維藥異葉青蘭總黃酮對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響

蔣 紅，何 雯，張 晨

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.第五附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830011）

心肌肥厚是人類心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子，在醫(yī)學(xué)界早已形成共識(shí)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞蛋白增加、細(xì)胞體積增大、間充質(zhì)成分改變以及心臟順應(yīng)性和循環(huán)功能降低，且多種因素參與了心肌肥厚的形成［1］。心肌肥厚時(shí)，心肌標(biāo)志蛋白表達(dá)水平升高，發(fā)生心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)伴隨有心肌細(xì)胞外間充質(zhì)增多、心臟質(zhì)量增加，還伴有心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，以及心肌間充質(zhì)纖維化等病理改變，病理性心肌肥厚最終將導(dǎo)致心肌病和心衰［2］。其中，腎素-兒茶酚胺系統(tǒng)是與心肌肥厚發(fā)生發(fā)展有直接關(guān)系的神經(jīng)體液因素。去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）是兒茶酚胺中的一種，能激活相應(yīng)受體與G蛋白（Gq和Gs蛋白受體）偶聯(lián)，激活相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與心肌肥厚的發(fā)生，表現(xiàn)為細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成及體積均增大，但細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，說明對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響。NE通過激活α1和β腎上腺素能受體。α1受體激活后，可激活細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶C（phosphatase C，PLC），水解磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2），升高肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（diglyceride，DAG），DAG的升高可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）。β受體激活后可活化腺苷酸環(huán)化酶（adenyl cyclase，AC），使ATP轉(zhuǎn)變成cAMP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP蓄積，進(jìn)而激活PKA。PKA可使許多在心臟收縮中起作用的蛋白磷酸化，包括L型鈣通道蛋白、肌質(zhì)網(wǎng)受體蛋白和肌鈣蛋白等，增強(qiáng)它們的活性，進(jìn)而增強(qiáng)心肌的收縮。PKC和PKA的激活是導(dǎo)致心肌肥厚的關(guān)鍵步驟，二者都可激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起心肌肥厚［3-4］。異葉青蘭總黃酮（total flavonoids ofDracocephalum heterophyllumbenth，TFDH）是維吾爾族及藏族民間傳統(tǒng)用藥，有研究表明，其可治療高血壓、肺熱咳嗽和支氣管炎等，具有良好的抗氧化、保護(hù)心肌、治療冠心病和降血壓等作用［5］。鑒于此，本研究擬在NE誘導(dǎo)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞肥大模型基礎(chǔ)上，觀察TFDH對(duì)心肌細(xì)胞肥大作用的影響，從離體水平上探討TFDH對(duì)心肌細(xì)胞肥厚的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生0～3 d的SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（新）2003-0001。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)SPF環(huán)境，許可證號(hào)：SCXK（新）2011-0004。

1.2 藥品、試劑和主要設(shè)備

TFDH由中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供，提取率為3.76 mg·g-1，經(jīng)鑒定總黃酮含量為57.97%；D-Hanks溶液、胰蛋白酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、CCK-8檢測(cè)試劑盒和NE均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Worthington公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；抗心肌肌鈣蛋白T抗體和Dy Light594標(biāo)記驢抗大鼠IgG二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)自德國(guó)Thermo科技有限公司；驢血清為北京索萊寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；NO測(cè)定試劑盒和Ca2+熒光探針Fluo-3 AM為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；NOS測(cè)定試劑盒、Ca2+-ATP酶測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；定量PCR試劑盒購(gòu)置美國(guó)ABI公司。LSM 710共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；逆轉(zhuǎn)錄儀為伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司Bio-Rad產(chǎn)品；定量PCR儀為美國(guó)ABI 7500產(chǎn)品。

1.3 新生大鼠原代心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)［6］

無菌開胸，迅速取出心臟，置于盛有4℃的D-Hanks溶液中，減去整個(gè)心臟的1/3～1/2，留心尖部心室組織，剪碎后加入0.1%的胰蛋白酶溶液，4℃振蕩過夜。次日加入與胰蛋白酶等量的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，終止消化后，加入濃度為0.08%的Ⅱ型膠原酶置37℃水浴箱，以80次·min-1的頻率震蕩10 min，收集上清液，并以等體積的含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，此步驟重復(fù)4～5次，到組織基本消失為止。完畢后用200目的尼龍篩網(wǎng)除去殘留的組織塊，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，靜置90min差數(shù)貼壁后，取上清液，加入BrdU0.1mmol·L-1抑制非心肌細(xì)胞增殖，吹打均勻，細(xì)胞分別以3×106L-1密度接種于25 mm培養(yǎng)瓶、1.5×106L-1接種于60 mm培養(yǎng)皿、3×108L-1接種于96孔板和1×106L-1接種于6孔板中，置于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組及處理

將上述細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按照處理分為細(xì)胞對(duì)照組、NE模型組和NE+TFDH組。細(xì)胞對(duì)照組和NE模型組加入PBS，NE+TFDH組分別加TFDH 10，25和50 μmol·L-1作用30 min，而后，除細(xì)胞對(duì)照組外，各組分別加入NE 2 μmol·L-1作用48 h。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將接種在96孔板的各組原代心肌細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按1.4方法加藥處理后，用PBS洗3遍，每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)液孵育2 h，于酶標(biāo)儀430 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值。檢測(cè)過程中設(shè)不加細(xì)胞的調(diào)零孔。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A430nm-調(diào)零組A430nm）（/細(xì)胞對(duì)照組A430nm-調(diào)零組A430nm）×100%。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和 β-肌球蛋白重鏈（ βmyosin heavy chain， β-MHC）mRNA 表達(dá)水平

將接種在60 mm培養(yǎng)皿中的各組原代心肌細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按1.4處理細(xì)胞48 h后，加入TRIzol試劑1 mL裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，用DEPC處理水回收總RNA，紫外分光光度計(jì)A260nm/A280nm鑒定其濃度及純度，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用PCR引物由上海生工有限公司設(shè)計(jì)，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。取1 μg cDNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參因子，以2-ΔΔct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for PCR

1.7 激光共聚焦進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定及心肌細(xì)胞表面積檢測(cè)

取出接種在6孔板的心肌細(xì)胞，按1.4方法藥物處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.25%Triton X-100透化10 min，驢血清室溫封閉30 min，加入抗心肌肌鈣蛋白T抗體（1∶500）室溫孵育1 h。加入熒光二抗（1∶1000）避光室溫孵育1 h。避光加入0.1 mL DAPI 50 μg·L-1作用3 min。心肌細(xì)胞圖像通過 LSM 710激光共聚焦儀獲取。每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組各取3孔細(xì)胞進(jìn)行處理。每孔細(xì)胞樣品隨機(jī)獲取4個(gè)不同視野的圖片，每個(gè)圖片取10個(gè)細(xì)胞，并通過Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量3次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞表面積，以μm2表示面積。

1.8 心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度和Ca2+-ATP酶活性測(cè)定

取出接種在6孔板的心肌細(xì)胞，按1.4方法藥物處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入鈣離子探針 Fluo-3/AM（終濃度為 5 μmol·L-1）置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 45～60 min，PBS清洗3次，加入培養(yǎng)基，采用激光共聚焦顯微鏡每組隨機(jī)選擇20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)掃描，通過分析軟件分析細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。同時(shí)，取出接種在60 mm培養(yǎng)皿中的各組原代心肌細(xì)胞，按1.4方法藥物處理48 h后，用胰酶消化細(xì)胞，胎牛血清培養(yǎng)基中和胰酶，生理鹽水稀釋后離心20 min，吸出上清液后破碎細(xì)胞，酶促反應(yīng)測(cè)定磷的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9 細(xì)胞勻漿液中一氧化氮（nitric oxide，NO）濃度和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性的測(cè)定

取出接種在25 mm培養(yǎng)瓶中的心肌細(xì)胞，按1.4方法藥物處理48 h后，收集細(xì)胞并制成細(xì)胞勻漿液。采用比色法測(cè)定NO濃度和NOS活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀于540 nm測(cè)定NO2-與Griess試劑反應(yīng)后溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔NO水平。在530 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算NOS活性。

1.1 0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用x±s表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間比較使用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞存活率的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NE模型組細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與NE模型組比較，NE+TFDH 25和50 μmo·L-1組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05），且具有濃度依賴性（r=0.998，P＜0.05）（圖1）。表明TFDH可使NE誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞的存活率升高。

Fig.1 Effect of total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum benth（THDH）on survival rate of myocar?dial cells induced by norepinephrine（NE）.The cells were cultured for 30 min with TFDH 0,10，25 and 50 μmol· L-1，respectively，then NE 2 μmol·L-1was added and cultured for 48 h.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05 ，compared with NE group.

2.2 TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞ANP和 β-MHC mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（表2），與細(xì)胞對(duì)照組相比，NE模型組ANP和β-MHC的mRNA表達(dá)均上調(diào)，分別增加2.14±0.42和（2.03±0.19）倍（P＜0.05）；與NE 模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組ANP和 β-MHC 的mRNA表達(dá)均下調(diào)，其中以NE+TFDH 25和50 μmol·L-1處理組較為明顯（P＜0.05），且具有濃度依賴性（r=-0.995，P＜0.05；r=-0.997，P＜0.05）。結(jié)果表明，TFDH可阻斷由NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ANP和β-MHC mRNA表達(dá)上調(diào)。

Tab.2 Effect of TFDH on expression of mRNA of atrial natriuretic peptide（ANP）and β-myosin heavy chain（ β-MHC） to myocardial cells induced by NE

2.3 TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞表面積的影響

Fig.2 Effect of TFDH on surface area of myocardial cells induced by NE observed by phase contrast microscopy.See Fig.1 for the cell treatment.A：cell control group；B：NE 2 μmol·L-1；C：NE+TFDH 10 μmol·L-1group；D：NE+TFDH 25 μmol·L-1group；E：NE+TFDH 50 μmol·L-1group.

使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組心肌細(xì)胞表面積結(jié)果顯示（圖2），與細(xì)胞對(duì)照組心肌細(xì)胞表面積（178±29）μm2相比，NE 模型組心肌細(xì)胞明顯增大，為（274±38）μm2（P＜0.05）；與 NE模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組心肌細(xì)胞表面積分別為242±43，223±32和（201±30）μm2，均明顯縮?。≒＜0.05）。表明TFDH可緩解由NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大。

2.4 TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i和Ca2+-ATP酶活性的影響

與細(xì)胞對(duì)照組比較，NE模型組明顯使心肌細(xì)胞［Ca2+］i增加（P＜0.05）和 Ca2+-ATP 酶的活性下降；與 NE模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組均對(duì)心肌細(xì)胞［Ca2+］i有明顯的抑制作用（P＜0.05），使Ca2+-ATP酶活性明顯增加（P＜0.05），并呈濃度依賴性（r=0.995，P＜0.05）（表3）。表明TFDH可抑制由NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞［Ca2+］i增加和Ca2+-ATP酶活性降低。

Tab.3 Effect of TFDH on［Ca2+］iand activity of Ca2+-ATP of hypertrophic cardiomyocytes induced by NE

2.5 TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞NO濃度和NOS活性的影響

比色法測(cè)定結(jié)果顯示（表4），與細(xì)胞對(duì)照組相比，NE模型組心肌細(xì)胞NO濃度和NOS活性明顯降低（P＜0.05）；與 NE 2模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組心肌細(xì)胞NO 濃度和NOS活性明顯增加（P＜0.05），并呈濃度依賴性（r=0.997，P＜0.05）。表明TFDH可返轉(zhuǎn)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NO濃度和NOS活性降低。

Tab.4 Effect of TFDH on concentration of nitric oxide（NO）and activity of nitric oxide synthase（NOS）of hypertrophic cardiomyocytes induced by NE

3 討論

本研究結(jié)果顯示，TFDH能明顯提高由NE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞存活率、抑制心肌肥大標(biāo)志物ANP和β-MHC的mRNA表達(dá)以及減小肥大心肌細(xì)胞表面積，提示其對(duì)肥大心肌細(xì)胞起到了明顯的保護(hù)作用。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TFDH可降低腎血管性高血壓大鼠的血壓，改善左心室舒縮功能和心肌收縮力，其機(jī)制可能與降低血循環(huán)、心肌組織和腎組織中的內(nèi)皮素水平，升高NO水平，調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)皮素與NO平衡狀態(tài)有關(guān)［7-8］。

本研究中，由NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型組中，NO濃度和NOS的活性均減低，提示NE一方面可引起心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)可減低NO濃度和NOS活性，而這些作用均可能與α1受體和酪氨酸蛋白激酶受體不敏感的G蛋白介導(dǎo)有關(guān)，通過增加外源性NO可防止NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，提示NO除引起冠脈舒張、冠脈血流量增加和心肌收縮力下降外，可能在防止心肌肥厚反應(yīng)中起重要作用［9-11】。本研究結(jié)果顯示，TFDH抑制NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的同時(shí)，明顯升高心肌細(xì)胞勻漿液中NO的濃度和NOS的活性，而心臟中NO濃度升高可引起冠脈舒張血流量增加等，并抑制心肌肥厚。提示TFDH對(duì)心肌肥厚的保護(hù)作用可能與心臟NO濃度有關(guān)。

心肌肥大是一種由多種因素參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程，現(xiàn)已證實(shí)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路、MAPK通路、NO/cGMP通路等多條信號(hào)通路均參與其病理過程［12-13］。在分子水平表現(xiàn)為心肌重構(gòu)時(shí)心肌細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)模式改變、BNP和ANP表達(dá)上調(diào)、胚胎型成熟基因表達(dá)下降，以及心肌蛋白合成增加、單個(gè)細(xì)胞蛋白含量增高、心肌細(xì)胞肥大和收縮力減弱。本研究結(jié)果顯示，TFDH能明顯降低NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ANP和β-MHC mRNA表達(dá)，提示TFDH抑制心肌細(xì)胞肥大作用與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。同時(shí)，心肌肥厚常伴有肌漿網(wǎng)鈣泵活性降低、Ca2+紊亂等，而心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP通過攝取和釋放Ca2+在心臟的舒張活動(dòng)中起重要作用。在心肌興奮收縮中，Ca2+參與了心肌動(dòng)作電位的形成，同時(shí)Ca2+還能直接與肌絲結(jié)合，引起心肌收縮。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低時(shí)，Ca2+從肌鈣蛋白上解離下來，引起心肌舒張。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使，通過出入胞漿傳遞多種生物信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等途徑，其中包括調(diào)節(jié)心臟功能［14］。Ca2+也是心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的重要信號(hào)通路，而鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN）和鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase，CaMKⅡ）是重要調(diào)節(jié)信號(hào)。胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的改變是肥厚反應(yīng)的首要刺激，在心臟肥厚和基因表達(dá)中發(fā)揮中心作用，Ca2+依賴的CaN/NFAT途徑和CaMKⅡ/HDAC途徑均參與其中［13，15】。本研究結(jié)果顯示，TFDH抑制NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的同時(shí)明顯降低心肌細(xì)胞Ca2＋濃度和升高Ca2+-ATP酶的活性，并呈濃度依賴性，提示TFDH對(duì)心肌細(xì)胞Ca2＋濃度和Ca2+-ATP酶活性的調(diào)節(jié)可能是其抗心肌肥厚的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究顯示，TFDH對(duì)NE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)NO釋放、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和Ca2+-ATP酶活性有關(guān)。其他的作用機(jī)制及細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

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