響應面優(yōu)化油茶葉黃酮提取工藝及抑菌活性研究

王宗成，龍燕萍，彭延波，盤 雪，趙石喬，周 勇，羅小芳

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2.湖南科技學院 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199；3.湖南科技學院 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4.西安源森生物科技有限公司，西安 710075)

綜合利用

響應面優(yōu)化油茶葉黃酮提取工藝及抑菌活性研究

王宗成1，2，3，龍燕萍1，彭延波1，盤 雪1，趙石喬1，周 勇4，羅小芳1，2，3

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2.湖南科技學院 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199；3.湖南科技學院 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4.西安源森生物科技有限公司，西安 710075)

采用乙醇回流提取油茶葉中黃酮，通過單因素試驗分別考察提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取次數(shù)和料液比對黃酮得率的影響，在此基礎上采用響應面法優(yōu)化分析確定最佳工藝條件，并比較了油茶葉黃酮、油茶籽黃酮、油茶籽殼黃酮的抑菌活性。結(jié)果表明：油茶葉黃酮的最佳提取條件為提取溫度78℃、乙醇體積分數(shù)60%、提取時間90 min、提取2次和料液比1∶22，在此條件下油茶葉黃酮的得率可達到49.42 mg/g；油茶葉黃酮的抑菌活性高于油茶籽殼黃酮的抑菌活性，但低于油茶籽黃酮的抑菌活性。

響應面分析法；油茶葉；黃酮；提取；抑菌活性

油茶樹為山茶科，屬常綠小喬木，主要分布于我國湖南丘陵地帶以及其他亞熱帶地區(qū)，油茶的種子油茶籽為大眾提供優(yōu)質(zhì)的食用油[1]，而油茶葉資源并未得到利用[2-3]。油茶葉中含有多種黃酮類化合物，具有良好的抗氧化性能、抗菌生理活性和治療無名腫毒、犬咬及火燒成瘡等作用[4-5]。油茶葉中黃酮類化合物含量相對較高，且容易大規(guī)模采集，再加上油茶樹近年的大力種植，開發(fā)油茶葉綜合利用蘊涵了較大經(jīng)濟效益[6]。目前油茶葉黃酮類化合物的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[7-8]，但基于響應面法的優(yōu)化方法，以及比較油茶葉、油茶籽和油茶籽殼中黃酮類化合物的抗菌活性差異報道很少，因此本文通過響應面法設計優(yōu)化油茶葉黃酮提取工藝，獲得油茶葉黃酮的最佳提取工藝條件，并比較了油茶葉黃酮、油茶籽黃酮、油茶籽殼黃酮的抑菌活性，對油茶葉的開發(fā)利用具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油茶葉，2015年9月上旬采摘自永州零陵朝陽公園，選擇綠色無蟲害葉片，經(jīng)清洗、烘干和粉碎處理后，于干燥箱中保存?zhèn)溆?；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)(批號：100080-200707)；95%乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH等均為分析純；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉均為湖南科技學院微生物實驗室提供。

UV-1750型紫外可見分光光度計，RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，TE124S電子天平，LD4-2A離心機，中興FW-200高速萬能粉碎機，集熱式磁力攪拌器，YXQ-SG46-280SA手提式滅菌器，SW-CJ-2F超凈工作臺，HWS-270恒溫恒濕培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶葉黃酮的提取

稱取油茶葉干燥粉末5.0 g，采用乙醇回流提取法，在一定溫度下提取一定時間，收集提取液，用蒸餾水稀釋定容至500 mL，作為油茶葉黃酮待測溶液。采用單因素試驗分別考察提取溫度50～90℃、乙醇體積分數(shù)40%～80%、提取時間30～150 min、提取次數(shù)1～3次、料液比1∶10～1∶30對黃酮得率的影響。采用響應面法進行工藝優(yōu)化。

1.2.2 油茶葉黃酮含量的測定

參照課題組已有經(jīng)驗[9]，配制0.15 mg/mL蘆丁標準溶液，以不加入蘆丁標準溶液為空白對照，在波長510 nm下分別測定0.015～0.075 mg/mL蘆丁標準溶液的吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，蘆丁標準溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，獲得回歸方程為：A=10.863C+0.026 4，R2=0.995 4，說明在0.015～0.075 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。將上述油茶葉黃酮待測溶液按照繪制蘆丁標準曲線方法測定吸光度，計算提取液中油茶葉黃酮含量及黃酮得率。

1.2.3 抑菌活性研究

將油茶葉黃酮提取液分別濃縮后再稀釋至以總黃酮計25、5 mg/mL和1 mg/mL作為供試樣品溶液。將滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂加至直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺中紫外滅菌下冷卻，吸取濃度為105～108cfu/mL供試菌種菌懸液20 μL加至培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒涂布均勻，采用濾紙片法用無菌鑷子將浸有樣品溶液的8 mm濾紙片放到培養(yǎng)皿中，每個試驗設置3次重復，最后將所有培養(yǎng)皿放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量油茶葉黃酮抑菌圈直徑[5，10]，求平均值作為試驗結(jié)果，抑菌圈直徑越大則抑菌活性越強。同時采用相同方法測定油茶籽黃酮、油茶籽殼黃酮提取液抑菌活性，進行對比。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度的影響

按料液比1∶15加入70%的乙醇溶液，分別于50、60、70、80、90℃回流提取100 min，提取2次，合并提取液定容測定吸光度，計算黃酮得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溫度對得率的影響

由圖1可知，在提取溫度達到80℃之前，得率與提取溫度呈正相關；當提取溫度達到80℃時，黃酮得率達到最大值；超過80℃時，得率隨著提取溫度升高反而下降，說明溫度過高可能破壞黃酮類化合物導致得率下降[11-12]。因此，選擇80℃為最佳提取溫度。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)的影響

按料液比1∶15分別加入乙醇體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，于80℃回流提取100 min，提取2次，合并提取液定容測定吸光度，計算黃酮得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數(shù)對得率的影響

由圖2可知，隨乙醇體積分數(shù)的增大，得率先增后減，在60%時得率最高?？赡苁怯捎陔S著乙醇體積分數(shù)增大，黃酮類化合物提取達到飽和，同時一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合，從而導致黃酮類化合物的提取率下降[11-12]。因此，選擇60%為乙醇溶液最佳體積分數(shù)。

2.1.3 提取時間的影響

按料液比1∶15加入60%的乙醇溶液，分別在80℃回流提取30、60、90、120、150 min，提取2次，合并提取液定容測定吸光度，計算黃酮得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對得率的影響

由圖3可知，在提取時間達到90 min之前，隨著提取時間的延長黃酮得率逐漸升高，當提取時間超過90 min以后，黃酮得率隨提取時間的延長基本不變，說明繼續(xù)延長提取時間對提高得率沒有意義。因此，選擇90 min為最佳提取時間。

2.1.4 提取次數(shù)的影響

按料液比1∶15加入60%的乙醇溶液，分別在80℃回流提取90 min，分別提取1、2、3次，合并提取液定容測定吸光度，計算黃酮得率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，提取2次時得率比提取1次時的明顯增加，而提取3次時得率比提取2次時的增加不明顯，從實際考慮，一般提取2次就可以提取較完全了。因此，選擇2次為最佳提取次數(shù)。

圖4 提取次數(shù)對得率的影響

2.1.5 料液比的影響

分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%的乙醇溶液，分別在80℃回流提取90 min，提取2次，合并提取液定容測定吸光度，計算黃酮得率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對得率的影響

由圖5可知，在料液比達到1∶20之前，得率隨料液比的增大逐漸升高，當料液比為1∶20時，得率達到最大，之后隨料液比的增大，得率基本保持不變。因此，選擇1∶20為最佳料液比。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 Box-Behnken設計方案及結(jié)果

通過對單因素試驗數(shù)據(jù)結(jié)果分析，乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度對油茶葉黃酮得率的影響較大，故在固定提取時間90 min，提取2次的條件下，采用響應面分析軟件建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合設計模型進行優(yōu)化設計[13-14]，響應面試驗設計及結(jié)果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及結(jié)果

續(xù)表1

試驗號A乙醇體積分數(shù)/%B料液比C提取溫度/℃Y得率/(mg/g)12701∶158039.2213601∶157037.5914601∶208048.7515501∶209039.6316601∶208048.4217601∶257044.83

采用Design Expert 8.0.6軟件對表1中試驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，得到油茶葉黃酮得率(Y)對乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)的二次多項回歸模型方程為：

Y=48.60+0.068A+2.51B-1.87C-0.033AB-0.12AC-1.34BC-2.34A2-4.42B2-4.77C2

2.2.2 響應面回歸模型的方差分析

為了檢驗回歸方程的有效性，進一步確定各因素對黃酮得率的影響程度，對回歸模型進行了方差分析，結(jié)果見表2。

表2 響應面回歸方程的方差分析

注：**(P<0.01)為極顯著；*(P<0.05)為顯著。

2.2.3 最佳工藝條件

用Design-Expert 8.0.6軟件設計優(yōu)化得出最佳的提取條件為乙醇體積分數(shù)60.19%、料液比1∶21.60、提取溫度77.60℃。但考慮到實際操作的局限性，乙醇回流提取油茶葉黃酮的提取工藝條件調(diào)整為提取溫度78℃、乙醇體積分數(shù)60%、提取時間90 min、提取2次和料液比1∶22，在此條件下油茶葉黃酮的得率可達到49.42 mg/g。

2.3 抑菌活性

試驗通過測定抑菌圈的直徑，比較了油茶葉黃酮、油茶籽黃酮、油茶籽殼黃酮不同質(zhì)量濃度下的抑菌活性，結(jié)果如表3所示。

表3 油茶葉黃酮、油茶籽黃酮、油茶籽殼黃酮不同質(zhì)量濃度下的抑菌活性

由表3可以看出，油茶葉黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉均表現(xiàn)出較好的抑制作用，且隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強，且抑制作用大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>黑曲霉；在相同質(zhì)量濃度下，油茶葉黃酮的抑菌活性高于油茶籽殼黃酮的抑菌活性，但低于油茶籽黃酮的抑菌活性，由此可看出，油茶葉黃酮的抗菌活性較高，可作為天然抗菌劑進一步開發(fā)。

3 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎上，對油茶葉黃酮提取工藝進行了優(yōu)化，采用Box-Behnken設計方案建立的二次多項數(shù)學模型能較準確地預測乙醇回流提取油茶葉黃酮的得率。通過響應面分析得出了乙醇回流提取油茶葉黃酮的最佳工藝條件為提取溫度78℃、乙醇體積分數(shù)60%、提取時間90 min、提取2次和料液比1∶22。在最佳工藝條件下，油茶葉黃酮的得率可達到49.42 mg/g。

抑菌活性表明，油茶葉黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉均表現(xiàn)出較好的抑制作用，在相同質(zhì)量濃度下，油茶葉黃酮的抑菌活性高于油茶籽殼黃酮的抑菌活性，但低于油茶籽黃酮的抑菌活性。該研究為油茶葉開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

[1] 朱俊朋， 王超， 羅凡， 等. 水酶法提取油茶籽油的工藝研究[J]. 中國油脂， 2016， 41(3)：12-15.

[2] 鄔靖宇， 曹清明， 鐘海雁. 油茶葉黃酮類化合物研究進展[J]. 食品與機械， 2014， 30(6)：243-246.

[3] 李姣娟， 黃克瀛， 龔建良， 等. 油茶葉乙醇提取物清除 DPPH 自由基作用的研究[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè)，2008，28(2)：82-86.

[4] 李姣娟， 龔建良， 周盡花， 等. 大孔樹脂對油茶葉黃酮的吸附分離特性研究[J]. 離子交換與吸附， 2010， 26(4)：353-361.

[5] 黃陳陳，丁之恩，楊松，等. 油茶葉黃酮類化合物清除自由基及抑菌作用研究[J]. 糧食與油脂， 2011(12)：12-15.

[6] 李姣娟， 龔建良， 周盡花， 等. 油茶葉總黃酮的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2008， 29(12)：93-96.

[7] 龔建良，李姣娟，陳叢謹. 微波法提取油茶葉總黃酮的工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2007， 35(35)：11372-11374.

[8] 肖新生， 張敏， 袁先友， 等. 油茶葉中黃酮類物質(zhì)的提取及純化工藝研究[J]. 中國食品添加劑， 2012(4)：93-97.

[9] 王宗成， 蔣玉仁， 劉小文， 等. 響應面優(yōu)化生姜莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2015， 27(9)：1582-1588.

[10] 趙強， 呂偉， 趙二勞， 等. 黃芥籽粕中多酚超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性[J]. 中國油脂， 2015， 40(10)：64-67.

[11] 張紅玉， 王成章， 張宇思， 等. 超聲波提取牡丹籽殼多酚工藝響應面法優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 中國油脂， 2015， 40(6)：90-94.

[12] 王宗成， 王多， 王凱， 等. 響應面法優(yōu)化喜樹葉總黃酮提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)， 2014， 35(2)：79-82.

[13] 原姣姣， 王成章， 張紅玉， 等. 超聲輔助酶法提取橄欖油的研究[J]. 中國油脂， 2016， 41(7)：10-14.

[14] 劉普， 李小方， 劉一瓊， 等. 超聲輔助水代法提取芍藥籽油工藝條件優(yōu)化[J]. 中國油脂， 2016， 41(5)：1-5.

Optimization of extraction of flavonoids from oil-tea camellia leaves using response surface methodology and evaluation of its antibacterial activity

WANG Zongcheng1，2，3， LONG Yanping1， PENG Yanbo1， PAN Xue1， ZHAO Shiqiao1， ZHOU Yong4， LUO Xiaofang1，2，3

(1.College of Chemical and Biological Engineering， Hunan University of Science and Engineering， Yongzhou 425199， Hunan, China; 2.Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo Biloba, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou 425199, Hunan, China; 3.Hunan Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources of Southern Hunan， Hunan University of Science and Engineering， Yongzhou 425199， Hunan， China; 4.Xi’an Yuensun Biological Technology Co.， Ltd.， Xi’an 710075， China)

Flavonoids was extracted from oil-tea camellia leaves by ethanol reflux extraction method， and the effects of extraction temperature， volume fraction of ethanol， extraction time， extraction times and ratio of solid to liquid on yield of flavonoids were studied by single factor experiment. Based on this， the extraction conditions were optimized by response surface methodology，and the antibacterial activities of flavonoids from oil-tea camellia leaves， oil-tea camellia seeds and oil-tea camellia seed shell were compared. The results showed that the optimal extraction conditions were obtained as follows：extraction temperature 78℃， volume fraction of ethanol 60%， extraction time 90 min， extraction times twice and ratio of solid to liquid 1∶22. Under these conditions， the yield of flavonoids was 49.42 mg/g. The antibacterial activity of flavonoids from oil-tea camellia leaves was higher than that of flavonoids from oil-tea camellia seed shell， but lower than that of flavonoids from oil-tea camellia seeds.

response surface methodology; oil-tea camellia leaves; flavonoids; extraction; antibacterial activity

2016-06-24；

2016-12-23

湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助(2012-318)；湖南省教育廳資助科研項目(15C0587)；湖南科技學院生物工程重點學科資助

王宗成(1983)，男，講師，碩士，研究方向為藥物合成及天然產(chǎn)物開發(fā)(E-mail)wangzongche@163.com。

羅小芳，講師，碩士(E-mail)kong870122wxfx@163.com。

TS202;R284.2

A

1003-7969(2017)04-0123-05