響應(yīng)面試驗優(yōu)化藻類來源磷脂型DHA的提取工藝

李翔宇，田 勇，陸姝歡，周 強(qiáng)，汪志明

(1.嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司，武漢 430073； 2.湖北省營養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心，武漢 430073)

響應(yīng)面試驗優(yōu)化藻類來源磷脂型DHA的提取工藝

李翔宇1，2，田 勇1，2，陸姝歡1，2，周 強(qiáng)1，2，汪志明1，2

(1.嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司，武漢 430073； 2.湖北省營養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心，武漢 430073)

采用低溫脫膠法和膜分離技術(shù)提取DHA藻油中磷脂型DHA。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化磷脂型DHA提取工藝，得到最佳提取工藝條件為過膜壓力0.29 MPa、膜孔徑1.0 μm、溶料比6∶1、過膜溫度50℃。在最佳提取工藝條件下，制備的磷脂型DHA產(chǎn)品正己烷不溶物為0.028%，可以穩(wěn)定地控制在0.03%以下；丙酮不溶物含量可達(dá)到61.3%；磷脂型DHA產(chǎn)品得率為80.8%，且磷脂中DHA含量在44%以上。

DHA；磷脂型DHA；提取；藻類；響應(yīng)面法

磷脂(PL)是細(xì)胞膜的主要組成成分，在細(xì)胞的生化、生理學(xué)上都起著非常重要的作用[1]。磷脂的生理活性與其脂肪酸、極性末端的組成密切相關(guān)，不同種類的脂肪酸起到的生理作用也各不相同[2]。有科學(xué)家指出ω-3系列的磷脂型多不飽和脂肪酸(PUFA)具有磷脂和PUFA共同的生理功能[3-4]。大量試驗表明，磷脂型PUFA相對于甘油酯型PUFA而言，不僅氧化穩(wěn)定性更好，且消化吸收速度更快[5]。研究表明，磷脂型DHA形態(tài)可以原封不動地由細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)分解成DHA和磷脂，顯示出增效作用[6]。

磷脂型DHA，即DHA作為磷脂分子中的主要脂肪酸，是磷脂型PUFA中的一種，近年來受到了越來越多的關(guān)注。目前，磷脂型PUFA產(chǎn)品主要來源于海洋產(chǎn)物(如太平洋蝦和海洋動物卵等)的提取，以及通過生物酶法合成、改性的技術(shù)得到[7-8]。然而提取海洋產(chǎn)物中天然磷脂型PUFA受原料限制、工藝不穩(wěn)定等影響，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足人們的需求。為了提高磷脂中PUFA的含量，自20世紀(jì)90年代以來，不斷有研究者嘗試采用化學(xué)法和酶法制備富含ω-3 PUFA磷脂產(chǎn)品[9-13]。然而化學(xué)法因催化劑非專一性和試劑毒性，會造成副產(chǎn)物多且影響產(chǎn)品安全性。酶法雖然具有位置特異性、可以選擇特定位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)、反應(yīng)副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)[14]，但是由于酶制劑的應(yīng)用，制備的終端產(chǎn)品仍然存在一定的食品安全風(fēng)險。

本研究以裂殖壺藻來源的DHA毛油為原料，制備天然的磷脂型DHA產(chǎn)品。磷脂型DHA產(chǎn)品中DHA、EPA含量高，且原料不受限制，一方面彌補(bǔ)了目前市場上磷脂型PUFA的產(chǎn)能不足；另一方面磷脂型DHA產(chǎn)品具有DHA與磷脂的雙重作用，可作為保健食品、化妝品、藥品來利用。因此，開發(fā)制備天然的磷脂型DHA產(chǎn)品具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

DHA毛油(磷脂型DHA含量3.5%～4.3%)，嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司；正己烷、丙酮，食品級。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速臺式離心機(jī)；MS4002SDR電子天平；SHB-III A循環(huán)水式多用真空泵；ZDF-6真空干燥箱；膜分離設(shè)備，上海過濾器公司；DEA-BML-10薄膜蒸發(fā)器，上海德大天壹化工設(shè)備有限公司；7820A氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 磷脂型DHA產(chǎn)品的制備

低溫脫膠是指不添加脫膠劑，利用低溫來促使膠體雜質(zhì)凝聚析出，再使用過濾法或離心的方法將其從油中分離出來[15]。本文利用低溫脫膠的原理來分離DHA毛油中的油脂和粗磷脂型DHA，得到的粗磷脂型DHA與正己烷混合后，采用膜分離技術(shù)[16]制備磷脂型DHA產(chǎn)品。具體方法：將2 kg DHA毛油置于-10℃環(huán)境中冷凍4 h，經(jīng)室溫解凍后，5 000 r/min離心10 min得到油相和沉淀，即粗磷脂型DHA。取100 g粗磷脂型DHA與正己烷按預(yù)定質(zhì)量體積比混合均勻，在預(yù)定的溫度下加熱后，按預(yù)定過膜壓力，經(jīng)預(yù)定膜孔徑膜過濾，濾液經(jīng)薄膜蒸發(fā)脫溶，即得到磷脂型DHA產(chǎn)品。

1.2.2 磷脂型DHA產(chǎn)品指標(biāo)測定

酸值：AOCS Ja6-55；正己烷不溶物含量：AOCS Ja3-87；丙酮不溶物含量：AOCS Ja4-46。脂肪酸組成：取一定量的磷脂型DHA產(chǎn)品于離心管中，加入20 mL的冷丙酮，混合均勻后，用低溫高速離心機(jī)離心5 min分離出沉淀，將沉淀反復(fù)用10 mL的丙酮洗滌，直到上清液滴于潔凈玻璃片揮發(fā)無油跡為止，沉淀低溫真空干燥。稱取一定量干燥樣品溶于正己烷，以C13∶0甲酯為內(nèi)標(biāo)物，參考Hong等[14]方法進(jìn)行甲酯化后，參照馬彥慶等[17]氣相色譜條件測定磷脂型DHA中的脂肪酸組成及含量。

1.2.3 磷脂型DHA產(chǎn)品得率的測定

式中：m1為得到的磷脂型DHA產(chǎn)品質(zhì)量，g；m2為離心后所取沉淀質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 過膜壓力的選擇

在溶料比3∶1、過膜溫度45℃、不同過膜壓力(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 MPa)條件下，用0.1、0.45、0.8、1.2、2 μm孔徑的膜進(jìn)行過濾，考察過膜壓力對膜通量的影響，如圖1所示。

圖1 過膜壓力對膜通量的影響

由圖1可知，當(dāng)過膜壓力一定時，膜通量隨膜孔徑增大而增大；膜孔徑一定時，膜通量隨壓力增大而增加。當(dāng)過膜壓力大于0.2 MPa時，在相同膜孔徑下，膜通量隨壓力增大而增加緩慢。分析可能是由于凝膠層加厚，流體阻力增大，從而使總阻力不斷增加，導(dǎo)致膜通量隨壓力增加而增大的趨勢變緩[18]。因此，確定以0.2 MPa的過膜壓力為宜。

2.1.2 膜孔徑的選擇

在溶料比3∶1、過膜壓力0.2 MPa、過膜溫度45℃條件下改變膜孔經(jīng)(0.1、0.45、0.8、1.2、2 μm)，考察膜孔徑對磷脂型DHA的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著膜孔徑的增大，膜通量和磷脂型DHA產(chǎn)品的得率也相應(yīng)增大，但隨膜孔徑增大，產(chǎn)品中正己烷不溶物的含量也增大，產(chǎn)品的質(zhì)量將會受到影響。當(dāng)膜孔徑為1.2 μm時，正己烷不溶物含量為0.033%，已超過AOCS規(guī)定的食品級濃縮磷脂標(biāo)準(zhǔn)中正己烷不溶物含量不超過0.03%的要求。因此，綜合考慮選擇膜孔徑為0.8 μm。

圖2 膜孔徑對磷脂型DHA的影響

2.1.3 溶料比的選擇

在過膜壓力0.2 MPa、膜孔徑0.8 μm、過膜溫度45℃條件下改變?nèi)芰媳?1∶1、3∶1、5∶1、8∶1)，考察溶料比對磷脂型DHA的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溶料比對磷脂型DHA的影響

由圖3可知，隨著溶料比的增加，膜通量、磷脂型DHA產(chǎn)品得率和丙酮不溶物含量急劇增加，這是由于添加正己烷可明顯降低體系黏度，使得膜通量和丙酮不溶物含量增加。當(dāng)溶料比大于5∶1時，膜通量、丙酮不溶物含量和磷脂型DHA產(chǎn)品得率變化均不明顯，同時工時和能耗大大增加。因此，選擇溶料比為5∶1較適宜。

2.1.4 過膜溫度的選擇

在溶料比5∶1、過膜壓力0.2 MPa、膜孔徑0.8 μm條件下改變過膜溫度(25、35、45、55℃)，考察過膜溫度對磷脂型DHA的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 過膜溫度對磷脂型DHA的影響

由圖4可知，膜通量、磷脂型DHA產(chǎn)品得率和丙酮不溶物含量隨著過膜溫度的升高而增加。因為升高溫度有利于降低料液的黏度，有利于料液的過濾。當(dāng)過膜溫度升至45℃后，三者升高變緩。又由于磷脂型DHA產(chǎn)品是熱敏物質(zhì)，長時間過高的溫度會使其變性，顏色大大加深，品質(zhì)變差。同時，過高的溫度會使正己烷大量揮發(fā)，不利于操作。因此，綜合考慮選取45℃作為過膜溫度較為合適。

2.2 響應(yīng)面試驗

基于單因素試驗結(jié)果，以過膜壓力(X1)、膜孔徑(X2)、溶料比(X3)和過膜溫度(X4)為考察因素，以膜通量(Y1)、丙酮不溶物含量(Y2)及磷脂型DHA產(chǎn)品得率(Y3)為響應(yīng)值，采用四因素三水平的Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計響應(yīng)面試驗，試驗因素水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 試驗因素水平

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert軟件，對表2中膜通量(Y1)、丙酮不溶物含量(Y2)、磷脂型DHA產(chǎn)品得率(Y3)試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多項回歸方程：

從表3可以看出，Y1、Y2、Y3方程的決定系數(shù)R2分別為0.991 8、0.960 3、0.973 4，表明上述回歸方程描述各因素時，各響應(yīng)值和各因素間關(guān)系顯著。同時表3中模型的P均小于0.000 1，說明模型顯著。失擬項P均大于0.05，不顯著，說明該模型擬合程度良好，誤差小，因此可用此模型對Y1、Y2、Y3進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 方差分析

注：差異顯著(P<0.05)。

用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗優(yōu)化，將Y1、Y2、Y3均取最大值設(shè)置為提取優(yōu)化分析的限定條件，且設(shè)置三者的影響順序為：Y2>Y3>Y1。得到最佳提取條件為：過膜壓力0.29 MPa，膜孔徑 1.0 μm，溶料比6∶1，過膜溫度50℃。在最佳提取條件下，膜通量、丙酮不溶物含量和磷脂型DHA產(chǎn)品得率的預(yù)測值分別為：215.1 L/(m2·h)、61.8%、81.1%。

經(jīng)3次試驗驗證，實(shí)際得到的膜通量為213.7 L/(m2·h)，丙酮不溶物含量為61.3%，磷脂型DHA產(chǎn)品得率為80.8%，均與預(yù)測值相差不大；且其正己烷不溶物含量為0.028%，酸值(KOH)在16.3～17.1 mg/g之間，外觀透明，符合美國AOCS規(guī)定的濃縮磷脂指標(biāo)。

2.3 磷脂型DHA產(chǎn)品中脂肪酸組成的檢測

取3批制備的磷脂型DHA產(chǎn)品各10 g，經(jīng)丙酮脫油、低溫真空干燥后，測定磷脂型DHA產(chǎn)品中脂肪酸的組成，結(jié)果見表4。

表4 磷脂型DHA產(chǎn)品脂肪酸組成 %

由表4可知，制備的3批磷脂型DHA產(chǎn)品中，磷脂脂肪酸組成中DHA含量均大于44%。高于楊文鴿等[19]報道的貽貝磷脂中EPA+DHA含量(24.88%)，慶寧等[20]報道的華貴櫛孔扇貝、合浦珠母貝、翡翠貽貝磷脂中EPA+DHA含量(27.21%、25.26%、26.95%)，張苓花等[10]用產(chǎn)酶菌體催化合成EPA/DHA結(jié)合率為12.11%的卵磷脂及潘麗等[12]通過酶法制備ω-3 PUFA磷脂中DHA+EPA含量(21.56%)。說明采用本方法制備的磷脂型DHA產(chǎn)品優(yōu)于海洋產(chǎn)物提取和酶法合成產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

以裂殖壺藻來源的DHA毛油為原料，經(jīng)-10℃ 冷凍處理后再解凍離心，制備粗磷脂型DHA。制備的粗磷脂型DHA在正己烷體系下，采用無機(jī)膜過濾方式制備食品級磷脂型DHA產(chǎn)品的最佳工藝條件為：過膜壓力0.29 MPa，膜孔徑1.0 μm，溶料比 6∶1，過膜溫度50℃。在最佳工藝條件下，制備的磷脂型DHA產(chǎn)品中正己烷不溶物可以穩(wěn)定地控制在0.03%以下，丙酮不溶物含量可達(dá)到60%以上，磷脂型DHA產(chǎn)品得率為80.8%，磷脂中DHA含量達(dá)44%以上。

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Optimization of extraction of phospholipid containing DHA from algae source using response surface methodology

LI Xiangyu1，2， TIAN Yong1，2， LU Shuhuan1，2， ZHOU Qiang1，2， WANG Zhiming1，2

(1.CABIO Bioengineering (Wuhan) Co.， Ltd.， Wuhan 430073， China； 2.Hubei Province Nutrition Chemicals Biosynthetic Engineering Technology Research Center， Wuhan 430073， China)

Phospholipid containing DHA was extracted from DHA algae oil by low temperature degumming and membrane separation technology. Based on single factor experiment, the extraction conditions of phospholipid containing DHA were optimized by response surface methodology. And the optimal extraction conditions were obtained as follows：transmembrane pressure 0.29 MPa， membrane pore size 1.0 μm， ratio of solvent to material 6∶1， transmembrane temperature 50℃. Under the optimal conditions， the content of acetone-insoluble substance in phospholipid containing DHA product was 61.3% and the content of hexane-insoluble substance could be steadily controlled below 0.03%， which was 0.028%. The yield and DHA content of the product were 80.8% and above 44%， respectively.

DHA； phospholipid containing DHA； extraction； algae； response surface methodology

2016-07-12；

2016-12-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2014AA021701)

李翔宇(1979)，男，在職研究生，主要從事微生物發(fā)酵等方面的研究工作(E-mail)xiangyu_lee@cabio.cn。

汪志明(E-mail)Jimmy_wang@cabio.cn。

TS225.6;TQ028.8

A

1003-7969(2017)04-0118-05