基于COI序列的哈蟆油基原動物DNA條形碼鑒定研究

王孟虎+康廷國+許亮+楊燕云+蔡振嬌

[摘要] 哈蟆油具有較高的經(jīng)濟和社會價值，其混偽品較多，給市場造成了很大的混亂。利用基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)對已鑒定的東北林蛙、中國林蛙、桓仁林蛙和黑龍江林蛙進行PCR擴增和測序，建立4種林蛙COI基因數(shù)據(jù)庫；將所測的序列與GenBank上的序列進行比對，顯示為上述4種林蛙；應用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）7.0軟件計算K2P遺傳距離并構(gòu)建NJ（neighbor-joining）系統(tǒng)聚類樹，所測4種林蛙的序列和GenBank上下載的4種林蛙的序列分別聚為1支，但與GenBank上下載的2個外群獨立分開，東北林蛙的COI基因可能存在地域性差異，但該技術(shù)并不能鑒別林蛙的雌雄。結(jié)果顯示DNA條形碼技術(shù)能夠準確鑒定哈蟆油的基原動物，說明DNA條形碼COI為哈蟆油基原動物的鑒定提供一個新的手段和方法。

[關(guān)鍵詞] 哈蟆油；東北林蛙；中國林蛙；DNA條形碼；鑒定

Identification of Ranae Oviductus original animal based on COI sequences

WANG Meng-hu，KANG Ting-guo*，XU Liang*，YANG Yan-yun，CAI Zhen-jiao

（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

[Abstract] Ranae Oviductus has a high economic and social value， but its adulterants are more numerous， which causes a great confusion to the market. Using DNA bar code technology based on COI sequence for PCR amplification and sequencing of the identified Rana dybowskii， R. chensinensis， R. huanrensis and R. amurensiss， the COI gene database of four species of Rana was established， and comparing the measured sequence with the sequence of GenBank， four kinds of Rana were identified. The MEGA （molecular evolutionary genetics analysis） 7 .0 software was used to calculate the genetic distance of K2P and construct the NJ （neighbor-joining） system cluster tree. The sequence of the four species of Rana measured were clustered into one group with the sequence of the four kinds of Rana downloaded from GenBank， but separated from the two outer groups downloaded from GenBank. The COI gene of the R. dybowskii was likely to have regional differences， however this technique failed to distinguish male and female Rana. The results showed that DNA bar code technology could accurately identify the base of original animal of R. oviductus. It indicates that DNA bar code COI provides a new method for the identification of R. oviductus.

[Keywords] Ranae Oviductus； Rana dybowskii； Rana chensinensis； DNA barcode； identify

哈蟆油作為名貴動物藥及滋補品，其性平，味甘、咸，歸肺、腎經(jīng)，具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效[1]。哈蟆油作為遼藥六寶之一和遼寧特色的滿藥品種，其基原動物主要分布在長白山地區(qū)。過去在中國分布的林蛙命名比較混亂，各地區(qū)的林蛙命名經(jīng)過幾次變動。自1985年版《中國藥典》至今記載哈蟆油的基原動物為中國林蛙Rana temporaria chensinensis[1]，近年來部分學者認為哈蟆油的基原動物為東北林蛙R. dybowkii[2-7]，我課題組對哈蟆油的基原動物進行考證，認為哈蟆油的基原動物為東北林蛙?！端膸烊珪な⒕┩ㄖ尽酚涊d“山蛤……多伏巖中，似蝦蟇而大，腹黃紅色，俗稱哈什蟆……”；《遼海叢書·沈故篇》記載“哈什馬形似田雞，腹有油如粉條，有子如鮮蟹黃，取以作羹，味極肥美，然唯與京一帶有之。滿洲人用以祭祖，取其潔也

。”[8]根據(jù)上述記載，“盛京”、“興京”分別指今天的遼寧省沈陽市、遼寧省新賓滿族自治縣，說明哈蟆油的基原動物分布在遼寧地區(qū)，現(xiàn)在遼寧新賓依然是哈蟆油的主產(chǎn)區(qū)之一。本實驗收集長白山地區(qū)的東北林蛙、桓仁林蛙和黑龍江林蛙與內(nèi)蒙古地區(qū)的中國林蛙，并鑒定為上述4種林蛙。提取4種林蛙的總DNA，進行PCR擴增并測序，將所測序列與GenBank上的序列進行比對。本實驗首次利用DNA條形碼技術(shù)鑒定4種林蛙和對不同地域的東北林蛙進行鑒別，結(jié)果顯示DNA條形碼技術(shù)能夠準確鑒定哈蟆油的基原動物；東北林蛙線粒體COI基因的2個位點呈現(xiàn)地域性的變異，該變異位點是否具有穩(wěn)定性需要進一步研究。

1 材料

EPS-600型電泳儀，MG96G型聚合酶鏈反應（PCR）儀（杭州朗基科學儀器有限公司），Tanon-4100型凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國Applied Biosystems 公司），F(xiàn)resco17/21型臺式冷凍離心機（上海巴玖實業(yè)有限公司）。

Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，引物（北京天根生化科技有限公司），Trans 2K DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司），2×Taq MasterMix（北京康為試劑生物科技有限公司），瓊脂糖和溴化乙錠（EB）均購自上海Sangon公司，其余均為分析純。

實驗樣品及下載于GenBank的序列見表1，中國林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙均經(jīng)大連歷史博物館兩棲動物研究員孫峰鑒定。

2 方法

2.1 DNA提取

用滅菌后的手術(shù)剪把樣品（肌肉）剪碎，加液氮研磨，取約20 mg樣品，使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（生工）提取總DNA，具體操作步驟按照試劑盒操作說明進行。

2.2 PCR擴增和電泳條件

引物為動物COI基因通用引物[9-11]，包括正、反2個方向，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAA-TCA-3′。PCR反應體積為50 μL，體系內(nèi)含Taq Master Mix 25 μL，引物對各2.0 μL（10 μmol·L-1），DNA提取液4 μL，加去RNA酶水補足至50 μL。擴增程序為：95 ℃，3 min；94 ℃，40 s，35～42 ℃，1 min，72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，條件為100 V，230 mA，35 min。Marker采用寶生物（大連）DL 2000 Marker，Marker相對分子質(zhì)量標準從上至下為2 000，1 000，750，500，250，100 bp。

2.3 序列測序及數(shù)據(jù)處理

PCR擴增產(chǎn)物使用 ABI 3730 XL 測序儀（華大基因公司）雙向測序，測序后得到正反兩向峰圖，利用Codoncode Aligner V 6.0.2[12]進行峰圖的查看、拼接及比對。當目的序列低于800 bp時，需去除拼接后的引物序列，但引物序列均在前30 bp和后30 bp的不穩(wěn)定區(qū)且拼接后的長度也不相同，故在去除引物區(qū)這一步驟需手動去除不穩(wěn)定的引物區(qū)。實驗所測序列拼接后的序列長度在690～710 bp，陳士林[13]用COI基因通用引物測得中國林蛙序列為658 bp，均低于800 bp，需手動去除拼接后的引物區(qū)。對于從Genbank獲得的COI序列，采用Codoncode Aligner v 6.0.2軟件，與拼接好的樣品序列比對后，去除與樣品序列相對應的658 bp以外的區(qū)段。所有序列應用MEGA 7.0[14]軟件比對并計算K2P遺傳距離[15]、建立NJ系統(tǒng)聚類樹[16]，在GenBank上進行BLAST相似性搜索法[17-18]進行序列的比對分析，驗證各物種。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴增

中國林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙進行PCR時，中國林蛙退火溫度為42 ℃，電泳樣本10個，成功10個（1～10）；桓仁林蛙退火溫度為42 ℃，電泳樣本10個，成功各10個（11～20）；東北林蛙的退火溫度為37 ℃，電泳樣本75個，成功37個（21～57）；黑龍江林蛙的退火溫度為35 ℃，電泳樣本30個，成功2個（58～59）；以上所有成功的條帶均在500～750 bp出現(xiàn)亮帶。這表明，中國林蛙和桓仁林蛙DNA條形碼獲得條件通用，便于實踐中應用，而東北林蛙和黑龍江林蛙不僅反應條件獨特，而且成功率極低，分別為49%，6.7%，對于實踐應用基本沒有參考價值，見圖1。

3.2 種內(nèi)和種間變異分析

3.2.1 中國林蛙 中國林蛙10條序列比對后序列長度為658 bp，平均GC量為322，占48.9%。種內(nèi)最大K2P距離為0.002，種內(nèi)平均K2P距離為0.001。中國林蛙與桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙的種間遺傳距離分別為0.022，

0.085，0.107；種間分別有24，85，101個不同的堿基；種內(nèi)有1個變異位點，在第448位點有C/T變異，見圖2。

3.2.2 東北林蛙 東北林蛙37條序列比對后序列長度為658 bp，平均GC量為325，占49.3%。種內(nèi)最大K2P距離為0.011，種內(nèi)平均K2P距離為0.003。東北林蛙與桓仁林蛙、黑龍江林蛙的種間遺傳距離分別為0.081，0.115；種間分別有81，108個不同的堿基，種內(nèi)有A/G，G/A，C/T，A/C等8個變異位點，見圖2。

3.2.3 桓仁林蛙 桓仁林蛙10條序列比對后序列長度為658 bp，平均GC量為325，占49.4%，種內(nèi) K2P 距離為0.000?；溉柿滞芘c黑龍江林蛙的種間遺傳距離為0.102，種間有95個不同的堿基，種內(nèi)有無變異位點，見圖2。

3.2.4 黑龍江林蛙 黑龍江林蛙2條序列比對后序列長度為658 bp，平均GC量為325，占49.4%。種內(nèi)K2P距離為0.000。種內(nèi)有無變異位點，見圖2。

3.3 NJ樹聚類分析

利用MAGA 7.0軟件將所測序列與GenBank下載的序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，見圖3。4種林蛙的序列與勐臘水蛙和大綠臭蛙的序列分別聚為一支，從GenBank下載4種林蛙的序列與實驗所測4種林蛙的序列分別聚為一支，說明DNA條形碼技術(shù)不僅能夠鑒別4種林蛙，也能夠鑒定4種林蛙。東北林蛙和中國林蛙的雌雄個體并沒有聚為兩支而是聚在一支上，說明DNA條形碼技術(shù)并不能鑒別林蛙的雌雄。遼寧（桓仁、清原）、吉林臨江和遼寧（鳳城、岫巖、寬甸）地區(qū)的東北林蛙分別聚為一支，上述東北林蛙COI基因序列在262，553位點分別有A/G，G/A變異且呈現(xiàn)地域性差異，說明東北林蛙COI基因可能存在地域性變異。

4 討論

本實驗前期采用哈蟆油作為樣品，由于藥材遇水膨脹后呈黏糊狀[11]，利用SDS堿裂解法、苯酚法、試劑盒等方法均不能從哈蟆油中提取COI基因，故本次實驗的所有樣品均來自林蛙的肌肉組織。

通過對中國林蛙種組（中國林蛙、東北林蛙）和黑龍江林蛙種組（黑龍江林蛙、桓仁林蛙）的4個物種59份樣品的COI基因序列進行比對分析，得到中國林蛙和桓仁林蛙的種間遺傳距離為0.022與東北林蛙和黑龍江林蛙的種間遺傳距離均大于0.080，說明中國林蛙和桓仁林蛙的親緣關(guān)系更近，與傳統(tǒng)的林蛙分類學將4種林蛙分為2個種組存在一定的矛盾。由于物種的基因更能說明物種之間的親緣關(guān)系，DNA條形碼技術(shù)在動物分類學上的應用有助于現(xiàn)代動物分類學更快的發(fā)展。

通過對3個省8個市的125份樣品提取總DNA并進行PCR、測序，同一試劑盒對4種林蛙的提取成功率有很大的差別，中國林蛙和桓仁林蛙的PCR成功率為100%，東北林蛙PCR成功率為49.3%，黑龍江林蛙PCR成功率為6.7%。本實驗對黑龍江林蛙的PCR條件進行多次優(yōu)化，其PCR成功率依然較低，應考慮選擇不同的試劑盒進行提取。線粒體COI基因位于細胞質(zhì)內(nèi)，屬于母系遺傳，本次實驗對中國林蛙和東北林蛙的雌雄的COI基因進行測序，其基因序列并不能鑒別林蛙的雌雄，驗證了該理論。中國林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙的種內(nèi)變異的個數(shù)分別為1，0，7，0個，說明同一物種在同一地區(qū)其COI基因變異性較??；但東北林蛙種內(nèi)的2個變異位點呈現(xiàn)地域性差異且本次實驗的兩個地域變異位點較為穩(wěn)定，遼寧岫巖、鳳城、寬甸聚為一支，遼寧桓仁、清原和吉林臨江聚為一支，可能是由于長期的地理隔離，東北林蛙的線粒體COI基因發(fā)生了穩(wěn)定性的變異。對于不同地域的東北林蛙的堿基變異是否具有穩(wěn)定性，還需要進一步研究。本次實驗，基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)準確鑒定了哈蟆油基的原動物，為鑒定哈蟆油基原動物提供新的手段和方法。

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[責任編輯 呂冬梅]