芒果細(xì)菌性黑斑病病菌rep—PCR遺傳多樣性

漆艷香++張賀+蒲金基++張欣++謝藝賢++陸英++喻群芳++張輝強(qiáng)

摘要：采用REP、ERIC和BOX引物對(duì)22株從海南、四川、廣西芒果產(chǎn)區(qū)采集的芒果細(xì)菌性黑斑病菌菌株和1株源自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行rep-PCR分析，并根據(jù)DNA指紋特征，用 NTSYS 軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，3組引物共擴(kuò)增出463條帶，其中有302條多態(tài)性條帶，多態(tài)檢測(cè)率為65.23%。綜合分析3組引物組合的指紋圖譜數(shù)據(jù)，以相似系數(shù)0.65為閥值時(shí)，供試的23株菌株可以分為A和B 2個(gè)遺傳相似組，其中來自四川米易縣的2株菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11637聚在A組，而來自海南省、廣西省的所有菌株均聚在B組。取相似系數(shù)為087時(shí)，A組群又可分為2個(gè)亞組，而B組群則進(jìn)一步分為6個(gè)亞組。研究結(jié)果表明，芒果細(xì)菌性黑斑病菌菌株有豐富的遺傳多態(tài)性和較大的遺傳變異，但各遺傳聚類組群菌株來源廣泛，與地理來源及芒果品種均無明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：芒果細(xì)菌性黑斑病菌；遺傳多樣性；REP；ERIC；BOX

中圖分類號(hào)： S436.67+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0088-04

由野油菜黃單胞桿菌芒果致病變種（Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae，Xcm）引起的芒果細(xì)菌性黑斑病是芒果上一種常發(fā)性重要病害，該病嚴(yán)重影響芒果產(chǎn)量和果品商品價(jià)值，是芒果外銷產(chǎn)業(yè)的重要限制因子[1-2]。選育抗病品種是防治此病害最經(jīng)濟(jì)和有效的措施，而品種抗性是寄主與病原物相互作用的結(jié)果，因此，了解與掌握芒果細(xì)菌性黑斑病病原菌的群體分化，可為芒果抗病品種選育提供依據(jù)和參考。

重復(fù)序列PCR（rep-PCR）主要是基于細(xì)菌基因組中重復(fù)序列元件（REP、ERIC和BOX等）的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過PCR選擇性擴(kuò)增不同的基因組區(qū)域，揭示病原菌不同種或種下的不同菌株的遺傳變異情況[3-4]。該技術(shù)具有分辨率高、快速簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于黃單胞菌屬植物病原細(xì)菌的群體遺傳多樣性分析，如柑橘潰瘍病病菌（X. citri subsp. citri）[5-7]、水稻白葉枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）[8-9]、水稻條斑病病菌（X. oryzae pv. oryzicola）[10-11]、紅掌細(xì)菌性疫病病菌（X. axonopodis pv.dieffenbachiae）[12-13]和十字花科黑腐病病菌（X. campestris pv. campestris）[14-15]等。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于芒果細(xì)菌性黑斑病的研究多集中于檢測(cè)鑒定[16-17]與防控[18-20]，有關(guān)Xcm遺傳分化等方面的研究報(bào)道甚少[21]。本試驗(yàn)首次對(duì)22株從海南省、四川省、廣西省芒果產(chǎn)區(qū)分離的Xcm菌株和1株源自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）的Xcm標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行rep-PCR分析，以期揭示我國(guó)3?。▍^(qū)）Xcm的遺傳多樣性，為芒果品種合理布局、黑斑病的流行監(jiān)測(cè)及防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

Xcm標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11637由國(guó)家質(zhì)檢總局動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)研究所趙文軍博士饋贈(zèng)；其余22株Xcm菌株由筆者從海南省、四川省、廣西省芒果產(chǎn)區(qū)的病組織中分離所得，單菌落經(jīng)不斷純化、回接及鑒定保存。菌株相關(guān)信息如表1所示。

1.2菌株的培養(yǎng)和基因組DNA的制備

將供試菌株接種到NA固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)3 d后，挑取單個(gè)菌落于NA液體培養(yǎng)液中，在28 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h，直接用于DNA提取或4 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌基因組DNA的提取參考Biomiga公司的試劑盒（Bacterial gDNA kit）說明書進(jìn)行，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3rep-PCR

rep-PCR采用REP、ERIC和BOX寡核苷酸引物[3]，REP

引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

按照文獻(xiàn)[3]中的方法對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，所有擴(kuò)增反應(yīng)均在PTC200 PCR儀（MJ RESEARCH）上進(jìn)行。優(yōu)化后的反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×PCR緩沖液（Mg2+ Plus），2 μL dNTP混合物（2.5 mmol/L），各 0.5 μL 上、下游引物（20 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），100 ng模板DNA，無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。rep-PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 7 min，30個(gè)循環(huán)（94 ℃ 1 min，40 ℃退火 1 min，65 ℃延伸 8 min），最后 65 ℃ 延伸15 min。ERIC-PCR和BOX-PCR擴(kuò)增條件中，除退火溫度分別為52、53 ℃外，其余擴(kuò)增步驟均同rep-PCR。擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)分析

參照rep-PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，每1條DNA條帶均為1個(gè)分子標(biāo)記，代表1個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所得位點(diǎn)的二源數(shù)據(jù)，即有帶記為“1”，無帶記為“0”，制成Excel文件用于聚類分析。使用NTSYS-pc 2.10e軟件按UPGMA繪制聚類圖，并進(jìn)行菌株的分組分析。

2結(jié)果與分析

2.1Xcm基因組DNA的rep-PCR指紋圖譜分析

采用3組引物（REP、ERIC和BOX）對(duì)23株Xcm的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得較清晰的電泳圖譜，分別擴(kuò)增出1～7、4～12、5～7條分子量不等的DNA條帶，多態(tài)性比率分別為100.00%、75.00%、42.86%，片段大小主要集中在100～5 000 bp之間。3組引物對(duì)所有供試菌株的基因組DNA共擴(kuò)增出463條帶，其中多態(tài)性條帶302條，多態(tài)檢測(cè)率為65.23%，初步表明供試病菌種群在DNA水平上變異較大，存在豐富的多態(tài)性，且各芒果產(chǎn)區(qū)Xcm種群的DNA指紋譜型也表現(xiàn)出明顯差異。如圖1所示，同一地點(diǎn)相同品種相同組織分離出的部分菌株指紋圖譜差異明顯，如DFL1、X6、X16與XCM15～XCM21，MYL2與MYL7，MYF2與MYF5，但也有例外，如XCM15～XCM21；不同地點(diǎn)不同品種不同組織分離出的部分菌株指紋圖譜有較大差異，如MYF5、MYL7與海南省分離株及廣西省分離株。

2.2Xcm基因組DNA的rep-PCR聚類分析

本試驗(yàn)采用NTSYS-pc 2.1聚類分析軟件SHAN程序估算DNA相似系數(shù)，綜合分析了3組引物組合的指紋圖譜數(shù)據(jù)，用UPGMA方法繪制了23株供試菌株的系統(tǒng)聚類樹狀圖。結(jié)果（圖2）表明，以相似系數(shù)0.65為閾值時(shí)，供試的23株菌株可以分為A和B 2個(gè)遺傳相似組，其中B含20個(gè)菌株，為主要遺傳組。以相似系數(shù)為0.87為閾值時(shí)，A組群可分為2個(gè)亞組，B組群則可分為6個(gè)遺傳亞組，其中B-Ⅰ含11個(gè)菌株，為主要遺傳亞組。

如圖2所示，聚類分析結(jié)果表明，23株供試菌株在相似系數(shù)為0.65時(shí)，可以分為A、B 2組，其中A組與B組又各自進(jìn)一步分為2個(gè)和6個(gè)亞組。A組由2株來自四川省米易縣的菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11637組成，其中ATCC11637與1株來自米易縣的菌株進(jìn)一步聚成A-Ⅰ亞組，A-Ⅱ亞組只有1株來自米易縣的菌株。B組則由14株來自海南省、5株

來自四川省及1株來自廣西省的菌株組成。B-Ⅰ亞組以6株來自海南省東方市和3株來自海南省三亞市的菌株為主，另外2株菌株則分別來自廣西省田東縣和四川省攀枝花仁和區(qū)；B-Ⅱ亞組只有1株來自四川省米易縣的菌株；B-Ⅲ包括來自四川省攀枝花仁和區(qū)及海南省東方市的菌株各1株。B-Ⅳ亞組包括2株來自四川省米易縣及1株來自海南省東方市的菌株；B-Ⅴ亞組僅有1株來自海南省東方市的菌株；B-Ⅵ亞組包括2株分別來自四川省米易縣及海南省東方市的菌株。

3討論

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)分析Xcm群體遺傳結(jié)構(gòu)研究，國(guó)外已有相關(guān)研究與報(bào)道[22-24]。Gagnevin等采用hrp探針對(duì)127株Xcm進(jìn)行了RFLP分析，結(jié)果表明供試菌遺傳多樣性豐富，可分為4個(gè)組群，且遺傳分化與菌株的寄主及地理來源有明顯的相關(guān)性[22]。Kishun等對(duì)6株印度Xcm進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果證明供試菌株遺傳多樣性較豐富，可劃分為2個(gè)組群，組群與供試菌株地理來源沒有相關(guān)性[23]。Pruvost等對(duì)299株Xcm進(jìn)行MLVA、IS1595-LM PCR及AFLP分析，結(jié)果證明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性，可分別劃分為231、29、125種單倍型，但單倍型的劃分與菌株的地理來源沒有相關(guān)性[24]。迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未見應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行Xcm遺傳分化的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)采用REP、ERIC和BOX引物對(duì)23株來源于海南省、四川省、廣西省及美國(guó)菌種保存中心的Xcm進(jìn)行了遺傳多樣性的分子指紋分析，結(jié)果表明，REP和ERIC引物能擴(kuò)增出多種條帶，并顯示出多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，而BOX-PCR雖可擴(kuò)增出條帶，但用于分析Xcm群體內(nèi)的遺傳變異的效果不理想。

為了準(zhǔn)確反映供試菌株間基因組之間的差異，本試驗(yàn)綜合分析了3組引物的DNA指紋圖譜，結(jié)果表明，供試菌株群體具有豐富的遺傳多樣性，不同地區(qū)的部分Xcm菌株DNA指紋譜型具有較明顯的差異，另外，來源于同一縣市的Xcm，其部分菌株的DNA指紋譜型也表現(xiàn)出一定差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，來自不同產(chǎn)區(qū)與不同芒果品種的Xcm可以聚成一組，由此說明芒果細(xì)菌性黑斑病病原菌的遺傳組與地理來源及芒果品種均無明顯相關(guān)性，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]一致，這也從側(cè)面說明了該病是帶菌苗木、接穗調(diào)運(yùn)引起的。

4結(jié)論

本試驗(yàn)采用rep-PCR指紋分析初步揭示了Xcm基因組間的遺傳多樣性，結(jié)果表明，Xcm群體有豐富的遺傳多態(tài)性和較大的遺傳變異，且各遺傳聚類組群菌株來源廣泛，與地理來源及芒果品種均無明顯相關(guān)性。由于所用的菌株數(shù)量有限，其代表程度有一定局限性。在以后的研究中，應(yīng)該大范圍地收集菌株以研究我國(guó)Xcm的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。

參考文獻(xiàn)：

[1]文衍堂，黃圣明. 芒果細(xì)菌性黑斑病癥狀與病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1994，15（1）：79-85.

[2]漆艷香，蒲金基，張欣，等. 芒果細(xì)菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆與序列分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（4）：663-667.

[3]Versalovic J，Schneider M，De Bruijn F J，et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction[J]. Methods in Molecular and Cellular Biology，1994，5（1）：25-40.

[4]Louws E J，F(xiàn)ulbright D W，Stephens C T，et al. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology，1994，60（7）：2286-2295.

[5]姚廷山，胡軍華，唐科志，等. 利用rep-PCR技術(shù)研究我國(guó)9省柑橘潰瘍病菌遺傳多樣性[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2010，27（5）：819-822.

[6]Arshadi F，Sijam K，Awang Y B. Genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri causal agent of citrus canker[J]. Journal of Plant Protection Research，2013，53（4）：312-316.

[7]魏楚丹，丁鈿，葉凎，等. 廣東和江西省柑橘潰瘍病菌的遺傳多樣性分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：71-76.

[8]高玲玲，黃瓊，陳小龍. 中國(guó)西南水稻白葉枯病菌遺傳多樣性垂直分布格局[J]. 中國(guó)生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，22（9）：1086-1092.

[9]Cruz C M V，Leach J E，Ardales E Y，et al. Measurement of haplotypic variation in Xanthomonas oryzae pv. oryzae within a single field by rep-PCR and RFLP analyses[J]. Phytopathology，1996，86（12）：1352-1359.

[10]張立新，何濤，于建紅，等. 安徽省水稻條斑病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2014，44（5）：521-526.

[11]Gonzalez C，Szurek B，Manceau C，et al. Molecular and pathotypic characterization of new Xanthomonas oryzae strains from West Africa[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（5）：534-546.

[12]付貝，周曉云，羅建軍，等. 廣東紅掌細(xì)菌性疫病病原菌的遺傳多樣性分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（2）：40-45.

[13]Donahoo R S，Jones J B，Lacy G H，et al. Genetic analyses of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae strains reveal distinct phylogenetic groups[J]. Bacteriology，2013，103（3）：237-244.

[14]Singh D，Dhar S，Yadava D K. Genetic and pathogenic variability of Indian strains of Xanthomonas campestris pv. campestris causing black rot disease in crucifers[J]. Current Microbiology，2011，63（6）：551-560

[15]朱平川，盧潔，張昭穎，等. 廣西十字花科黑腐病菌致病性分化及遺傳多樣性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（3）：541-547.

[16]芒果細(xì)菌性黑斑病菌檢疫鑒定方法：GB/T 28094—2011[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[17]芒果細(xì)菌性黑斑病原菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)范：NY/T 2257—2012[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[18]張賀，漆艷香，謝藝賢，等. 芒果細(xì)菌性黑斑病病原細(xì)菌室內(nèi)藥劑篩選[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（12）：344-347.

[19]劉曉妹，劉文波，范秀利. 芒果細(xì)菌性黑斑病生防菌的篩選及防效測(cè)定[J]. 中國(guó)生物防治，2006，22（增刊1）：94-97.

[20]劉曉妹，劉文波，蒲金基，等. 芒果對(duì)細(xì)菌性黑斑病抗病性測(cè)定[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2009，26（3）：349-352.

[21]漆艷香，謝藝賢，張賀，等. 海南省芒果細(xì)菌性黑斑病原菌生理生化特性初步研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（28）：301-305.

[22]Gagnevin L，Leach J E，Pruvost O. Genomic variability of the Xanthomonas pathovar mangiferaeindicae，agent of mango bacterial black spot[J]. Applied and Environmental Microbiology，1997，63（1）：246-253.

[23]Kishun R，Gupta V K. Detection of genetic diversity among Indian strains of Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae using PCR-RAPD[J]. Nature Precedings，2008：1-19.

[24]Pruvost O，Vernière C，Vital K，et al. Insertion sequence- and tandem repeat-based genotyping techniques for Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae[J]. Phytopathology，2011，101（7）：887-893.常征，王蓉，李洪潮，等. 菌株YS（r）-19分離鑒定及對(duì)三七根腐病菌的抑菌活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：92-95.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.023