高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中20種全氟烷基化合物

李 帥, 陳 輝, 金鈴和, 彭 濤, 范春林*, 王明林*

(1. 山東農業(yè)大學食品科學與工程學院, 山東 泰安 271018; 2. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176)

研究論文

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中20種全氟烷基化合物

李 帥1, 陳 輝2, 金鈴和2, 彭 濤2, 范春林2*, 王明林1*

(1. 山東農業(yè)大學食品科學與工程學院, 山東 泰安 271018; 2. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)同時測定蜂蜜中20種全氟烷基化合物(PFASs)含量的分析方法。采用改進的QuEChERS方法對樣品進行前處理,用含1.5%(v/v)甲酸的乙腈溶液振蕩提取,C18和N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑凈化,Atlantis T3 C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm)分離,以含5 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液和5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫。在電噴霧離子(ESI)源負離子模式下以多反應監(jiān)測(MRM)掃描,采用同位素內標法進行定量分析。結果表明,20種PFASs在16 min內即可完成分離,在0.2～10 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r)均大于0.99;檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別為0.04～0.10 μg/kg和0.10～0.20 μg/kg。在0.1、0.5、1.0和2.0 μg/kg加標水平下,20種PFASs的加標回收率為72.6%～113.0%,RSD為0.4%～15.9%(n=6)。該法快速、高效、準確,適用于蜂蜜樣品中20種PFASs的同時檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質譜;QuEChERS方法;全氟烷基化合物;蜂蜜

全氟烷基化合物(perfluorinated alkyl substances, PFASs)是一類人工合成的新型持久性有機污染物,由不同長度的疏水烷基碳鏈和親水基末端組成,其疏水烷基碳鏈上的氫原子全部被氟原子(F)替代,形成含有極高化學能的C-F鍵[1],具有化學惰性、耐熱性等優(yōu)良性能。PFASs被廣泛用作表面活性劑、催化劑、潤滑劑、殺蟲劑以及合成藥物、氟橡膠、樹脂的中間體[2]。但是PFASs難以新陳代謝、水解、光解和生物降解,在生物體內隨著時間的推移不斷富集[3]。大量研究表明,全氟辛酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)具有神經毒性[4]、肝臟毒性[5]、心血管毒性[6]等生物毒性。目前,國內外學者相繼在水產品[7]、動物肝臟[8,9]、雞蛋[10]、牛奶[11]、母乳[12]及口服液[13]中檢測到PFASs,而對于蜂蜜中PFASs的檢測卻鮮有報道。

蜂蜜是一種附加值較高的營養(yǎng)品,同時又具有一定的藥用功效。近年來,國內和國際市場對蜂蜜的需求量不斷擴大,對其質量要求也不斷提高[14]。從食品安全角度考慮,蜂蜜中不應含有任何化學污染物[15]。因此,對于蜂蜜中PFASs的污染情況進行研究具有重要意義。

目前,國內外對食品中PFASs的前處理方法主要有堿消解法[16]、液液萃取法[17]、固相萃取法[18]等,這些方法步驟繁瑣、耗時長、重現(xiàn)性差[19]。而QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)方法快速簡便、成本低廉、易于操作,已被廣泛應用于化學污染物殘留量的檢測[20]。因此,本研究建立了改進的QuEChERS結合HPLC-MS/MS同時測定蜂蜜中20種PFASs的分析方法。本方法快速簡便、重復性好、準確可靠,可以為我國制定蜂蜜中PFASs相關限量標準提供重要依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6460三重四極桿質譜儀(美國Agilent公司); Stuart SA8渦旋振蕩混勻器(英國Bibby-Stuart公司); SR-2DS水平振蕩器(日本TATEC公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); N-EVAP 112氮吹儀(美國Organomation Associates公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

全氟丁酸(PFBA)、全氟戊酸(PFPeA)、全氟丁烷磺酸(PFBS)、全氟己酸(PFHxA)、全氟戊烷磺酸鈉(PFPeS)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚烷磺酸鈉(PFHpS)、PFOA、PFOS、全氟壬酸(PFNA)、全氟壬烷磺酸鈉(PFNS)、全氟癸酸(PFDA)、全氟癸烷磺酸鈉(PFDS)、全氟十一烷酸(PFUdA)、全氟十二烷酸(PFDoA)、全氟十三烷酸(PFTrDA)、全氟十四烷酸(PFTeDA)、全氟十六烷酸(PFHxDA)、全氟十八烷酸(PFODA)標準溶液(50 mg/L)和13C4-全氟丁酸(MPFBA)、13C2-全氟己酸(MPFHxA)、18O2-全氟己烷磺酸鈉(MPFHxS)、13C4-全氟辛酸(MPFOA)、13C4-全氟辛烷磺酸鈉(MPFOS)、13C5-全氟壬酸(MPFNA)、13C2-全氟癸酸(MPFDA)、13C2-全氟十一烷酸(MPFUdA)、13C2-全氟十二烷酸(MPFDoA)混合內標標準溶液(2 mg/L)均購自加拿大Wellington公司;甲醇、乙腈(HPLC級)購自美國Honeywell公司;C18填料(50 μm)、N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm)均購自天津博納艾杰爾公司;無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)均購自北京化工廠。實驗用水均為由Milli-Q系統(tǒng)提供的電阻率為18.2 MΩ5cm的超純水,實驗過程避免使用聚四氟乙烯材質的器皿和色譜管路。

1.2 標準溶液的配制

準確量取20種PFASs標準溶液(50 mg/L)各200 μL,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制質量濃度為1 mg/L的混合標準儲備液,于-18 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

稱取5.0 g蜂蜜樣品于50 mL聚丙烯離心管中,依次加入5 μL 2 mg/L混合內標標準溶液、5 mL水和10 mL含1.5%(v/v)甲酸的乙腈溶液,渦旋1 min后,加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂,振搖10 min后,以10 000 r/min離心10 min。移取7 mL乙腈層至裝有40 mg PSA吸附劑、80 mg C18和900 mg無水硫酸鎂的15 mL離心管中,振搖10 min后,以10 000 r/min離心10 min,然后移取4 mL上清液(相當于2.0 g提取液)于玻璃氮吹管中,于40 ℃氮吹至干,用1 mL甲醇定容后,過0.22 μm濾膜,待HPLC-MS/MS分析。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜柱：Atlantis T3 C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:38 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:10 μL;流動相:A為含5 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液,B為5 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫程序:0～3 min, 10%A～30%A; 3～13 min, 30%A～100%A; 13～14 min, 100%A～10%A; 14～20 min, 10%A。

離子源:電噴霧離子(ESI)源;負離子模式;離子源溫度:325 ℃;掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:-4.0 kV;去溶劑氣流:10 L/min(氮氣);去溶劑溫度:250 ℃;錐孔氣流:8 L/min(氮氣);碰撞氣壓:0.4 MPa(氮氣)。20種PFASs及9種同位素內標的保留時間(tR)、母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量(CE)見表1。

表 1 20種PFASs及9種同位素內標的保留時間、母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量

*Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

PFASs是一類同時具有疏水和疏油性質的化合物,并具有一定的表面活性和極性,采用較低羥基活性的C18反相柱可以實現(xiàn)這類化合物的分離[21]。PFASs是羧酸或磺酸類物質,在流動相中加入適量的乙酸銨能使流動相保持一定的pH值并提高目標物的離子化效率[19]。研究表明,不同濃度的乙酸銨對PFASs的分離未有明顯影響,但是較高濃度的乙酸銨對質譜檢測有較強的抑制作用[22]。根據(jù)相關文獻[8,19],本實驗采用Atlantis T3 C18色譜柱,以含5 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相,進行梯度洗脫(具體條件見1.4節(jié)), 20種PFASs在16 min內即可完成分離(見圖1)。由于全氟磺酸類化合物和比其多一個碳鏈的全氟羧酸類化合物的結構相似,導致其保留時間接近,因此色譜圖上只出現(xiàn)14個色譜峰,有6種全氟磺酸類化合物與全氟羧酸類化合物的色譜峰重疊。

圖 1 20種PFASs的選擇離子色譜圖Fig. 1 Selected ion chromatogram of the 20 PFASs1. PFBA; 2. PFPeA; 3. PFBS; 4. PFHxA and PFPeS; 5. PFHpA and PFHxS; 6. PFHpS and PFOA; 7. PFOS and PFNA; 8. PFNS and PFDA; 9. PFDS and PFUdA; 10. PFDoA; 11. PFTrDA; 12. PFTeDA; 13. PFHxDA; 14. PFODA.

2.2 質譜條件的優(yōu)化

圖 2 PFHxDA標準溶液(10 μg/L)的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the PFHxDA standard solution (10 μg/L)

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的考察

PFASs屬于酸性化合物,在酸性環(huán)境下呈分子狀態(tài),采用酸化有機溶劑有利于目標化合物的提取。研究表明,乙腈的提取效率大于丙酮、甲醇和乙酸乙酯[23],因此本實驗考察了含不同體積分數(shù)(0.5%、1.5%、2.5%和3.5%)甲酸的乙腈溶液對加標蜂蜜樣品(1 μg/kg)中20種PFASs提取效率的影響(見圖3)?？梢钥闯?采用含1.5%(v/v)甲酸的乙腈溶液時,整體提取效率較高,目標物的平均回收率為87.7%～110.6%。因此,本實驗選擇含1.5%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為提取溶液。

圖 3 含不同體積分數(shù)甲酸的乙腈溶液對蜂蜜中20種PFASs回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of the different volume fractions of formic acid in acetonitrile on the recoveries of the 20 PFASs in honey samples (n=3)

2.3.2 凈化條件的考察

QuEChERS樣品凈化方法相比于目前常用的固相萃取法具有快速、操作簡便、樣品損失量小和回收率高的特點[24]。PSA常用于保留極性有機酸、碳水化合物、脂肪酸等共提物;石墨化炭黑(GCB)可以吸附甾醇和色素;C18用于去除脂類等非極性的干擾物質。因此,根據(jù)蜂蜜基質富含碳水化合物、有機酸、色素的特點,選擇以上3種吸附劑,并對吸附劑的組合方式和用量進行評價。

表 2 20種PFASs的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

在1 μg/kg的添加水平下,分別考察不同吸附劑組合方式(PSA、PSA+C18、GCB、GCB+C18、C18)對PFASs回收率的影響(見圖4)。結果表明,采用PSA+C18時,20種PFASs的平均回收率為71.1%～112.1%,凈化效果優(yōu)于其他4種情況。而吸附劑的用量直接影響前處理的凈化效果和目標物的回收率,因此對PSA+C18的用量進行進一步優(yōu)化。分別考察不同吸附劑用量(20 mg C18+40 mg PSA、40 mg C18+80 mg PSA、80 mg C18+160 mg PSA、100 mg C18+200 mg PSA)對凈化效果的影響(見圖5)?？梢钥闯?不同吸附劑用量對蜂蜜中20種PFASs的回收率無明顯影響,均大于70%。C18、PSA用量分別為40 mg和80 mg時,有85%的PFASs回收率分布在90%～110%之間,因此確定C18和PSA用量分別為40 mg和80 mg。

圖 4 不同吸附劑組合對蜂蜜樣品中20種PFASs回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of the different combinations of adsorbents on the recoveries of the 20 PFASs in honey samples (n=3) 1. 120 mg N-propylethylenediamine (PSA); 2. 60 mg PSA+60 mg C18; 3. 120 mg graphitized carbon black (GCB); 4. 60 mg GCB+60 mg C18; 5. 120 mg C18.

圖 5 不同吸附劑用量對蜂蜜樣品中20種PFASs回收率的影響Fig. 5 Effect of the different amounts of adsorbent on the recoveries of the 20 PFASs in honey samples

2.4 線性關系和檢出限

采用基質曲線-內標法定量,用蜂蜜基質溶液配制質量濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0和10.0 μg/L的PFASs基質混合標準溶液,其中內標物的質量濃度均為4 μg/L。以PFASs和對應內標物的定量離子峰面積的比值為縱坐標(y)、各組分的質量濃度(x, μg/L)為橫坐標進行線性回歸分析。結果表明,20種PFASs在0.2～10 μg/L的范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r)均大于0.99(見表2)。在空白蜂蜜樣品中添加目標化合物,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.04～0.10 μg/kg和0.10～0.20 μg/kg。

2.5 準確度和精密度

對空白蜂蜜樣品中分別添加0.1、0.5、1.0和2.0 μg/kg的PFASs混合標準溶液進行測定,同時進行空白樣品試驗,每個水平做6個平行樣品,扣除本底值后計算加標回收率和相對標準偏差(見表3)。結果表明,20種PFASs在蜂蜜樣品中的加標回收率為72.6%～113.0%,RSD為0.4%～15.9%(n=6),本方法的準確度和精密度均滿足分析要求。

表 2 (續(xù))

y: peak area ratio of the compound to the internal standard;x: mass concentration, μg/L.

表 3 蜂蜜樣品中20種PFASs的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

圖 6 陽性蜂蜜樣品中PFOA的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of the PFOA in a positive honey sample

2.6 實際樣品分析

應用所建立的方法對市場上隨機采購的10份蜂蜜樣品中20種PFASs進行測定。結果發(fā)現(xiàn),其中9份樣品中均檢出PFOA,其含量為0.04～0.83 μg/kg,其余19種PFASs均未檢出。其中某一陽性蜂蜜樣品中PFOA的MRM色譜圖見圖6。

3 結論

本文建立了QuEChERS結合HPLC-MS/MS技術測定蜂蜜中20種PFASs的分析方法。該方法具有前處理成本低、凈化效果好、靈敏度高、穩(wěn)定性好和操作簡單的優(yōu)點,適用于蜂蜜樣品中PFASs含量的快速檢測。

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Determination of 20 perfluorinated alkyl substances in honey by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LI Shuai1, CHEN Hui2, JIN Linghe2, PENG Tao2, FAN Chunlin2*, WANG Minglin1*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100176,China)

A sensitive method for simultaneous determination of 20 perfluorinated alkyl substances (PFASs) in honey was developed by QuEChERS-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted by acetonitrile with 1.5% (v/v) formic acid, and purified by C18andN-propylethylenediamine (PSA) adsorbents. The separation of the 20 PFASs was performed on an Atlantis T3 C18column using gradient elution with methanol containing 5 mmol/L ammonium acetate and 5 mmol/L ammonium acetate as mobile phases within 16 min. The PFASs were analyzed under the multiple reaction monitoring (MRM) mode with negative electrospray ionization (ESI-). Under the optimal conditions, the isotope internal standard method was used to quantify the contents of the 20 PFASs. The calibration curves were acquired in the concentration range of 0.2-10 μg/L with correlation coefficients (r) greater than 0.99. The limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) ranged from 0.04 to 0.10 μg/kg and 0.10 to 0.20 μg/kg, respectively. The recoveries of the 20 PFASs spiked in blank honey samples were between 72.6% and 113.0% with relative standard derivations (RSDs) of 0.4%-15.9% (n=6). The developed method is rapid, efficient and accurate, and suitable for the simultaneous analysis of the 20 PFASs in honey samples.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); QuEChERS; perfluorinated alkyl substances (PFASs); honey

10.3724/SP.J.1123.2016.12016

2016-12-08

國家科技基礎性工作專項(2013FY113100).

Foundation item: National Special Technology Base Work (No. 2013FY113100).

O658

A

1000-8713(2017)05-0495-07

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:caiqfcl@163.com (范春林); mlwang@163.com (王明林).