固相萃取柱法分離sn-2 位單甘酯的研究

楊雅新,汪學(xué)德，鄭永戰(zhàn)

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，鄭州 450008)

固相萃取柱法分離sn-2 位單甘酯的研究

楊雅新1,汪學(xué)德1，鄭永戰(zhàn)2

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，鄭州 450008)

為探尋與氣相色譜分析相配套的前處理方法，以高效測(cè)定油脂中sn-2位(β位)脂肪酸組成及含量。 考察了胰脂酶添加量對(duì)甘油三酯酶解程度的影響，并采用Florisil固相萃取柱對(duì)酶解產(chǎn)物中sn-2位單甘酯的分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化。采用高溫氣相色譜法分析Florisil 固相萃取柱對(duì)油脂酶解產(chǎn)物中sn-2位單甘酯的分離能力，結(jié)果表明經(jīng)過Florisil 固相萃取法分離得到的 sn-2 位單甘酯純度能達(dá)到95%；氣相色譜法分析常見的7種油脂的sn-2位脂肪酸組成，結(jié)果表明Florisil 固相萃取法與傳統(tǒng)薄層色譜法測(cè)得的sn-2位脂肪酸組成不存在顯著性差異。

油脂；sn-2 位單甘酯；酶解；薄層色譜；Florisil 固相萃取

extraction

甘油三酯(triacylglycerol，TAG)是植物油的主要成分(占95%以上)，由1個(gè)甘油分子和3個(gè)脂肪酸分子組成，脂肪酸占甘油三酯相對(duì)分子質(zhì)量的95%以上。脂肪酸在甘油三酯骨架上的分布位置有兩類:sn-1,3(α)和sn-2(β)。而脂肪酸在甘油三酯中的?；恢梅植寂c油脂品種、 來源等密切相關(guān)，此外各種油脂由于其種類、遺傳因子、脂肪酶特性等的不同，油中脂肪酸組成及含量大相徑庭。進(jìn)一步的研究證實(shí)，即使是脂肪酸組成相近的不同油脂，脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵數(shù)、雙鍵位置不同而呈現(xiàn)不同化學(xué)和物理性質(zhì)，對(duì)它們的消化和吸收等營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)，生物合成等生物化學(xué)性質(zhì)，晶體結(jié)構(gòu)、熔點(diǎn)等物理性質(zhì)都有重大的影響[1-2]，從而影響其在體內(nèi)的消化過程。對(duì)這些影響脂質(zhì)消化吸收的因素不斷深入的研究，使食品工業(yè)能夠設(shè)計(jì)生產(chǎn)出增加、減少或者控制脂肪消化和吸收的食物，這對(duì)人體健康和疾病預(yù)防控制具有重大意義[3]，故油脂中脂肪酸組成固然重要，但脂肪酸位置分布也不容忽視，為此需對(duì)油脂的脂肪酸位置分布進(jìn)行測(cè)定[4-5]。

目前，分析油脂中 sn-2 位脂肪酸常用的方法是：首先采用胰脂酶對(duì)甘油三酯進(jìn)行酶解，產(chǎn)物包括甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、單甘酯(MAG)、游離脂肪酸(FFA)，然后將酶解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析(TLC)對(duì)酶解產(chǎn)物中的sn-2位單甘酯進(jìn)行分離純化，甲酯化后用氣相色譜(GC)確定sn-2位單甘酯脂肪酸組成。但TLC法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離時(shí)，操作流程相對(duì)復(fù)雜，產(chǎn)物的回收率受操作水平影響較大[6]，而固相萃取(SPE)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)選擇性的提取、分離、濃縮三位一體的過程，操作時(shí)間短、樣品量小、干擾物質(zhì)少，并具有很好的重現(xiàn)性[7]。隨著越來越多的新型吸附劑和新的操作模式的不斷涌現(xiàn)， 固相萃取技術(shù)作為樣品前處理技術(shù)成為化學(xué)分離和純化的一個(gè)強(qiáng)有力工具，從痕量樣品的前處理到工業(yè)規(guī)模的化學(xué)分離，固相萃取技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8]。李興峰等[9 ]采用氨基(—NH2)固相萃取柱分離、純化甘油三酯水解產(chǎn)物中的單甘酯。相對(duì)于TLC法，簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了分析的準(zhǔn)確度，適合用于批量處理樣品。吳琳等[10]采用 Florisil 固相萃取柱實(shí)現(xiàn)了油脂水解后4種酶解產(chǎn)物TAG、DAG、MAG及FFA的依次分離。為研究與氣相色譜分析相配套的前處理方法，以高效測(cè)定油脂中sn-2 位脂肪酸組成及含量,本實(shí)驗(yàn)研究了胰脂酶添加量對(duì)甘油三酯酶解程度的影響，并優(yōu)化了酶解產(chǎn)物中sn-2位單甘酯的分離條件。在最佳分離條件下采用Florisil 固相萃取法對(duì)油脂水解后的4種酶解產(chǎn)物TAG、DAG、MAG、FFA分離，高溫氣相色譜法對(duì)該方法收集的MAG的純度進(jìn)行分析，并與傳統(tǒng)TCL法測(cè)定的油脂sn-2位脂肪酸結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可行性，為sn-2 位脂肪酸組成進(jìn)而為油脂脂肪酸位置分布的研究提供更方便的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

實(shí)驗(yàn)采集7種不同種類的食用油樣品，其中橄欖油、大豆油為超市購買，芝麻油、花生油、牡丹籽油、葵花籽油、菜籽油為實(shí)驗(yàn)室自制低溫壓榨油。

胰脂酶(10萬U/g)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；油酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)、油酸甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)品(5 000 μg/mL)、油酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%)、油酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品(2 500 mg/mL)：美國(guó)Sigma公司；正己烷、乙醚、甲酸、甲醇：均為色譜純，美國(guó)VBS生物公司；Tris試劑、膽酸鈉、氯化鈣、鹽酸溶液、乙醚、甲酸均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DB-1HT毛細(xì)管柱(Agilent,30 m×0.25 mm×0.1 μm)，HP-88毛細(xì)管柱(Agilent,100 m×0.25 mm×0.1 μm)；GF254硅膠層析板(20 cm×20 cm)：青島海洋化工廠； Florisil 固相萃取柱(1 000 mg，6 mL)：Agela公司；Agilent 7890B氣相色譜儀配有FID檢測(cè)器：美國(guó)Agilent公司；真空固相萃取裝置：Supelco 公司； SC-02臺(tái)式低速離心機(jī)：安徽中科中佳儀器有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；ZF-2型三用紫外儀：上海市安亭電子儀器廠；6YZ-180型全自動(dòng)液壓榨油機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取1 mL的油酸標(biāo)樣、1 mL的油酸甘油一酯標(biāo)樣、1 mL的油酸甘油二酯標(biāo)樣和1 mL的油酸甘油三酯標(biāo)樣，用正己烷溶解并定容于10 mL的容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于-20℃的冰箱備用。

1.2.2 油脂酶解產(chǎn)物的制備

取30 mg油樣于10 mL離心管中，加入一定量的胰脂酶(sn-1,3專一性脂肪酶)和2 mL Tris-HCl緩沖溶液小心搖動(dòng)，然后加0.6 mL 膽酸鈉溶液(1 g/L)和 0.4 mL 氯化鈣溶液(220 g/L)，混合均勻后，立即將離心管放入40℃水浴鍋內(nèi)，振蕩5 min，加入1 mL鹽酸(6 mol/L)和1 mL乙醚。在4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中，用氮?dú)獯抵两?，得到酶解產(chǎn)物。

1.2.3 薄層色譜分離油脂酶解產(chǎn)物

將1.2.2中的酶解產(chǎn)物復(fù)溶于2 mL的乙醚中，用點(diǎn)樣針吸取復(fù)溶物，并在硅膠板下端1.5 cm處均勻點(diǎn)樣，然后置于層析缸中層析，展開劑為正己烷-乙醚-甲酸(體積比為70∶30∶1)。紫外燈下顯色，將單甘酯色譜帶刮下，分3次萃取后將萃取液合并于離心管中，氮?dú)獯蹈刹⒂? mL的正己烷復(fù)溶，搖勻，待測(cè)。

1.2.4 Florisil固相萃取柱分離油脂酶解產(chǎn)物

(1)Florisil固相萃取柱的活化：向Florisil固相萃取柱中加入6 mL正己烷活化。

(2)油脂酶解產(chǎn)物的分離：將1.2.2中的油脂酶解產(chǎn)物用3 mL的正己烷復(fù)溶。上樣至活化好的Florisil固相萃取柱中，依次加入正己烷-無水乙醚(體積比為85∶15)、正己烷-無水乙醚(體積比為70∶30)洗脫酶解產(chǎn)物中的甘油三酯和甘油二酯，棄去洗脫液，最后用正己烷-無水乙醚(體積比為25∶75)洗脫單甘酯，收集該部分洗脫液于試管中，氮?dú)獯抵两伞Ｓ? mL正己烷溶解，搖勻，待測(cè)。

1.2.5 高溫氣相色譜分析Florisil固相萃取柱分離得到的單甘酯

將1.2.4(2)分離得到的單甘酯待測(cè)液進(jìn)行高溫氣相色譜分析，根據(jù)待測(cè)液在色譜峰上的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間的比較，確定MAG是否與FFA、DAG、TAG等產(chǎn)物有效分離。

DB-1HT高溫色譜柱分析條件如下：進(jìn)樣口溫度380℃；分流比20∶1；檢測(cè)器溫度400℃；升溫程序?yàn)?00℃保持0 min，50℃/min升溫至220℃保持0 min，15℃/min升溫至290℃保持0 min，40℃/min升溫至320℃保持8 min，20℃/min升溫至360℃保持9 min；載氣為高純氮?dú)?，流?.41 mL/min；空氣流速300 mL/min；氫氣流速30 mL/min。

1.2.6 薄層色譜法和Florisil固相萃取柱法分離得到的單甘酯脂肪酸組成測(cè)定

將1.2.3和1.2.4中得到的單甘酯甲酯化[11]，進(jìn)行氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘油三酯酶解條件的確定

酶解步驟按1.2.2進(jìn)行，胰脂酶的添加量分別設(shè)定為 10、20、30、40、50 mg。酶解后通過高溫氣相色譜測(cè)定酶解產(chǎn)物中各組分的含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同胰脂酶添加量下酶解產(chǎn)物中各組分的含量

注：表中不同小寫字母表示差異顯著。

由表1可看出，胰脂酶的添加量從10 mg 增加到 30 mg 時(shí),甘油三酯的含量逐漸減小、游離脂肪酸的含量逐漸增加, 說明隨著胰脂酶添加量的增加甘油三酯的酶解程度也逐漸增加。當(dāng)胰脂酶添加量大于30 mg時(shí),游離脂肪酸含量變化不大 ,說明胰脂酶的添加量為30 mg時(shí)甘油三酯基本被完全酶解，因此將胰脂酶的添加量確定為30 mg。

2.2 Florisil固相萃取柱分離sn-2位單甘酯條件的確定

固定甘油二酯部分洗脫液體積為12 mL，單甘酯部分洗脫液體積為10 mL，考察甘油三酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 甘油三酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響

由圖1可看出，當(dāng)甘油三酯部分洗脫液體積小于14 mL時(shí)，隨著洗脫液體積的增加所得單甘酯的純度逐漸升高，當(dāng)甘油三酯部分洗脫液體積為14 mL時(shí)，單甘酯純度達(dá)到最大值89.61%，這可能是由于甘油三酯和脂肪酸的極性比較接近，過量的甘油三酯部分洗脫液也會(huì)把大量游離脂肪酸洗脫下來，但如果繼續(xù)增加甘油三酯部分洗脫液體積，收集的單甘酯純度無明顯變化。因此，選擇甘油三酯部分洗脫液體積為14 mL。

固定甘油三酯部分洗脫液體積為14 mL，單甘酯部分洗脫液體積為10 mL，考察甘油二酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 甘油二酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響

由圖2可看出，當(dāng)甘油二酯部分洗脫液體積小于12 mL時(shí)，隨著洗脫液體積的增加所得單甘酯的純度明顯升高，當(dāng)甘油二酯部分洗脫液體積為12 mL時(shí)收集的單甘酯純度達(dá)到最大值91.13%，但如果再增加甘油二酯部分洗脫液體積，收集的單甘酯純度會(huì)逐漸降低?？赡苁怯捎趩胃术ズ透视投O性差別不是很大，如果加入過量的甘油二酯洗脫液會(huì)使一部分單甘酯也被洗脫下來而導(dǎo)致單甘酯的純度降低。因此，選擇甘油二酯部分洗脫液體積為12 mL。

固定甘油三酯部分洗脫液體積為14 mL，甘油二酯部分洗脫液體積為12 mL，考察單甘酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 單甘酯部分洗脫液體積對(duì)單甘酯純度的影響

由圖3可看出，當(dāng)單甘酯部分洗脫液體積小于10 mL時(shí)，隨著洗脫液體積的增加所得單甘酯的純度逐漸升高，當(dāng)單甘酯部分洗脫液體積為10 mL時(shí)，單甘酯純度達(dá)到最大值95%，但隨著單甘酯部分洗脫液體積的增加，收集的單甘酯純度變化不明顯。此外，過多的溶劑添加會(huì)致使溶劑、能源的浪費(fèi)，由此也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。因此，綜合考慮選擇單甘酯部分洗脫液體積為10 mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品高溫氣相色譜圖(見圖4～圖7)

圖4 油酸標(biāo)準(zhǔn)品高溫氣相色譜圖

由圖4分析可以得出，高溫氣相色譜圖中游離脂肪酸出峰時(shí)間為4.2 min，因此按照氣相色譜出峰規(guī)律可知4.2 min之前的均為游離脂肪酸。

圖5 油酸甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)品高溫氣相色譜圖

由圖5分析可以得出，高溫氣相色譜圖中油酸甘油一酯出峰時(shí)間為5.1 min，因此按照氣相色譜出峰規(guī)律可知4.2～5.1 min之間的為單甘酯。

圖6 油酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品高溫氣相色譜圖

由圖6分析可以得出，高溫氣相色譜圖中油酸甘油二酯出峰時(shí)間為14.6 min，因此按照氣相色譜出峰規(guī)律可知5.1～14.6 min之間的為甘油二酯。

圖7 油酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品高溫氣相色譜圖

由圖7分析可以得出，高溫氣相色譜圖中油酸甘油三酯出峰時(shí)間為24 min之后，因此按照氣相色譜出峰規(guī)律可知24 min之后的為甘油三酯。

2.4 經(jīng)Florisil 固相萃取柱分離所得的單甘酯部分高溫氣相色譜圖(見圖8)

圖8 經(jīng)Florisil固相萃取柱分離所得單甘酯部分高溫氣相色譜圖

對(duì)比分析圖4～圖7中FFA、MAG、DAG、TAG標(biāo)準(zhǔn)品的高溫氣相色譜圖，由圖8可以看出，高溫氣相色譜分析經(jīng)Florisil固相萃取柱分離酶解產(chǎn)物所得的sn-2位單甘酯，不僅在TAG位置上沒有出現(xiàn)響應(yīng)，并且DAG、FFA含量也很微小，僅占不足5%，得到的MAG純度可達(dá)到95%，由此得出Florisil固相萃取法可作為與氣相色譜法高效分析sn-2位脂肪酸相配套的前處理方法。

2.5 Florisil固相萃取法分離氣相色譜法測(cè)定不同油脂sn-2位脂肪酸分布

應(yīng)用Florisil固相萃取柱分離純化不同油脂酶解產(chǎn)物中的sn-2位單甘酯，通過氣相色譜法分析得到總脂肪酸及sn-2位脂肪酸組成及含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過表2計(jì)算可知，芝麻油、大豆油、花生油、菜籽油、橄欖油、葵花籽油、牡丹籽油總脂肪酸中不飽和脂肪酸含量分別為85.52%、84.10%、82.06%、93.82%、86.75%、84.94%、91.33%，sn-2位不飽和脂肪酸含量分別為 96.83%、98.05%、94.61%、99.00%、94.25%、98.10%、95.89%，該結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果一致[12-14]。由此表明植物油中不飽和脂肪酸主要集中在sn-2位。芝麻油、大豆油、花生油、菜籽油、橄欖油、葵花籽油、牡丹籽油總脂肪酸中油酸含量分別為37.51%、23.02%、46.68%、25.62%、72.48%、17.55%、20.57%，亞油酸含量分別46.82%、53.85%、33.56%、16.83%、12.87%、67.10%、26.88%；而sn-2位油酸含量分別為 41.84%、25.38%、53.71%、36.38%、81.84%、19.38%、31.04%，sn-2位亞油酸含量分別為54.67%、65.79%、39.37%、35.72%、11.86%、78.72%、28.54%，用這種方法測(cè)定的結(jié)果表明植物油中的油酸、亞油酸大部分與甘油的sn-2位羥基結(jié)合，而芝麻油、大豆油、花生油等中的花生酸(C20∶0)、山崳酸(C22∶0)在sn-2位未檢測(cè)到，菜籽油中的sn-2位芥酸(C22∶1)占總芥酸含量的13.36%，說明一些稀有脂肪酸如C20及C22多集中在sn-1,3位，這與文獻(xiàn)記載一致[1]。并且通過SPSS 20軟件對(duì)Florisil固相萃取法和傳統(tǒng)TLC法得到的sn-2位單甘酯脂肪酸組成進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明二者不存在顯著性差異。

表2 Florisil固相萃取法與薄層色譜法(TLC)測(cè)定不同油脂中sn-2位脂肪酸組成及含量 %

注：“-”表示未檢出，“TFA”表示總脂肪酸，“TUFA”表示總不飽和脂肪酸。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)分別考察了胰脂酶添加量對(duì)甘油三酯酶解程度的影響以及洗脫液的體積對(duì)所收集單甘酯純度的影響。結(jié)果表明：油脂取樣量為30 mg,在不影響sn-2位?；那闆r下，脂肪酶添加量為30 mg時(shí)，甘油三酯酶解程度最大；甘油三酯洗脫液體積、甘油二酯洗脫液體積、單甘酯洗脫液體積分別為14、12、10 mL時(shí)，經(jīng)Florisil 固相萃取收集所得sn-2位單甘酯純度最高；高溫氣相色譜法檢測(cè)分析該方法分離4種產(chǎn)物甘油三酯、甘油二酯、單甘酯及游離脂肪酸的分離效果，結(jié)果表明該方法能將sn-2位單甘酯與甘油三酯、甘油二酯及游離脂肪酸有效分離，分離得到的目標(biāo)產(chǎn)物單甘酯純度可達(dá)到95%；Florisil固相萃取法所得sn-2位脂肪酸組成與傳統(tǒng)薄層色譜方法所得sn-2位脂肪酸進(jìn)行對(duì)比，二者測(cè)定結(jié)果不存在顯著性差異，且Florisil固相萃取柱操作簡(jiǎn)單、結(jié)果受環(huán)境影響因素較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，因此可作為與氣相色譜分析相配套的高效前處理方法，以測(cè)定油脂中 sn-2 位(β位)脂肪酸組成及含量。

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Separation of sn-2 monoacylglycerol by solid phase extraction column method

YANG Yaxin1, WANG Xuede1, ZHENG Yongzhan2

(1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001,China； 2.Sesame Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450008, China)

A pretreatment method matching with gas chromatographic was found to high-efficiently analyze sn-2 fatty acid composition in oil. The effect of dosage of pancreatic lipase on the enzymolysis degree of triglyceride was investigated and the conditions of separation and purification of sn-2 monoacylglycerol in enzymatic hydrolysis product were optimized using a Florisil solid phase extraction column. The ability of Florisil solid phase extraction column separating sn-2 monoacylglycerol was analyzed by high temperature gas chromatography method. The results showed that the purity of sn-2 monoacylglycerol separated by Florisil solid phase extraction column could reach 95%. The sn-2 fatty acids compositions of seven kinds of common oils were analyzed by gas chromatography method, and the results showed that there was no significant differences between the compositions of sn-2 fatty acids obtained by Florisil solid phase extraction method and traditional thin layer chromatography (TLC).

oil; sn-2 monoacylglycerol; enzymolysis; thin layer chromatography; Florisil solid phase

2016-07-28；

2016-12-12

國(guó)家(農(nóng)業(yè))公益行業(yè)專項(xiàng)(201303072-2)；國(guó)家“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)”專項(xiàng)資金(CAR15-1)

楊雅新(1990)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛椭c植物蛋白工程(E-mail)1606844615@qq.com。

汪學(xué)德，教授(E-mail)wangxuede1962@126.com;鄭永戰(zhàn)，研究員(E-mail)sesame168@163.com。

TS225.1;TQ646

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1003-7969(2017)04-0041-06