血腦屏障滲透性改變的細胞和分子機制研究進展

朱 安，王 旗，2，3

（1.北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系，北京 100191；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點研究室，北京 100191；3.食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191）

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）位于外周血液循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）之間，由內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、周細胞、基膜組成，細胞之間連接緊密且屏障中含有大量代謝酶和外排轉運體。BBB的特性使病毒、炎癥因子和重金屬等神經(jīng)毒性物質(zhì)難以進入并蓄積在腦組織，對維持CNS的正常生理功能具有重要意義。然而，以CNS為預期靶標的治療性化合物中98%因理化特性限制而無法穿過BBB，對CNS藥物的開發(fā)和應用帶來挑戰(zhàn)。本文主要對影響B(tài)BB滲透性的細胞和分子機制研究進展予以綜述。

1 細胞和基膜

1.1 腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）

BMEC表達多種特異性生物標志物（表1），可用于細胞鑒定和功能監(jiān)測。Xu等［1］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元釋放的包含miR-132的外泌體可促進血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-鈣黏蛋白）的表達，從而維持腦血管的完整性。BMEC表達少量的黏附分子，使白細胞黏附于血管壁并發(fā)揮免疫作用。在腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的神經(jīng)炎癥模型中，BMEC與白細胞的黏附性受趨化因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和氧化應激的調(diào)控［2］。每平方微米腦毛細血管內(nèi)皮含有10～14個囊泡，是心肌毛細血管的14倍，提示BMEC經(jīng)胞吞作用的大分子物質(zhì)轉運較活躍。癲癇等病理狀態(tài)下，BMEC中囊泡數(shù)量上升導致的胞吞作用增強是BBB紊亂的主要原因，吲哚美辛等藥物可通過減少囊泡數(shù)量維持BBB的功能穩(wěn)定性。此外，與腦室相鄰的下丘腦正中隆起、腦下垂體、脈絡叢和松果體中，BMEC上存在直徑40～60 nm的圓形窗孔，窗孔被帶電荷的隔膜封閉，使血液與腦組織可交換非極性小分子。透射電鏡下可見BMEC之間存在寬約4 nm的裂隙，裂隙間存在連接蛋白；且內(nèi)皮細胞表達的分子呈現(xiàn)極性分布，可限制極性分子以及超過400 ku的大分子通過［3］。

表1 內(nèi)皮細胞標志物

1.2 星形膠質(zhì)細胞

星形膠質(zhì)細胞足突能夠誘導BBB的緊密連接（tight junction，TJ）形成，膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、谷氨酸轉運體和S100β是其最常見的特異性標志物。近年有研究報道，乙醛脫氫酶1蛋白家族L1作為新應用的鼠類灰質(zhì)和白質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物，在胞體和突起中均能著色，原位雜交和免疫組化的切片染色效果優(yōu)于GFAP［4］。星形膠質(zhì)細胞釋放的轉化 生 長 因 子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、IL-6、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和堿性成纖維細胞生長因子可改變BMEC的屏障特征，而BMEC釋放的白血病抑制因子可誘導星形膠質(zhì)細胞分化［5］。星形膠質(zhì)細胞足突上高度表達水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）。在病理條件下，AQP4表達障礙、排列紊亂，導致水分子跨膜轉運功能受阻［6］。AQP4基因敲除小鼠的星形膠質(zhì)細胞GFAP表達下調(diào)，足突腫脹，BMEC的TJ表達下調(diào)，血管周的足突覆蓋面積下降，最終導致BBB通透性升高［7］。目前發(fā)現(xiàn)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)向整流K+通道有Kir2.1，2.3，3.1，4.1和5.1。細胞外間隙K+濃度升高時，Kir4.1開放使K+進入星形膠質(zhì)細胞并轉運至血管內(nèi)，從而清除細胞外高濃度K+［8］。

1.3 小膠質(zhì)細胞

小膠質(zhì)細胞的鑒定主要采用離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）免疫染色［9］。腦缺血和神經(jīng)炎癥等病理條件下，Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等通路可單獨或協(xié)同激活小膠質(zhì)細胞，促使細胞因子分泌和組織相容性抗原表達，從而發(fā)揮吞噬和抗原呈遞作用［10］。小膠質(zhì)細胞具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護的雙重作用。腎上腺素誘導的BBB開放模型中，IgG可以從血漿進入腦組織并激活小膠質(zhì)細胞Fcγ受體Ⅰ/脾酪氨酸激酶通路，促進下游抑炎因子IL-4和IL-10分泌［11］。Yenari等［12］在BMEC和星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)BBB模型中加入小膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)總體系中乳酸脫氫酶活性增強，細胞死亡數(shù)量上升；小膠質(zhì)細胞活化抑制劑米諾環(huán)素可明顯改善上述細胞毒性，減少小膠質(zhì)細胞在損傷區(qū)域的過度聚集，從而降低腦梗死區(qū)域體積并減少神經(jīng)功能缺陷。小膠質(zhì)細胞TLR4通路活化后過量分泌TNF-α，可致MDCK細胞TJ蛋白密封蛋白1（claudin-1）表達下調(diào)，閉鎖小帶蛋白1（zonula occluden 1，ZO-1）結構斷裂產(chǎn)生碎片［13］。

1.4 周細胞

周細胞覆蓋22%～32%的腦毛細血管外腔，其常用標志物有血小板衍生生長因子受體β（plateletderived growth factor receptor-β，PDGFR-β），CD13和Kir6.1［14］。周細胞可表達多種TJ蛋白和轉運蛋白［15］。周細胞與BMEC經(jīng)PDGF/PDGFR-β通路相互黏附，且均能通過分泌TGF-β1抑制成熟血管壁細胞的遷移，從而維持BBB的屏障特性［16］。周細胞可抑制共培養(yǎng)BMEC組織纖溶酶原激活劑的表達，但增強Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子的表達，即周細胞通過負向調(diào)節(jié)BMEC纖維蛋白溶解來維持血管壁完整性［17］。Gerhardt等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在血管形成期，阻斷周細胞與BMEC間的神經(jīng)鈣黏蛋白，可致周細胞黏附性下降、血管生成障礙或異位，甚至發(fā)生腦部大出血。腦缺血狀態(tài)下，周細胞通過縮緊BMEC使毛細血管直徑降低并維持血流，但周細胞死亡數(shù)量急劇增加，最終導致BBB結構破壞［19］。周細胞功能缺陷的PDGF基因敲除小鼠中，BBB對水和小分子量示蹤劑的通透性顯著上升［20］。PDGFR-β+/-轉基因小鼠的大腦皮質(zhì)和海馬的滲透性表面產(chǎn)物升高，TJ蛋白ZO-1和閉合蛋白（occludin）表達下調(diào)，腦組織中堆積的神經(jīng)毒性和血管毒性物質(zhì)無法清除［21］。

1.5 BBB的內(nèi)側血管基膜

BBB的內(nèi)側血管基膜主要由BMEC和周細胞分泌，含有層粘連蛋白411（laminin α4β1γ1，LN411）和LN511；外側實質(zhì)基膜由星形膠質(zhì)細胞分泌，含有LN111和LN211?；ぶ饕煞諰N、Ⅳ型膠原和纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等［22-23］。機體發(fā)生炎癥時，細胞外基質(zhì)中斷裂的透明質(zhì)酸等可激活白細胞TLR通路，分泌TNF和TGF-β并調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和趨化因子的表達，從而激活免疫系統(tǒng)并重塑細胞外基質(zhì)［24］。LN411-/-轉基因小鼠中，LN511可在脈管系統(tǒng)中穩(wěn)定表達并通過整合素α6β1使T淋巴細胞無法進入腦組織，在機體炎性反應時，維持CNS穩(wěn)定性［25］。Savettieri等［26］研究報道，Ⅳ型膠原能上調(diào)BMEC中TJ蛋白閉合蛋白的mRNA表達。Tilling等［27］研究發(fā)現(xiàn)，采用Ⅳ型膠原、LN和FN單獨包被培養(yǎng)板能提高BMEC細胞培養(yǎng)體系的跨膜電阻（trans-epithellal electric resistance，TEER）。此外，LN111通過整合素α2調(diào)節(jié)周細胞分化，使其表達少量PDGFR-β和收縮蛋白。LN基因敲除小鼠中，周細胞PDGFR-β和收縮蛋白表達上調(diào)，包被周細胞的基膜破碎分散，腦實質(zhì)伊文思藍染色的熒光強度高于對照組，轉運體AQP4、連接蛋白閉合蛋白和密封蛋白5表達下調(diào)［28］。

2 影響B(tài)BB滲透性的重要蛋白分子

2.1 緊密連接

2.1.1 閉合蛋白

閉合蛋白主要存在于CNS內(nèi)皮細胞，相對分子質(zhì)量為65 ku。閉合蛋白結構見圖1，其通過細胞外環(huán)（extracellular loop，EL）與相鄰細胞形成閉合蛋白-閉合蛋白二聚體，在細胞間隙中形成TJ。COOH端含有磷酸化位點，經(jīng)信號轉導參與BMEC滲透性調(diào)節(jié)。敲除閉合蛋白的NH2端后，細胞的TJ蛋白缺失嚴重，滲透系數(shù)（permeability coefficient，Pe）和TEER異常。但也有研究顯示，閉合蛋白-/-基因敲除小鼠BBB中TJ形態(tài)和屏障功能正常，可能是其他TJ蛋白代償表達所致；該研究同時觀察到基底核和小腦中出現(xiàn)鈣、磷化合物片狀沉積，微靜脈和毛細血管管壁可見鈣點狀沉積，提示閉合蛋白參與腦組織鈣、磷離子轉運調(diào)節(jié)［29］。BMEC中β分泌酶過量并抑制閉合蛋白表達，該過程對淀粉樣腦血管病的發(fā)生起重要作用［30］。外傷性腦損傷時，過表達的軸突導向因子可上調(diào)閉合蛋白表達，維持TJ結構完整性，減少外源性物質(zhì)的細胞旁路滲透［31］。閉合蛋白參與BMEC細胞分化和信號傳導。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factors，VEGF）可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號通路，致使閉合蛋白磷酸化并影響B(tài)MEC滲透性。

2.1.2 密封蛋白

目前發(fā)現(xiàn)的密封蛋白家族有27種蛋白亞型，序列一致性為12.5%～69.7%，相對分子質(zhì)量20～34 ku。密封蛋白結構（圖1）與閉合蛋白類似，但無序列同源性［32］。哺乳動物BBB中主要表達密封蛋白5，也可表達少量的密封蛋白1，2，3，11，12和18。密封蛋白對維持BBB結構和功能穩(wěn)定具有重要作用，其表達異常與腦腫瘤、阿爾茨海默癥等多種CNS疾病有關［33］。密封蛋白5的基因和蛋白表達受性別決定區(qū)Y盒蛋白18調(diào)控［34］。發(fā)生缺血性腦損傷時，密封蛋白5-/-可被MMP-9降解，導致BBB通透性升高。密封蛋白5-/-小鼠腦組織中未見出血和水腫，BMEC形態(tài)正常，但對相對分子質(zhì)量＜800 ku的小分子物質(zhì)的通透性升高［35］。近年有研究表明，密封蛋白參與細胞應激、胞內(nèi)Ca2+吸收、腸道穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和胚胎形態(tài)發(fā)生等過程［36-37］。

圖1 閉合蛋白和密封蛋白結構.閉合蛋白和密封蛋白亞型的NH2端、COOH端、跨膜區(qū)（TM）和細胞外環(huán)所含的氨基酸數(shù)量不同.

2.1.3 Tricellulin

Tricellulin（TRIC）蛋白表達于BMEC和星形膠質(zhì)細胞，含有TRIC-a，a1，b和c 4種亞型，相對分子質(zhì)量分別為64，62，54和52 ku，可通過EL2形成TRIC-TRIC多聚肽，也可形成TRIC-閉合蛋白雜聚肽［38］。TRIC主要存在于3個細胞間，限制4～10 ku大分子物質(zhì)轉運，但不影響離子滲透性；極少量存在于2個細胞間，調(diào)節(jié)不同大小的溶質(zhì)轉運。在敲除閉合蛋白的細胞中，大量TRIC錯位分布于2個細胞間［39］。質(zhì)粒轉染的TRIC低表達細胞中，Pe顯著升高。重金屬鉛暴露可下調(diào)腦組織TRIC蛋白表達，且通透性升高，轉染高表達TRIC質(zhì)粒可使屏障功能恢復正常。機體炎性反應時，TRIC蛋白表達下調(diào)，而密封蛋白2蛋白表達上調(diào)，TEER降低且Pe升高。采用IL-13處理細胞或染毒大鼠均可觀察到與炎性反應一致的結果。IL-13通過多種途徑影響B(tài)BB中TJ蛋白表達，經(jīng)IL-13R2α受體激活c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2）通路并下調(diào)TRIC表達；經(jīng)IL-13R1α和IL-4Rα受體活化絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、信號轉導和轉錄激活因子6（signal transducers and activator of transcription 6，STAT6）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K）通路并上調(diào)密封蛋白2表達［40］。

2.1.4 連接黏附分子

連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAM）含JAM-A，B，C，4和L 5種亞型，其中JAM-A主要表達于內(nèi)皮細胞、上皮細胞和白細胞，相對分子質(zhì)量為32 ku［41］。JAM（圖2）通過2個Ig樣EL形成同源性TJ，經(jīng)磷酸化位點參與PI3K和Ras/Raf/MAPK等通路的調(diào)控［42］。在內(nèi)皮細胞表面，JAM-A與整合素αvβ3形成蛋白復合物，促使堿性成纖維細胞生長因子激活MAPK信號通路，從而參與血管生成［43］。促炎因子TNF-α和IFN-γ單獨作用時可促使黏附分子跨膜遷移并黏附于內(nèi)皮細胞，但兩者共同處理細胞時，細胞連接處的JAM-A消失但總量未發(fā)生改變，提示JAM-A重分布［44］。JAM-A的D2區(qū)可結合整合素αLβ2的β2亞基，介導T細胞、白細胞的跨內(nèi)皮細胞轉運和黏附［45］。BV11單克隆抗體可阻斷該轉運過程，但不影響D1區(qū)同源二聚體的形成和細胞旁路的物質(zhì)轉運。

圖2 連接黏附分子蛋白結構.

2.1.5 閉鎖小帶蛋白

ZO包括ZO-1，ZO-2和ZO-33種亞型，相對分子質(zhì)量分別為220，160和130 ku。由圖3可見，ZO-1蛋白包含多個功能性結構域，可結合不同的蛋白發(fā)揮多種生理功能［46］。BMEC中的吞蛋白1（endophilin-1，Endo-1）可通過表皮生長因子受體-ERK1/2通路調(diào)節(jié)ZO-1表達，Endo-1過表達可抑制ZO-1并增強細胞旁路滲透，短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾Endo-1表達后，ZO-1表達升高且細胞旁路滲透性降低［47］。Tornavaca 等［48］采用小干擾 RNA（siRNA）沉默微血管內(nèi)皮細胞和小鼠ZO-1表達，發(fā)現(xiàn)細胞在愈合遷移實驗中的移動性下降，纖維凝膠血管生成實驗中血管芽數(shù)量少且長度短，小鼠皮下種植的基質(zhì)凝膠中血管生成量低于野生型對照組；同時發(fā)現(xiàn)，ZO-1缺失可使肌球蛋白IIA和β肌動蛋白重分布，進一步導致連接力傳導因子黏著斑蛋白和P21激活激酶表達下調(diào)，黏著斑蛋白與α-聯(lián)蛋白（α-catenin）VE-鈣黏蛋白復合物分離，連接蛋白VE-鈣黏蛋白的張力降低，最終導致細胞間連接力降低。此外，ZO-1可通過Ras/Raf/MAPK通路介導細胞信號轉導。

2.2 黏附連接

2.2.1 血管內(nèi)皮鈣黏蛋白

VE-鈣黏蛋白僅表達于血管內(nèi)皮細胞，通過5個EL形成同源性TJ，經(jīng)TGF-βR和PI3K等信號通路參與功能調(diào)節(jié)［49］。在血管生成和成熟過程中，整合素β1可介導VE-鈣黏蛋白在內(nèi)皮細胞中的定位及黏附連接（adherens junction，AJ）形成［50］。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3可促進Rac1活性，以此維持VE-鈣黏蛋白/β-聯(lián)蛋白復合物與肌動蛋白細胞骨架的連接［51］。VE-鈣黏蛋白的COOH端有9個磷酸化位點，其中Y654，Y658，Y685，Y731和Y733參與BBB緊密性調(diào)節(jié)［52］。鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流時，血管內(nèi)皮細胞的Pyk2被激活，誘導VE-PTP的酪氨酸磷酸化并結合Src，活化的Src進一步誘導VE-鈣黏蛋白磷酸化，最終導致內(nèi)皮滲透性升高。此外，VEGF和LPS等可使VE-PTP與VE-鈣黏蛋白分離，導致血管滲透性降低，白細胞外滲［53］。

2.2.2 血小板內(nèi)皮細胞黏附分子

血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）存在于內(nèi)皮細胞、血小板和白細胞中，相對分子質(zhì)量為130 ku［54］，其蛋白結構見圖4。PECAM-1基因第3外顯子C+373G的Leu125Val突變可影響其蛋白同源二聚體的形成，是引發(fā)中國人群血管病變的重要遺傳易患因素［55］。PECAM-1調(diào)控β-聯(lián)蛋白在內(nèi)皮細胞中的定位及其磷酸化水平，也可將γ-聯(lián)蛋白募集至血管內(nèi)皮細胞間連接處以維持自身在細胞骨架中的穩(wěn)定性。PECAM-1刺激整合素α6β1，α4β1，β2和α2bβ3的表達，促進中性粒細胞跨過內(nèi)皮細胞和基底膜進行遷移，參與免疫、炎癥和愈合等過程［56］。在基質(zhì)衍生因子刺激下，PECAM-1-/-小鼠的成熟巨核細胞因缺失基質(zhì)衍生因子受體CXCR4而無法發(fā)生遷移［57］。PECAM-1可與整合素β3形成異源性復合物，促進腦血管發(fā)生。PECAM-1可感應BMEC的流體剪切應力、滲透壓休克等機械力變化，使Tyr-663和Tyr-686磷酸化并結合SHP-2，激活Ras-d/2和JNK通路，引起胞核內(nèi)相關基因表達變化［58］。此外，PECAM-1上調(diào)抗凋亡蛋白胱天蛋白酶3，Bcl-2、A1和STAT的表達，抑制凋亡通路PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），由此調(diào)控腦血管細胞凋亡［59］。

圖3 閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）蛋白結構示意圖.ZO-1包含1745個氨基酸，劃分為5個功能性結構域和1個脯氨酸富集區(qū)，通過結合不同的蛋白發(fā)揮相應的生理功能.PDZ：突觸后密度蛋白PSD-95/果蠅腫瘤抑制蛋白DLG-A/ZO-1；SH3：Src同源結構域3；GUK：鳥苷酸激酶結構域；JAM：連接黏附因子；ZAK：緊密連接相關激酶.

圖4 血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（PECAM-1）蛋白結構.EL6可增強EL1和EL2介導的同源性結合力，免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）結構域包含2個酪氨酸磷酸化位點.EL：細胞外環(huán).

2.3 轉運體

2.3.1 離子轉運體

TJ和AJ嚴格限制了BBB的細胞旁路運輸，僅O2、CO2和小分子質(zhì)量脂質(zhì)分子可自由通過，BMEC上的Na+-K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-、Na+-HCO3-共轉運體、Na+/H+和Na+/Ca2+交換體為離子轉運提供了通道。Na+-K+-ATP酶在腦中含量較高，在酶構象的快速改變過程中消耗1個ATP能量，完成3個Na+和2個K+的主動轉運［60］。Na+-K+-2Cl-依靠Na+-K+-ATP酶產(chǎn)生的Na+濃度差勢能將1個Na+，1個K+和2個Cl-同向轉運至胞內(nèi)。細胞內(nèi)的碳酸酐酶將CO2和H2O轉化為H+和HCO3-，細胞膜外側的Na+/H+交換體將H+排出胞外，Na+交換進入胞內(nèi)。Na+/Ca2+交換體介導Na+內(nèi)流、Ca2+外排（Na+∶Ca2+=3∶1）的前向模式和Na+外排、Ca2+內(nèi)流（Na+∶Ca2+=1∶1）的反向模式［61］。此外，金屬轉運蛋白和AQP4等參與BBB中Hg2+，Zn2+，Pb2+，F(xiàn)e2+和Mn2+等離子轉運［62］。離子轉運體協(xié)同作用可維持細胞滲透壓、pH和膜電位穩(wěn)定。

BBB毛細血管管腔側和基底膜側可表達多種溶質(zhì)載體蛋白，主要包括單羧酸轉運蛋白（monocarboxylate transporter，MCT）、有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP）、有機陰離子轉運體（organic anion transporter，OAT）和有機陽離子轉運體（organ cation transporter，OCT）［63］。MCT雙向轉運青霉素和水楊酸等一元羧酸藥物。OATP介導BBB代謝物外排及普伐他?。╬ravastatin）和非索非那定（fexofenadine）等藥物攝取，牛膽酸為其活性抑制劑。OAT轉運環(huán)磷腺苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)、抗癲癇藥和抗病毒藥等，西咪替?。╟imetidine）可抑制OAT的活性。OCT可轉運神經(jīng)毒素和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)，也可轉運地昔帕明（desipramine）和奎尼?。╭uinidine）等外源性藥物，甲非他明（methamphetamine）可抑制OCT的活性。

2.3.2 分子轉運體

ABC轉運體（ATP-binding cassette transporter）是BBB最重要的脂溶性分子外排轉運體，分為ABC A～H共8種亞型，依靠ATP水解產(chǎn)生的能量排出有害物質(zhì)，減少藥物等在腦組織中的蓄積，但也增加了CNS靶向藥物的給藥難度［64］。目前研究較多的ABC轉運體有P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp，ABCB1）、多藥耐藥蛋白（multidrug resistance protein，MRP，ABCC）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP，ABCG2），3 種蛋白均高表達于腦毛細血管內(nèi)腔側［65］。TNF-α/PKCβ/磷酸鞘氨醇1受體1型通路可通過調(diào)控ET受體和一氧化氮信號分子使P-gp活性增強，而VEGF通過激活flk-1及其下游Src激酶使陷窩蛋白（caveolin)-1磷?；罱K降低P-gp活性。雌激素受體通路可激活PI3K，GSK，PTEN和AKT等信號分子，分解BCRP轉運蛋白［66］。帕金森病、阿爾茨海默癥、抑郁癥和癲癇等疾病中，P-gp，MRP和BCRP均表達異常。此外，BBB中存在大量葡萄糖轉運體、氨基酸載體和胰島素受體等轉入蛋白為腦組織提供營養(yǎng)物質(zhì)［67］。

3 BBB滲透性影響因素

機體的年齡、體溫、血液酸堿度和內(nèi)分泌系統(tǒng)差異可影響B(tài)BB滲透性，但難以通過內(nèi)源性因素的控制來提高CNS治療性藥物的藥效。利用BBB滲透性改變的細胞和分子機制，在藥物設計階段對分子理化特征加以優(yōu)化，結合生物學新材料和新技術的應用，可突破常規(guī)的劑型和轉運限制，大幅度提高藥物在腦組織中的蓄積量，降低對外周系統(tǒng)的潛在毒性風險。

3.1 藥物的理化特征

BBB高滲透性藥物分子通常具有的理化特征包括：相對分子質(zhì)量＜400；極性表面積＜80 ?2；截面積＜70 ?2；脂溶性好；含少量正電荷；氫鍵供體較少，氮、氧原子總數(shù)≤5；辛醇/水分配系數(shù)為1～3［68］。目前，藥物定量構效關系研究充分考慮了分子理化特性對BBB滲透性的影響，已出現(xiàn)多種相關性較高的BBB滲透性預測方程。CNS靶向藥物設計時，可將有效成分進行酯化、酰胺化，增強其脂溶性，但同時會增加藥物的毒副作用。此外，可在遞藥系統(tǒng)表面修飾正電荷，與BBB膜表面陰離子結合，誘導胞吞轉運。Rousselle等［69］采用帶正電荷、含疏水殘基的SynB1與抗癌藥多柔比星制成SynB1-多柔比星復合物，對大鼠頸動脈原位灌注后發(fā)現(xiàn)，穿透BBB并轉運到腦實質(zhì)的多柔比星含量高于對照組20倍。

3.2 RNA干擾

RNA干擾可通過誘導BBB關鍵分子的mRNA在體內(nèi)降解，導致轉錄后基因沉默，從而使屏障相關蛋白無法表達。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系和BMEC共培養(yǎng)體系中，采用shRNA沉默維持屏障特性和血管發(fā)生的Robo4，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZO-1和閉合蛋白的Scr和ERK1/2通路被激活，分解密封蛋白5的MMP-9表達上調(diào)，ZO-1、閉合蛋白和密封蛋白5蛋白表達均下調(diào)且TEER降低，BBB滲透性升高有利于抗癌藥物進入腦組織［70］。采用siRNA沉默MDCK細胞的ZO-1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)閉合蛋白、密封蛋白和扣帶蛋白下調(diào)，TEER降低且Pe升高，粒徑＜4 ?的溶質(zhì)滲透性增強［71］。在BMEC細胞培養(yǎng)體系和C57/B16小鼠中，均采用siRNA同時抑制閉合蛋白和密封蛋白5，結果可見，BMEC的TEER降低且Pe升高，右旋糖酐（3 ku）轉運增強，而凝集素（10 ku）轉運無明顯變化；小鼠腦組織中β淀粉樣蛋白經(jīng)細胞旁路的排出量增加，在腦組織與血漿中的濃度比值下降，最終使小鼠空間記憶水平升高［72］。

3.3 模擬肽

外源性肽經(jīng)口服后在體內(nèi)被大量降解代謝，且肽類分子的柔性使其以多種構象被非藥效受體識別后產(chǎn)生毒副作用。此外，外源性肽難以穿透BBB，無法有效治療CNS疾病。為克服天然肽的自身缺陷，可設計短鏈多肽并對其結構進行改造或替換以制成模擬肽，提高肽類藥物的生物學活性。

模擬密封蛋白1所設計的C1C2模擬肽可被細胞囊泡攝取。采用C1C2處理MDCK細胞。結果可見，密封蛋白和閉合蛋白的細胞內(nèi)定位增加，細胞膜上形成的TJ不連續(xù)。C1C2處理BMEC可致其TEER降低且呈時間-效應關系，熒光黃（0.4 ku）和右旋糖酐（3 ku）的轉運均增強［73］。給Wistar大鼠注射C1C2模擬肽可下調(diào)神經(jīng)組織中密封蛋白的mRNA和蛋白表達［74］。C1C2對BBB滲透性的影響與密封蛋白和閉合蛋白在細胞內(nèi)重新分布定位有關。

小帶毒素（ZO toxin，Zot）是霍亂弧菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，可結合蛋白酶活化受體2，導致TJ屏障短暫性開放。以Zot為基礎設計的AT1002模擬肽包含Zot活性域，但其在體內(nèi)易形成半胱氨酸-半胱氨酸二聚體，且在中性和弱堿性介質(zhì)中失活，限制了AT1002的使用和療效。為此，采用烯丙基甘氨酸替代2號位的半胱氨酸可減少二聚體形成，或采用5%右旋葡萄糖預處理AT1002使其在中性介質(zhì)中維持活性長達6 h，保留AT1002的TJ屏障調(diào)節(jié)能力并提升利用價值。AT1002可使Caco-2和BMEC的TEER降低，白蛋白（65 ku）和熒光素（376 u）的轉運增強，與ZO-1和閉合蛋白在細胞內(nèi)重新分布定位有關［75］。

3.4 納米材料

納米材料能夠以被動擴散、轉胞吞和跨細胞間隙等方式穿透BBB。治療藥物包被于病毒、脂質(zhì)、聚合物和陶瓷等納米載體，以特洛伊木馬方式進入細胞，解體并釋放內(nèi)含藥物。用于診斷和追蹤的納米顆粒包括熒光納米球和磁納米顆粒等，通過成像技術觀察靶標中納米顆粒的富集程度。Kolter等［76］制備了Tween-80表面活性劑修飾的酯類載藥納米顆粒，處理BMEC可致其TEER降低且呈時間-效應和濃度-效應關系，低于3 h和500 mg·L-1時不影響B(tài)MEC的代謝活性和細胞活性，炎癥因子和趨化因子的表達水平無明顯變化，肝、腎、血液功能均未見異常。納米材料應用時需嚴密監(jiān)測其可能導致的毒性。SD大鼠BMEC和星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中，通過透射電鏡可見到納米銀致BMEC的TJ連接斷裂、細胞間隙增寬、細胞空泡化、細胞器壞死、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒并解聚和線粒體腫脹等損傷［77］。

3.5 高頻聚焦超聲

高頻聚焦超聲（high-frequency focused ultra-sound，HIFU）利用超聲的組織穿透性、定位性和能量沉積性，通過熱效應、空化效應和機械效應使靶標部位吸收能量快速升溫。de Smet等［78］采用HIFU加熱大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤至42℃，經(jīng)尾靜脈注射包裹化療藥物多柔比星的溫度敏感脂質(zhì)體，脂質(zhì)體開放釋出藥物，7 d后神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的多柔比星含量顯著高于空白對照組，同時血藥濃度低于對照組。Park等［79］發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織經(jīng)HIFU干擾后，腦組織中阿霉素的容量轉移常數(shù)Ktrans顯著高于對照組，且HIFU區(qū)域HE染色切片未見明顯病理損傷?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，HIFU可使內(nèi)源性IgG和IgM抗體穿過BBB并清除腦內(nèi)淀粉樣蛋白斑，為阿爾茲海默癥的治療提供了新思路［72］。

4 展望

隨著分子生物學和醫(yī)學工程的快速發(fā)展，BBB的研究方法不斷改進。體外研究方面，BMEC、星形膠質(zhì)細胞、周細胞、神經(jīng)元等單培養(yǎng)和共培養(yǎng)技術已較為成熟，但靜態(tài)的培養(yǎng)模型缺少血流動力學因素，故模仿流體剪切應力的3D流動模型發(fā)展迅速［80］。同時，可分化為BMEC的干細胞、兼具內(nèi)皮和上皮特性的非腦源性ECV304細胞系，以及無細胞的仿生物膜技術如磷脂膜色譜法、平行人造膜通透性評價法、固體支撐脂質(zhì)膜法等已應用于BBB研究［81］。體內(nèi)研究方面，傳統(tǒng)的電子顯微鏡、功能磁共振成像、正電子發(fā)射型計算機斷層顯像、單光子發(fā)射計算機化斷層顯像、定量放射自顯影等影像技術，以及單次頸動脈注射技術、原位腦灌流技術、腦內(nèi)微透析法等提供了多種BBB研究的方法學選擇［82］。果蠅和斑馬魚等模式生物被引入BBB研究，其中斑馬魚的成本較低，與人類BBB的基因序列同源性高達45%～70%，大部分轉運體、受體等相似，且幼蟲階段的斑馬魚是透明的，適于示蹤性藥物代謝和篩選研究［83］。計算毒理學方面，在神經(jīng)生理和神經(jīng)行為研究結果基礎上，兼顧分子特性和組織差異性的定量構效關系和生理藥代動力學模型廣泛應用，已出現(xiàn)多種BBB內(nèi)向轉運和外向排出的預測方法［84-85］。

與此同時，應認識到現(xiàn)有BBB研究中存在的不足。BBB損傷中的分子起始事件、BBB中各種細胞和分子的相互作用關系、不同腦區(qū)的BBB特征差異、最佳的體外BBB模擬條件等關鍵問題尚未明確。加強BBB滲透性影響因素研究，將為CNS治療性藥物的高效跨屏障轉運和藥效發(fā)揮提供新的思路和方法。

參考文獻：

［1］ Xu B，Zhang Y，Du XF，Li J，Zi HX，Bu JW，et al.Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity［J］.Cell Res，2017，27（7）：882-897.

［2］ O′Carroll SJ，Kho DT，Wiltshire R，Nelson V，Rotimi O，Johnson R，et al.Pro-inflammatory TNFα and IL-1β differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells［J/OL］.J Neuroinflammation，2015，12：131（2015-07-08）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4506411/

［3］ Khanna AK，F(xiàn)arag E.Essentials of Neuroanesthesia［M］.Amsterdam：Elsevier Press，2017：51-58.

［4］ Cahoy JD， Emery B， Kaushal A， Foo LC，Zamanian JL，Christopherson KS，et al.A transcriptome database for astrocytes，neurons，and oligodendrocytes：a new resource for understanding brain development and function［J］.J Neurosci，2008，28（1）：264-278.

［5］ Alvarez JI，Katayama T，Prat A.Glial influence on the blood brain barrier［J］.Glia，2013，61（12）：1939-1958.

［6］ Stokum JA，Kurland DB，Gerzanich V，Simard JM.Mechanisms of astrocyte-mediated cerebral edema［J］.Neurochem Res，2015，40（2）：317-328.

［7］ Zhou J，Kong H，Hua X，Xiao M，Ding J，Hu G.Altered blood-brain barrier integrity in adult aquaporin-4 knockout mice［J］.Neuroreport，2008，19（1）：1-5.

［9］ Guillemin GJ，Brew BJ.Microglia，macrophages，perivascular macrophages，and pericytes：a review of function and identification［J］.J Leukoc Biol，2004，75（3）：388-497.

［10］ da Fonseca AC，Matias D，Garcia C，Amaral R，Geraldo LH，F(xiàn)reitas C，et al.The impact of microglial activation on blood-brain barrier in brain diseases［J/OL］.Front Cell Neurosci，2014，8：362（2014-11-03）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4217497/

［11］ Li YN，Qin XJ，Kuang F，Wu R，Duan XL，Ju G，et al.Alterations of Fc gamma receptorⅠand Toll-like receptor 4 mediate the antiinflammatory actions of microglia and astrocytes after adrenaline-induced blood-brain barrier opening in rats［J］.J Neurosci Res，2008，86（16）：3556-3565.

［12］ Yenari MA，Xu L，Tang XN，Qiao Y，Giffard RG.Microglia potentiate damage to blood-brain barrier constituents：improvement by minocyclinein vivoandin vitro［J］.Stroke，2006，37（4）：1087-1093.

［13］ Poritz LS，Garver KI，Tilberg AF，Koltun WA.Tumor necrosis factor alpha disrupts tight junction assembly［J］.J Surg Res，2004，116（1）：14-18.

［14］ Kamouchi M，Ago T，Kitazono T.Brain pericytes：emerging concepts and functional roles in brain homeostasis［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31（2）：175-193.

［15］ Shimizu F， Sano Y， Maeda T， Abe MA，Nakayama H，Takahashi R，et al.Peripheral nerve pericytes originating from the blood-nerve barrier expresses tight junctional molecules and transporters as barrier-forming cells［J］.J Cell Physiol，2008，217（2）：388-399.

［16］ Sá-Pereira I，Brites D，Brito MA.Neurovascular unit：a focus on pericytes［J］.Mol Neurobiol，2012，45（2）：327-347.

［17］ Kim JA，Tran ND，Li Z，Yang F，Zhou W，F(xiàn)isher MJ.Brain endothelial hemostasis regulation by pericytes［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（2）：209-217.

［18］ Gerhardt H，Wolburg H，Redies C.N-cadherin mediates pericytic-endothelial interaction during brain angiogenesis in the chicken［J］.Dev Dyn，2000，218（3）：472-479.

［19］ Hall CN，Reynell C，Gesslein B，Hamilton NB，Mishra A，Sutherland BA，et al.Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease［J］.Nature，2014，508（7494）：55-60.

［20］ Armulik A，Genové G，M?e M，Nisancioglu MH，Wallgard E，Niaudet C，et al.Pericytes regulate the blood-brain barrier［J］.Nature，2010，468（7323）：557-561.

［21］ Bell RD，Winkler EA，Sagare AP，Singh I，LaRue B，Deane R，et al.Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging［J］.Neuron，2010，68（3）：409-427.

［22］ Daneman R，Prat A.The blood-brain barrier［J/OL］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2015，7（1）：a020412（2015-01-05）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4292164/

［23］ Thomsen MS，Routhe LJ，Moos T.The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2017，37（10）：3300-3317.

［24］ Sorokin L.The impact of the extracellular matrix on inflammation［J］.Nat Rev Immunol，2010，10（10）：712-723.

［25］ Wu C，Ivars F，Anderson P，Hallmann R，Vestweber D，Nilsson P，et al.Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain［J］.Nat Med，2009，15（5）：519-527.

［26］ Savettieri G，Di Liegro I，Catania C，Licata L，Pitarresi GL，D′Agostino S，et al.Neurons and ECM regulate occludin localization in brain endothelial cells［J］.Neuroreport，2000，11（5）：1081-1084.

［27］ Tilling T， Engelbertz C， Decker S， Korte D，Hüwel S，Galla HJ.Expression and adhesive properties of basement membrane proteins in cerebral capillary endothelial cell cultures［J］.Cell Tissue Res，2002，310（1）：19-29.

［28］ Yao Y，Chen ZL，Norris EH，Strickland S.Astrocytic laminin regulates pericyte differentiation and maintains blood brain barrier integrity［J/OL］.Nat Commun，2014，5：3413（2014-03-03）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3992931/

［29］ Saitou M，F(xiàn)uruse M，Sasaki H，Schulzke JD，F(xiàn)romm M，Takano H，et al.Complex phenotype of mice lacking occludin，a component of tight junction strands［J］.Mol Biol Cell，2000，11（12）：4131-4142.

［30］ Cheng X，He P，Yao H，Dong Q，Li R，Shen Y.Occludin deficiency with BACE1 elevation in cerebral amyloid angiopathy［J］.Neurology，2014，82（19）：1707-1715.

［31］ Wen J，Qian S，Yang Q，Deng L，Mo Y，Yu Y.Overexpression of netrin-1 increases the expression of tight junction-associated proteins，claudin-5，occludin，and ZO-1，following traumatic brain injury in rats［J］.Exp Ther Med，2014，8（3）：881-886.

［32］ Gupta IR，Ryan AK.Claudins：unlocking the code to tight junction function during embryogenesis and in disease［J］.Clin Genet，2010，77（4）：314-325.

［33］ Cardoso FL，Brites D，Brito MA.Looking at the blood-brain barrier：molecular anatomy and possible investigation approaches［J］.Brain Res Rev，2010，64（2）：328-363.

［34］ Fontijn RD，Volger OL，F(xiàn)ledderus JO，Reijerkerk A，de Vries HE，Horrevoets AJ.SOX-18 controls endothelial-specific claudin-5 gene expression and barrier function［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294（2）：H891-H900.

［35］ Nitta T，Hata M，Gotoh S，Seo Y，Sasaki H，Hashimoto N，et al.Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice［J］.J Cell Biol，2003，161（3）：653-660.

［36］ Capaldo CT，Nusrat A.Claudin switching：physiological plasticity of the tight junction［J］.Semin Cell Dev Biol，2015，42：22-29.

［37］ Ahmad R，Kumar B，Chen Z，Chen X，Müller D，Lele SM，et al.Loss of claudin-3 expression induces IL6/gp130/Stat3 signaling to promote colon cancer malignancy by hyperactivating Wnt/β-catenin signaling［J］.Oncogene，2017，36（47）：6592-6604.

［38］ Mariano C，Sasaki H，Brites D，Brito MA.A look at tricellulin and its role in tight junction formation and maintenance［J］.Eur J Cell Biol，2011，90（10）：787-796.

［39］ Ikenouchi J，Sasaki H，Tsukita S，F(xiàn)uruse M，Tsukita S.Loss of occludin affects tricellular localization of tricellulin［J］.Mol Biol Cell，2008，19（11）：4687-4693.

［40］ Krug SM，Bojarski C，F(xiàn)romm A，Lee IM，Dames P，Richter JF，et al.Tricellulin is regulated via interleukin-13-receptor α2，affects macromolecule uptake，and is decreased in ulcerative colitis［J/OL］.Mucosal Immunol，2017（2017-06-14）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5730503/

［41］ Arcangeli ML，F(xiàn)rontera V，Aurrand-Lions M.Function of junctional adhesion molecules（JAMs）in leukocyte migration and homeostasis［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2013，61（1）：15-23.

［42］ Jia W，Martin TA，Zhang G，Jiang WG.Junctional adhesion molecules in cerebral endothelial tight junction and brain metastasis［J］.Anticancer Res，2013，33（6）：2353-2359.

［43］ Naik MU，Mousa SA，Parkos CA，Naik UP.Signaling through JAM-1 and alphavbeta3 is required for the angiogenic action of bFGF：dissociation of the JAM-1 and alphavbeta3 complex［J］.Blood，2003，102（6）：2108-2114.

［44］ Ozaki H，Ishii K，Horiuchi H，Arai H，Kawamoto T，Okawa K，et al.Cutting edge：combined treatment of TNF-alpha and IFN-gamma causes redistribution of junctional adhesion molecule in human endothelial cells［J］.J Immunol，1999，163（2）：553-557.

［45］ Ostermann G，Weber KS，Zernecke A，Schr?der A，Weber C.JAM-1 is a ligand of the beta 2 integrin LFA-1 involved in transendothelial migration of leukocytes［J］.Nat Immunol，2002，3（2）：151-158.

［46］ Erickson KK，Sundstrom JM，Antonetti DA.Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions［J］.Angiogenesis，2007，10（2）：103-117.

［47］ Liu W，Wang P，Shang C，Chen L，Cai H，Ma J，et al.Endophilin-1 regulates blood-brain barrier permeability by controlling ZO-1 and occludin expression via theEGFR-ERK1/2pathway［J］.Brain Res，2014，1573：17-26.

［48］ Tornavaca O，Chia M，Dufton N，Almagro LO，Conway DE，Randi AM，et al.ZO-1 controls endothelial adherens junctions，cell-cell tension，angiogenesis，and barrier formation［J］.J Cell Biol，2015，208（6）：821-838.

［49］ Giannotta M，Trani M，Dejana E.VE-cadherin and endothelial adherens junctions：active guardians of vascular integrity［J］.Dev Cell，2013，26（5）：441-454.

［50］ Yamamoto H，Ehling M，Kato K，Kanai K，van Lessen M，F(xiàn)rye M，et al.Integrin β1 controls VE-cadherin localization and blood vessel stability［J/OL］.Nat Commun，2015，6：6429（2015-03-10）.http：//www.nature.com/articles/ncomms7429

［51］ Jiao ZY，Wu J，Wen B，Zhao WZ，Du XL.M3 muscarinic acetylcholine receptor dysfunction inhibits Rac1 activity and disrupts VE-cadherin/β-catenin and actin cytoskeleton interaction［J］.Biochem Cell Biol，2014，92（2）：137-144.

［52］ Gavard J.Endothelial permeability and VE-cadherin：a wacky comradeship［J］.Cell Adh Migr，2013，7（6）：455-461.

［53］ Soni D，Regmi SC，Wang DM，DebRoy A，Zhao YY，Vogel SM，et al.Pyk2 phosphorylation of VE-PTP downstream of STIM1-induced Ca2+entry regulates disassembly of adherens junctions［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2017，312（6）：L1003-L1017.

［54］ Feng YM，Chen XH，Zhang X.Roles of PECAM-1 in cell function and disease progression［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（19）：4082-4088.

［55］ Li G，Han ZL，Dong HG，Zhang X，Kong XQ，Jin X.Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 gene 125C/G polymorphism is associated with deep vein thrombosis［J］.Mol Med Rep，2015，12（2）：2203-2210.

［56］ Dangerfield J，Larbi KY，Huang MT，Dewar A，Nourshargh S.PECAM-1（CD31）homophilic interaction up-regulates alpha6beta1 on transmigrated neutrophilsin vivoand plays a functional role in the ability of alpha6 integrins to mediate leukocyte migration through the perivascular basement membrane［J］.J Exp Med，2002，196（9）：1201-1211.

［57］ Dhanjal TS，Pendaries C，Ross EA，Larson MK，Protty MB，Buckley CD，et al.A novel role for PECAM-1 in megakaryocytokinesis and recovery of platelet counts in thrombocytopenic mice［J］.Blood，2007，109（10）：4237-4244.

［58］ Meza D，Shanmugavelayudam SK，Mendoza A，Sanchez C，Rubenstein DA，Yin W.Platelets modulate endothelial cell response to dynamic shear stress through PECAM-1［J］.Thromb Res，2017，150：44-50.

［59］ Brown S，Heinisch I，Ross E，Shaw K，Buckley CD，Savill J.Apoptosis disables CD31-mediated cell detachment from phagocytes promoting binding and engulfment［J］.Nature，2002，418（6894）：200-203.

［60］ Cui X，Xie Z.Protein interaction and Na/K-ATPasemediated signal transduction［J/OL］.Molecules，2017，22（6）：990（2017-06-14）.http：//www.mdpi.com/1420-3049/22/6/990

［61］ Klumpp L，Sezgin EC，Eckert F，Huber SM.ion channels in brain metastasis［J/OL］.Int J Mol Sci，2016，17（9）：1513（2016-09-08）.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5037790/

［62］ Ximenes-da-Silva A.Metal ion toxins and brain aquaporin-4 expression：an overview［J/OL］.Front Neurosci，2016，10：233（2016-06-01）.http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4887506/

［63］ Geier EG，Chen EC，Webb A，Papp AC，Yee SW，Sadee W，et al.Profiling solute carrier transporters in the human blood-brain barrier［J］.Clin Pharmacol Ther，2013，94（6）：636-639.

［64］ Beis K.Structural basis for the mechanism of ABC transporters［J］.Biochem Soc Trans，2015，43（5）：889-893.

［65］ L?scher W，Potschka H.Blood-brain barrier active efflux transporters：ATP-binding cassette gene family［J］.NeuroRx，2005，2（1）：86-98.

［66］ Miller DS，Cannon RE.Signaling pathways that regulate basal ABC transporter activity at the blood-brain barrier［J］.Curr Pharm Des，2014，20（10）：1463-1471.

［67］ Campos-Bedolla P，Walter FR，Veszelka S，Deli MA.Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system［J］.Arch Med Res，2014，45（8）：610-638.

［68］ Nicolazzo JA，Charman SA，Charman WN.Methods to assess drug permeability across the blood-brain barrier［J］.J Pharm Pharmacol，2006，58（3）：281-293.

［69］ Rousselle C，Clair P，Lefauconnier JM，Kaczorek M，Scherrmann JM，Temsamani J.New advances in the transport of doxorubicin through the bloodbrain barrier by a peptide vector-mediated strategy［J］.Mol Pharmacol，2000，57（4）：679-686.

［70］ Cai H，Liu W，Xue Y，Shang X，Liu J，Li Z，et al.Roundabout 4 regulates blood-tumor barrier permeability through the modulation of ZO-1，occludin，and claudin-5 expression［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2015，74（1）：25-37.

［71］ Van Itallie CM，F(xiàn)anning AS，Bridges A，Anderson JM.ZO-1 stabilizes the tight junction solute barrier through coupling to the perijunctional cytoskeleton［J］.Mol Biol Cell，2009，20（17）：3930-3940.

［72］ Jord?o JF，Thévenot E，Markham-Coultes K，Scarcelli T，Weng YQ，Xhima K，et al.Amyloid-β plaque reduction，endogenous antibody delivery and glial activation by brain-targeted，transcranial focused ultrasound［J］.Exp Neurol，2013，248：16-29.

［73］ Staat C，Coisne C，Dabrowski S，Stamatovic SM，Andjelkovic AV，Wolburg H，et al.Mode of action of claudin peptidomimetics in the transient opening of cellular tight junction barriers［J］.Biomaterials，2015，54：9-20.

［74］ Sauer RS，Krug SM，Hackel D，Staat C，Konasin N，Yang S，et al.Safety，efficacy，and molecular mechanism of claudin-1-specific peptides to enhance blood-nerve-barrier permeability［J］.J Control Release，2014，185：88-98.

［75］ Bocsik A，Walter FR，Gyebrovszki A，F(xiàn)ül?p L，Blasig I，Dabrowski S，et al.Reversible opening of intercellular junctions of intestinal epithelial and brain endothelial cells with tight junction modulator peptides［J］.J Pharm Sci，2016，105（2）：754-765.

［76］ Kolter M，Ott M，Hauer C，Reimold I，F(xiàn)ricker G.Nanotoxicity of poly（n-butylcyano-acrylate）nanoparticles at the blood-brain barrier，in human whole blood andin vivo［J］.J Control Release，2015，197：165-179.

［77］ Tang J，Xiong L，Zhou G，Wang S，Wang J，Liu L，et al.Silver nanoparticles crossing through and distribution in the blood-brain barrierin vitro［J］.J Nanosci Nanotechnol，2010，10（10）：6313-6317.

［78］ de Smet M，Heijman E，Langereis S，Hijnen NM，Grüll H.Magnetic resonance imaging of high intensity focused ultrasound mediated drug delivery from temperature-sensitive liposomes：anin vivoproofof-concept study［J］.J Control Release，2011，150（1）：102-110.

［79］ Park J，Zhang Y，Vykhodtseva N，Jolesz FA，McDannold NJ.The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound［J］.J Control Release，2012，162（1）：134-142.

［80］ Takeshita Y，Obermeier B，Cotleur A，Sano Y，Kanda T，Ransohoff RM.Anin vitroblood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture［J］.J Neurosci Methods，2014，232：165-172.

［81］ Vastag M，Keseru GM.Currentin vitroand in silico models of blood-brain barrier penetration：a practical view［J］.Curr Opin Drug Discov Devel，2009，12（1）：115-124.

［82］ Ding H，Wu F，Nair MP.Image-guided drug delivery to the brain using nanotechnology［J］.Drug Discov Today，2013，18（21-22）：1074-1080.

［83］ Li Y，Chen T，Miao X，Yi X，Wang X，Zhao H，et al.Zebrafish：A promisingin vivomodel for assessing the delivery of natural products，fluorescence dyes and drugs across the blood-brain barrier［J］.Pharmacol Res，2017，125（Pt B）：246-257.

［84］ Morales JF，Montoto SS，F(xiàn)agiolino P，Ruiz ME.Current state and future perspectives in QSAR models to predict blood-brain barrier penetration in central nervous system drug R&D［J］.Mini Rev Med Chem，2017，17（3）：247-257.

［85］ Sj?stedt N，Kortej?rvi H，Kidron H，Vellonen KS，Urtti A，Yliperttula M.Challenges of usingin vitrodata for modeling P-glycoprotein efflux in the bloodbrain barrie［rJ］.Pharm Res，2014，31（1）：1-19.