靜置30 min后,以12 000 r/min離心15 min,移取上清液,用氮氣吹干。用緩沖溶液(pH 7.0,含20%(v/v)甲醇)復(fù)溶血清樣品,按1.4節(jié)dSPE條件進行處理,得到洗脫溶液,用氮氣吹干,然后用200 μL甲醇復(fù)溶,于4 ℃冰箱保存。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 Neu5Ac的分析條件

色譜柱:TSKgel Amide-80親水色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm);流動相:0.05%(v/v)磷酸水溶液-乙腈(30∶70, v/v);等度洗脫;流速:0.5 mL/min;檢測波長:195 nm;進樣量:10 μL。離子源:電噴霧離子(ESI)源;正離子模式;毛細管噴霧電壓:5 500 V;干燥氣溫度:200 ℃;干燥氣流速:4.0 L/min;進樣速度:120 μL/min;離子選擇模式:吹掃(sweep);掃描范圍:m/z150～750。

1.6.2 神經(jīng)節(jié)苷脂的分析條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:55 ℃;進樣量:10 μL;流速:0.40 mL/min;流動相A:含10 mmol/L甲酸銨的乙腈-水(40∶60, v/v),流動相B:含10 mmol/L甲酸銨的異丙醇。梯度洗脫程序:0～5.0 min,40%B～43%B;5.0～6.0 min, 43%B～50%B; 6.0～12.0 min, 50%B～54%B; 12.0～12.1 min, 54%B～70%B; 12.1～18.0 min, 70%B～100%B; 18.0～19.1min, 100%B～40%B; 19.1～21.0 min, 40%B。離子源:ESI源;正離子掃描;離子源溫度:115 ℃;毛細管電壓:2 000 V;錐孔電壓:40 V;脫溶劑氣體溫度:550 ℃;脫溶劑氣流量:900 L/h;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣體、錐形氣體:氮氣(純度>99.5%);掃描范圍:m/z50～2 000;掃描頻率:0.2 s/scan;采用高(30～50 eV)、低(6.0 eV)碰撞能交替切換的MSE模式采集數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)采用UNIFI軟件和Progenesis QI軟件進行色譜峰識別和匹配,根據(jù)精確相對分子質(zhì)量,結(jié)合人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)進行檢索,并對所得離子進行鑒定表征(質(zhì)量誤差小于5×10-6(5 ppm))。

2 結(jié)果與討論

2.1 AAPBA@KCC-1的表征

通過微乳液法[14]合成KCC-1微球,水和環(huán)己烷分別作為水相和油相形成微乳液環(huán)境,異丙醇作為助溶劑、表面活性劑CPB作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑、尿素作為催化劑提供堿性環(huán)境、TEOS作為硅源分散在表面活性劑周圍發(fā)生水解、縮合、聚合反應(yīng),最后煅燒除去表面活性劑,即可得到中心徑向結(jié)構(gòu)的KCC-1微球,具有放射狀孔道分布。

用AAPBA基團修飾KCC-1基質(zhì),首先需要用鹽酸活化KCC-1基質(zhì),鹽酸活化可以增加表面羥基密度,更利于后續(xù)修飾[16]。然后利用KH-560的水解反應(yīng),在KCC-1微球表面修飾環(huán)氧丙基;利用環(huán)氧丙基與PEI600分子中的氨基發(fā)生開環(huán)反應(yīng),使相對分子質(zhì)量較高的PEI600分子以共價鍵修飾到微球表面,以提高其氨基覆蓋率,增加反應(yīng)活性位點。最后通過氨基與α,β-不飽和雙鍵之間的邁克爾(Michael)加成反應(yīng),將AAPBA修飾到KCC-1微球上,最終得到AAPBA@KCC-1材料。這一修飾方法機理簡單,操作方便。

KCC-1和AAPBA@KCC-1的掃描電鏡圖和透射電鏡圖見圖2?？梢钥闯?AAPBA@KCC-1與KCC-1的形貌沒有明顯差異?？赡苁且驗樾揎椀谋脚鹚峄鶊F相對分子質(zhì)量較小,對于KCC-1微球的結(jié)構(gòu)沒有顯著性影響。實驗測得AAPBA@KCC-1微球的粒徑約為400 nm。

圖 2 KCC-1和AAPBA@KCC-1的掃描電鏡圖和透射電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM) images of the KCC-1 and AAPBA@KCC-1a. SEM image of KCC-1; b. TEM image of KCC-1; c. SEM image of AAPBA@KCC-1; d. TEM image of AAPBA@KCC-1.

圖 3 AAPBA@KCC-1的(a)N2吸附解吸附曲線和(b)孔徑分布圖Fig. 3 (a) N2 adsorption-desorption isotherm plot and (b) pore size distribution curve of the AAPBA@KCC-1

AAPBA@KCC-1的N2吸附解吸附曲線和孔徑分布圖見圖3?？梢钥闯?AAPBA@KCC-1的N2吸附解吸附曲線屬于IV型吸附平衡等溫線,說明AAPBA@KCC-1仍是介孔材料,且表現(xiàn)為H3型遲滯回線,推測具有狹縫狀孔道,孔大小不均勻。由孔徑分布圖可以看出,AAPBA@KCC-1材料的孔徑集中分布在3～4 nm,但在10～20 nm處也有少量分布,這可能是KCC-1材料在合成過程中,放射狀纖維或褶皺結(jié)構(gòu)排列不均勻造成的。實驗最終測得AAPBA@KCC-1材料的比表面積、孔徑和總孔容積分別為453.15 m2/g、3.41 nm和0.81 cm3/g,與KCC-1相比(實驗前期測得其比表面積、孔徑和總孔容積分別為483.26 m2/g、3.37 nm和0.89 cm3/g)沒有顯著性差異。說明AAPBA的修飾沒有對KCC-1基質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成較大影響。

為進一步表征AAPBA@KCC-1材料表面苯硼酸基團的修飾程度,本文應(yīng)用X射線光電子能譜測試了KCC-1和AAPBA@KCC-1微球表面各元素含量的變化(見表1)?？梢钥闯?AAPBA@KCC-1材料含有B和N元素,這是由修飾PEI600和AAPBA時引入的,表明AAPBA基團已成功鍵合在KCC-1基質(zhì)表面。在合成KCC-1時,使用了CPB表面活性劑,而之后的處理中沒有完全去除,造成在KCC-1中檢測到C元素的存在。

表 1 XPS測試KCC-1和AAPBA@KCC-1材料表面

2.2 分散固相萃取條件的優(yōu)化

為考察AAPBA@KCC-1材料對唾液酸的吸附能力,本文采用分散固相萃取的方式對Neu5Ac標準品進行吸附和洗脫,吸附得到的Neu5Ac的含量采用親水色譜法測定,其色譜圖見圖4。

圖 4 Neu5Ac標準品的親水色譜圖Fig. 4 Hydrophilic chromatogram of the Neu5Ac standard sampleNeu5Ac: N-acetylneuraminic acid.

圖 5 不同分散固相萃取條件對Neu5Ac吸附率和回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effect of the different dispersive solid phase extraction conditions on the adsorption rates and recoveries of the Neu5Ac (n=3)Buffer: acetic acid-ammonia mixture (pH 11.0); MeOH: methanol; ACN: acetonitrile.

2.2.1 上樣條件的優(yōu)化

本實驗通過采用不同pH值(2.5、5.0、7.0、9.0、11.0)的上樣緩沖溶液考察AAPBA@KCC-1對Neu5Ac標準品吸附量的影響(見圖5a)?？梢钥闯?當上樣液的pH值為7.0時,AAPBA@KCC-1材料對Neu5Ac的吸附能力最強。分散固相萃取中,材料與樣品溶液需充分接觸,本實驗采用振蕩方式使二者混勻,吸附時間的長短影響材料對Neu5Ac的吸附量。實驗結(jié)果表明,當吸附時間為10 min時,AAPBA@KCC-1對Neu5Ac標準品的吸附率最高。

2.2.2 洗脫條件的優(yōu)化

pH條件的改變會影響唾液酸與苯硼酸基團的結(jié)合作用,為使結(jié)合狀態(tài)的唾液酸更多地從材料上洗脫下來,洗脫液pH值的選擇至關(guān)重要。本實驗考察了不同pH值(4.0、9.0和11.0)的洗脫液對Neu5Ac回收率的影響(見圖5b)。可以看出,當洗脫液的pH值為11.0時,Neu5Ac的回收率最高。

本實驗比較了不同洗脫時間(5、10、15、30和60 min)對Neu5Ac回收率的影響(見圖5c)。結(jié)果表明,洗脫時間過長,Neu5Ac的回收率反而下降,當洗脫時間為10 min時,Neu5Ac的回收率最高。

分散固相萃取的過程類似于色譜分離[17],所以加入適當?shù)挠袡C溶劑可以提高洗脫溶劑的洗脫能力,實驗比較了在緩沖溶液(pH 11.0)中加入20%(v/v)甲醇、20%(v/v)乙腈和不加有機溶劑的情況下,Neu5Ac回收率的變化(見圖5d)。結(jié)果表明,在緩沖溶液(pH 11.0)中加入20%(v/v)乙腈作為洗脫液時,Neu5Ac的回收率最高。

2.2.3 苯硼酸與唾液酸的相互作用

通常來說,苯硼酸基團與順式二羥基化合物的相互作用隨苯硼酸基團pKa(≈8.6)與緩沖溶液pH的大小關(guān)系而改變[18]。當pH>pKa時,硼酸基團轉(zhuǎn)變成帶負電的四面體結(jié)構(gòu),能夠與順式二羥基化合物反應(yīng)形成五元環(huán)酯,順式二羥基化合物結(jié)合到苯硼酸材料的表面;當pH

本研究中AAPBA與Neu5Ac的結(jié)合在中性(pH 7.0)條件下進行,解離在堿性(pH 11.0)條件下進行。這是因為Neu5Ac結(jié)構(gòu)中具有酰胺基團和較多的羥基基團,使得二者的結(jié)合不同于普通的順式二羥基化合物。Djanashvili等[19]利用多核核磁共振研究苯硼酸與唾液酸的結(jié)合作用,發(fā)現(xiàn)唾液酸在pH> 8.0時，通過甘油側(cè)鏈與苯硼酸結(jié)合(見圖6);在pH為2.0～8.0時,通過羥基羧酸結(jié)合苯硼酸,且在pH 7.4時形成的苯硼酸酯穩(wěn)定常數(shù)最高。這與本文中得到的結(jié)果一致,中性條件下AAPBA@KCC-1材料的吸附能力最強,吸附率高達96%。

圖 6 苯硼酸與Neu5Ac的相互作用示意圖Fig. 6 Schematic of the interaction between the phenylboronic acid and Neu5Ac

2.3 血清中唾液酸的分析

在人體中,游離唾液酸的含量較少,多以結(jié)合形式出現(xiàn)在糖蛋白、糖肽、糖脂等結(jié)構(gòu)中。因此如果要研究唾液酸,首先要釋放唾液酸,最常用的方法為酸水解法[20]。酸水解法是指在加熱的條件下,用稀釋的酸溶液釋放唾液酸,反應(yīng)時間通常為1～2 h。本文選用1 mol/L鹽酸溶液于80 ℃烘箱中靜置1 h來水解血清中的唾液酸,然后用甲醇除去血清中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),再用于后續(xù)的分散固相萃取。

FT-MS具有分辨力高、準確度高、掃描速度快等優(yōu)點,能夠?qū)衔镞M行結(jié)構(gòu)鑒定,十分適合生物樣品的分離分析。由于血清中基質(zhì)較多,本研究中直接采用FT-MS驗證AAPBA@KCC-1材料對血清中唾液酸的吸附能力。首先分析Neu5Ac標準品,測得Neu5Ac的準分子離子峰[M+H]+的m/z為310.113 15(理論值為310.113 26),這說明FT-MS分析具有較高的準確性。

血清樣品在分散固相萃取處理前后的全掃描質(zhì)譜圖和選擇離子提取質(zhì)譜圖見圖7。分散固相萃取處理前,有較多m/z為200～500的干擾物質(zhì)存在(見圖7a)。經(jīng)過選擇離子提取,可以明確找到Neu5Ac的存在(見圖7b),這表明酸水解法能夠從血清中提取唾液酸。經(jīng)dSPE處理后,血清樣品的全掃描質(zhì)譜圖的背景基質(zhì)干擾較少(見圖7c),經(jīng)選擇離子提取后,m/z308.5～312.0范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰減少,Neu5Ac的質(zhì)譜峰(m/z310.113 09)更加明顯(見圖7d),說明本實驗合成的AAPBA@KCC-1材料對血清中的唾液酸具有較好的選擇提取能力。

2.4 血清中神經(jīng)節(jié)苷脂的分析

對于生物組織中神經(jīng)節(jié)苷脂的提取純化,傳統(tǒng)的方法是利用不同比例的氯仿、甲醇、水進行提取[21],但操作步驟繁瑣,且氯仿具有一定的毒性和腐蝕性。神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,由寡糖鏈(包含唾液酸)和神經(jīng)酰胺兩部分組成。AAPBA@KCC-1材料對唾液酸具有吸附富集能力,而唾液酸又是神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)中的一個重要組成部分,可以嘗試將提取和分離唾液酸的方法應(yīng)用于血清中的神經(jīng)節(jié)苷脂。

血清樣品經(jīng)甲醇去除蛋白質(zhì)處理后,直接進行分散固相萃取,與傳統(tǒng)的提取方法相比,操作更簡單。但考慮到血清中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量較少[22],本實驗選擇UPLC-IMS-QTOF MS技術(shù)減少檢測物的共流出現(xiàn)象,使實驗結(jié)果更加準確可靠。

圖 7 血清樣品全掃描和選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig. 7 Full scan mass spectra and SIM mass spectra of the serum samplesa. full scan mass spectrum of serum without adsorption; b. SIM mass spectrum of serum without adsorption; c. full scan mass spectrum of serum adsorbed by AAPBA@KCC-1; d. SIM mass spectrum of serum adsorbed by AAPBA@KCC-1.

圖 8 血清樣品中GLS經(jīng)AAPBA@KCC-1材料(a)吸附前和(b)吸附后的總離子流色譜圖Fig. 8 Total ion current chromatograms of ganglioside (GLS) in a serum sample (a) before and (b) after adsorption by the AAPBA@KCC-1

血清樣品中神經(jīng)節(jié)苷脂經(jīng)AAPBA@KCC-1材料吸附前后的總離子流色譜圖見圖8?？梢钥闯?經(jīng)AAPBA@KCC-1材料吸附后,血清樣品中GLS的色譜峰形更尖銳、對稱。

利用數(shù)據(jù)庫對所得物質(zhì)進行鑒定,在洗脫液中發(fā)現(xiàn)了一種單唾液酸二己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(NeuAc-α-2-3-Gal-β-1-4-Glc-β-Cer (d 18∶1/16∶0)),[M+H]+為m/z1 153.71 869,質(zhì)量誤差為1.66 ppm(<5 ppm)。GM3的結(jié)構(gòu)式、提取離子色譜圖和質(zhì)譜圖見圖9。通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),血清中已確定的GLS僅有3種且含量較低,在洗脫液中能夠找到一種神經(jīng)節(jié)苷脂,證明AAPBA@KCC-1材料對其有吸附性能。在接下來的實驗中,可將AAPBA@KCC-1材料用于含神經(jīng)節(jié)苷脂豐富的生物組織樣品的分離,發(fā)揮其吸附提取性能。

圖 9 GM3的(a)結(jié)構(gòu)式、(b)提取離子色譜圖和(c)一級、(d)二級質(zhì)譜圖Fig. 9 (a) Structure, (b) extracted ion chromatogram (EIC), (c) MS spectrum and (d) MS/MS spectrum of the GM3

3 結(jié)論

本文通過將AAPBA鍵合在KCC-1表面,成功制備了功能化修飾介孔二氧化硅AAPBA@KCC-1材料,并將AAPBA@KCC-1材料作為分散固相萃取的吸附劑用于血清中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的提取和富集。結(jié)果表明,AAPBA@KCC-1材料能夠有效吸附血清中的唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂,從而簡化生物樣品的前處理步驟,節(jié)省處理時間,為生物樣品中唾液酸及神經(jīng)節(jié)苷脂的研究提供新方案。

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Synthesis of AAPBA@KCC-1 and its application in the analysis of sialic acid and gangliosides in serum

TIAN Huajun, XUE Yun, CHEN Qiaomei, WANG Yan*, YAN Chao*

(SchoolofPharmacy,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

A new material AAPBA@KCC-1 was synthesized by using 3-acrylamidophenylboronic acid (AAPBA) modified on mesoporous silica KCC-1. First, AAPBA was modified on the surface of KCC-1 by three-step synthesis method. Then, AAPBA@KCC-1 was characterized by scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM), N2adsorption-desorption isotherm and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). AAPBA@KCC-1 was used as the dispersive solid-phase extraction (dSPE) adsorbent to extract and enrich sialic acid and ganglioside (GLS) from serum samples. Finally, Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FT-MS) and ultra performance liquid chromatography-ion mobility spectrometry-quadrupole time of flight mass spectrometry (UPLC-IMS-QTOF MS) were used to evaluated the adsorption ability of AAPBA@KCC-1 to sialic acid and GLS, respectively. The results showed that AAPBA@KCC-1 can effectively adsorb sialic acid and GLS, and can be used for further studies of sialic acid and GLS in biological samples.

dispersive solid-phase extraction (dSPE); mesoporous silica KCC-1; 3-acrylamidophenylboronic acid (AAPBA);N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac); sialic acid; ganglioside (GLS)

10.3724/SP.J.1123.2017.01025

2017-01-20

上海市科委科研計劃項目(15142200200,16142200300);中國博士后科學基金(2015M581628);上海市引進技術(shù)的吸收與創(chuàng)新專項(XC-ZXSJ-02-2016-11).

Foundation item: Shanghai Science and Technology Commission Scientific Research Project (Nos. 15142200200, 16142200300); China Postdoctoral Science Fund (No. 2015M581628); Special Fund of Shanghai Introduction of Technology Adsorption and Innovation (No. XC-ZXSJ-02-2016-11).

O658

A

1000-8713(2017)05-0473-09

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:wangyan11@sjtu.edu.cn(王彥); chaoyan@sjtu.edu.cn(閻超).