主動脈結(jié)合性質(zhì)導(dǎo)致藥物副作用的研究進(jìn)展

冉兆晉，柴寶山

（沈陽化工研究院有限公司醫(yī)藥研究室，遼寧沈陽 110021）

主動脈結(jié)合指具有特定結(jié)構(gòu)的化合物與原彈性蛋白中的醛基賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而破壞動脈彈性蛋白的形成乃至降解的性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，莫唑胺［1］、羅非昔布［2-4］和AZD5248［5］等（圖1）已上市或處于臨床前研究的藥物具有主動脈結(jié)合性質(zhì)，導(dǎo)致藥物副作用，尤其增加了心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的風(fēng)險。本文對具有主動脈結(jié)合性質(zhì)的藥物進(jìn)行梳理總結(jié)，分析其產(chǎn)生的機(jī)制，總結(jié)相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并對其體內(nèi)外研究方法進(jìn)行總結(jié)，有助于藥物研發(fā)工作者關(guān)注該性質(zhì)，規(guī)避藥物設(shè)計中可能出現(xiàn)的風(fēng)險，為后續(xù)相關(guān)研究提供方法和思路。

1 主動脈結(jié)合發(fā)生機(jī)制

原彈性蛋白中的賴氨酸殘基通過賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）被氧化成醛基賴氨酸，醛基賴氨酸與賴氨酸殘基可以4-4交聯(lián)形成鎖鏈素與異鎖鏈素，原彈性蛋白通過鎖鏈素與異鎖鏈素共價交聯(lián)形成正常的彈性蛋白（圖2）［2-3］。而具有主動脈結(jié)合性質(zhì)的化合物可與原彈性蛋白中的醛基共價結(jié)合，破壞鎖鏈素與異鎖鏈素的形成，進(jìn)而破壞彈性蛋白的正常形成（圖3）［2-5］。彈性蛋白具有非常緩慢的周轉(zhuǎn)率［6-7］，化合物以劑量大小和給藥頻率在主動脈中逐漸累積，進(jìn)而破壞彈性蛋白形成，甚至引起降解，主動脈出現(xiàn)功能障礙，最后導(dǎo)致CVD。

2 具有主動脈結(jié)合性質(zhì)的藥物

2.1 肼屈嗪（hydralazine）

肼屈嗪是用于治療腎型高血壓的藥物，是最早被發(fā)現(xiàn)具有主動脈結(jié)合性質(zhì)的藥物。在早期研究中，Moore-Jones等［8］給小鼠注射［14C］標(biāo)記的肼屈嗪，通過放射自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)，小鼠主動脈上的放射性物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于其他組織，他們認(rèn)為肼屈嗪這種對血管的親和力與其毒性相關(guān)，推測該藥物可能導(dǎo)致血管損傷與紅斑狼瘡。該研究為第一次公開報道藥物的主動脈結(jié)合性質(zhì)，但作者并未對該結(jié)合機(jī)制進(jìn)行推測或深入研究。隨后，肼屈嗪因較大的副作用被FDA警告，禁止用于冠狀動脈病變和腦血管硬化等治療。

根據(jù)現(xiàn)在闡明的主動脈結(jié)合發(fā)生機(jī)制，推測肼屈嗪與主動脈壁的結(jié)合是肼屈嗪上的肼基與原彈性蛋白中醛基賴氨酸的醛基發(fā)生反應(yīng)生成了碳氮雙鍵（圖4），導(dǎo)致肼屈嗪富集于主動脈壁上難以正常代謝，導(dǎo)致血管病變，進(jìn)而增加了CVD發(fā)病的概率。

2.2 咪唑（imidazole）

圖1 具有主動脈結(jié)合性質(zhì)的部分藥物.

圖2 正常彈性蛋白的形成過程.

圖3 受主動脈結(jié)合藥物干擾的彈性蛋白病變過程.

咪唑作為重要的化工中間體大量應(yīng)用于精細(xì)化學(xué)品合成與樹脂固化劑和黏合劑中。Ohta等［9-12］對咪唑類化合物的主動脈結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行了一系列研究。大鼠靜脈注射給予［14C］咪唑類化合物（3 μmol·kg-1）后，通過放射自顯影確認(rèn)不可逆結(jié)合位點(diǎn)主要位于主動脈的彈性蛋白。但進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)，［14C］咪唑類化合物與主動脈（犬動脈切片）不能結(jié)合。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，普羅地芬（proadifen）可增加［14C］咪唑類化合物主動脈結(jié)合，推測是細(xì)胞色素P450酶催化咪唑產(chǎn)生的代謝物與主動脈發(fā)生了結(jié)合［9］。為進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究，Ohta等［10］在體外實(shí)驗(yàn)中采用氯化銅加維生素C處理的［14C］咪唑化合物，發(fā)現(xiàn)其與犬動脈切片發(fā)生主動脈結(jié)合，而用還原物質(zhì)硼氫化鈉等預(yù)處理犬動脈切片可減少主動脈結(jié)合，據(jù)此推測是咪唑的氧化代謝物與彈性蛋白中的醛基發(fā)生了鍵合。Ohta等［11］進(jìn)一步采用咪唑氧化代謝物咪唑啉酮與醛基化合物在體外模擬主動脈結(jié)合的過程。結(jié)果表明，其可能是通過羥醛縮合反應(yīng)發(fā)生結(jié)合。而且通過大鼠靜脈注射［14C］咪唑啉酮化合物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，認(rèn)為細(xì)胞色素P450酶催化產(chǎn)生的咪唑啉酮代謝物是主動脈結(jié)合的原因［12］（圖5）。一系列體內(nèi)與體外研究基本闡明了主動脈結(jié)合發(fā)生的原因和可能的結(jié)合機(jī)制，為后續(xù)的相關(guān)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

圖4 肼屈嗪的主動脈結(jié)合機(jī)制.肼屈嗪上的肼基與原彈性蛋白中醛基賴氨酸的醛基發(fā)生反應(yīng)生成了碳氮雙鍵.

2.3 莫唑胺（muzolimine）

莫唑胺是治療高血壓的藥物，因嚴(yán)重副作用而退市。Schmidt等［1］在早期研究中發(fā)現(xiàn)，其除了較大的神經(jīng)副作用外，還具有主動脈結(jié)合的性質(zhì)。大鼠喂食［14C］莫唑胺（3 mg）2周后，其動脈的放射活性是皮膚和肌肉的60～300倍，給藥劑量的0.04%結(jié)合在了主動脈彈性蛋白上。該研究還建立了用胰彈性蛋白酶水解主動脈釋放結(jié)合的莫唑胺的方法，為體外定量檢測主動脈結(jié)合化合物奠定基礎(chǔ)。該研究還使用［4，5-3H］賴氨酸標(biāo)記大鼠彈性蛋白，莫唑胺處理2周，發(fā)現(xiàn)彈性蛋白中鎖鏈素與異鎖鏈素顯著低于空白對照。表明其機(jī)制可能是干擾了鎖鏈素與異鎖鏈素的形成而影響動脈（圖6）。

2.4 羅非昔布（rofecoxib）

圖51 -甲基咪唑的主動脈結(jié)合機(jī)制.咪唑類化合物在P450酶的作用下氧化生成咪唑啉酮，咪唑啉酮和醛基賴氨酸發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)生成碳碳雙鍵，發(fā)生不可逆結(jié)合.

圖6 莫唑胺的主動脈結(jié)合機(jī)制.莫唑胺先在體內(nèi)被氧化為氧化莫唑胺，再與醛基賴氨酸的醛基脫水關(guān)閉噁唑環(huán)，發(fā)生不可逆結(jié)合.

羅非昔布為環(huán)氧化酶2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）特異性抑制劑，具有很強(qiáng)的止痛和抗炎作用。2000年，發(fā)現(xiàn)其具有較大的副作用［13］；2001年，美國FDA因其副作用對其進(jìn)行了警告［14］；2004年，由于確切的心血管副作用，默沙東主動召回退市［15］，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Otitate等［2-3］對羅非昔布的副作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，用COX-2抑制劑［14C］羅非昔布、［14C］塞來昔布和［14C］CS-706處理大鼠（均為2 mg·kg-1），全身放射自顯影技術(shù)與定量組織分析顯示，只有羅非昔布在大鼠動脈中有集聚；進(jìn)一步的分析顯示，其主要結(jié)合在彈性蛋白上。該研究還第一次使用了斑馬魚模型進(jìn)行主動脈結(jié)合的全身放射自顯影技術(shù)，直觀地觀察到［14C］羅非昔布的集聚現(xiàn)象［2］。進(jìn)一步研究表明，羅非昔布是直接與主動脈產(chǎn)生結(jié)合，而不是其代謝產(chǎn)物5-羥基羅非昔布（圖7）［3］。除羅非昔布外，其他COX-2抑制劑不與主動脈結(jié)合，而羅非昔布也不與動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，而是特異性結(jié)合于彈性蛋白中。此外，使用苯甲醛替代動脈切片的方法進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)羅非昔布可與苯甲醛在體外產(chǎn)生結(jié)合［2-3］。一系列研究表明，羅非昔布相對于其他COX-2抑制劑，具有主動脈結(jié)合的性質(zhì)，可導(dǎo)致更高的心血管發(fā)病概率［2-4］。主動脈結(jié)合性質(zhì)是羅非昔布退市的主要原因。

2.5 AZD5248

AZD5248是阿斯利康（AstraZeneca）公司開發(fā)的治療慢性阻塞性肺病的臨床前候選藥物，由于早期毒理研究發(fā)現(xiàn)其具有主動脈結(jié)合性質(zhì)（圖8）［5］，不得不放棄該分子骨架，重新設(shè)計開發(fā)了AZD7986（圖9）［16］，開發(fā)時間雖耽誤并付出了更多的研發(fā)經(jīng)費(fèi)，但其從根源上避免了后期的心血管副作用，大大降低了該藥物的后期市場風(fēng)險。在研究過程中使用了早期研究者建立的一系列體內(nèi)和體外研究方法，并且完善了相關(guān)的體外模擬研究方法，如采用丙醛與苯甲醛共同進(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn)，避免單獨(dú)使用苯甲醛可能帶來的假象。還意外地發(fā)現(xiàn)了AZD5248類似物卡普瑞林（campromorelin）的主動脈結(jié)合假陽性，并開發(fā)了體外假陽性研究方法。

2.6 ZD4407

圖7 羅非昔布的主動脈結(jié)合機(jī)制.通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測得出，羅非昔布與醛基賴氨酸的醛基加成，形成共價不可逆結(jié)合.

圖8 AZD5248的主動脈結(jié)合機(jī)制.AZD5248通過其結(jié)構(gòu)中的氨基乙酰胺結(jié)構(gòu)與醛基賴氨酸的醛基關(guān)咪唑啉酮環(huán)發(fā)生不可逆結(jié)合.

圖9 AZD7986由AZD5248改造獲得.AZD7986無氨基乙酰胺結(jié)構(gòu)，在保持活性的基礎(chǔ)上避免了主動脈結(jié)合的副作用.

ZD4407是一個處于開發(fā)中的5-脂氧化酶抑制劑。毒理研究發(fā)現(xiàn)，其也具有潛在的主動脈結(jié)合性質(zhì)（圖10）［5］。因此，對其進(jìn)行相關(guān)的結(jié)構(gòu)改造可避免主動脈結(jié)合導(dǎo)致的副作用。

3 主動脈結(jié)合研究方法

3.1 體內(nèi)研究

3.1.1 ［14C］標(biāo)記化合物定量分析

將［14C］標(biāo)記化合物（用于主動脈中的放射性測量）溶解，ig給予實(shí)驗(yàn)動物，一定時間后安樂死，收集胸主動脈。使用不同的蛋白水解酶分解主動脈的各個成分并提取，處理后使用超高效液相色譜對比定性定量分析［2-5］。該研究方法需要模型動物、放射標(biāo)記化合物和帶有放射性檢測儀的HPLC等設(shè)備。

3.1.2 ［14C］標(biāo)記化合物定量全身放射自顯影技術(shù)分析

定量全身放射自顯影技術(shù)（quantitative whole body autoradiography，QWBA），利用［14C］標(biāo)記化合物在大鼠或斑馬魚體內(nèi)組織分布進(jìn)行研究。這是現(xiàn)在最有效直觀的研究方法［4-5］。實(shí)驗(yàn)動物給予不同劑量［14C］標(biāo)記化合物一段時間后，分別于不同時間進(jìn)行處理并冷凍，處理后使用磷屏曝光，將激發(fā)后的磷屏在同位素影像分析儀中讀取信號，呈現(xiàn)放射性化合物的動物組織分布圖像，并可利用其灰度值對動物體內(nèi)放射性化合物進(jìn)行相對定量。在主動脈結(jié)合研究中，斑馬魚被更多地用于該實(shí)驗(yàn)研究。隨著時間的延長，放射標(biāo)記化合物在斑馬魚的主動脈中表現(xiàn)出明顯的結(jié)合留駐現(xiàn)象。該研究方法需要模型動物、放射標(biāo)記化合物和同位素影像分析儀等設(shè)備。

3.2 體外研究

3.2.1 體外苯甲醛或丙醛結(jié)合模擬分析

使用苯甲醛或丙醛作為原彈性蛋白中醛基賴氨酸的模擬化合物，與檢測目標(biāo)化合物混合反應(yīng)一段時間，24 h后使用液質(zhì)聯(lián)用檢測［2，5］，模擬檢測機(jī)制（圖10）。利用丙醛與苯甲醛的醛基與AZD5248的氨基乙酰胺結(jié)構(gòu)反應(yīng)，生成咪唑啉酮環(huán)。該研究方法需要液質(zhì)聯(lián)用設(shè)備。

3.2.2 體外［14C］標(biāo)記化合物競爭性結(jié)合分析

將大鼠動脈剝離并勻漿后與檢測目標(biāo)化合物一起孵育一段時間，隨后加入有放射性標(biāo)記的確定具有動脈結(jié)合性質(zhì)的模式化合物，再次孵育一段時間，分離提取檢測目標(biāo)溶液，使用多用途閃爍計數(shù)器對其進(jìn)行放射性檢測來判斷結(jié)合情況，該法的特點(diǎn)是可體外判斷出一些假陽性化合物［3-5］。

卡普瑞林（生長激素釋放刺激肽類藥）與具有主動脈結(jié)合活性的AZD5248有相似的α-氨基酰胺結(jié)構(gòu)（圖11），推測其同樣具有主動脈結(jié)合活性。體外苯甲醛或丙醛結(jié)合模擬分析為陽性（圖12）；但競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)為陰性（圖13），與QWBA分析結(jié)果一致，說明在假陽性判斷上，競爭性結(jié)合分析較普通的苯甲醛丙醛結(jié)合分析具有優(yōu)勢。推測卡普瑞林具有可逆的弱結(jié)合，在競爭化合物AZD5248的干擾下會解離。導(dǎo)致該結(jié)果的深層次的機(jī)制與原因還有待進(jìn)一步研究［5］。該研究方法需要模型動物、放射標(biāo)記化合物和多用途閃爍計數(shù)器等設(shè)備。

圖10 ZD4407的主動脈結(jié)合機(jī)制.ZD4407中的二氫吲哚-2-酮與醛基賴氨酸的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成不可逆結(jié)合.

圖11 AZD5248模擬檢測反應(yīng)機(jī)制.

圖12 卡普瑞林體外丙醛模擬結(jié)合.

圖13 體外［14C］標(biāo)記AZD5248與卡普瑞林主動脈競爭性結(jié)合.

4 結(jié)語

藥物因主動脈結(jié)合導(dǎo)致副作用的相關(guān)研究報道雖較少，但從其產(chǎn)生的機(jī)制上分析，尚可推測出許多藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有潛在的主動脈結(jié)合的可能性。阿斯利康的AZD5248不會是最后一個因?yàn)橹鲃用}結(jié)合導(dǎo)致的副作用而重新研發(fā)的臨床候選藥物。中國的創(chuàng)新藥物研發(fā)應(yīng)關(guān)注并了解主動脈結(jié)合的基本原理，熟悉發(fā)生主動脈結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在藥物設(shè)計過程中進(jìn)行早期規(guī)避，降低藥物在臨床乃至上市后的CVD風(fēng)險。本綜述對廣大藥物研發(fā)工作者具有一定的現(xiàn)實(shí)參考意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Schmidt A，Busse WD，Garthoff B，Gau W，Ritter W，Wünsche C，et al.Influence of muzolimine on arterial wall elastin［J］.Biochem Pharmacol，1984，33（12）：1915-1921.

［2］ Oitate M，Hirota T，Murai T，Miura S，Ikeda T.Covalent binding of rofecoxib，but not other cyclooxygenase-2 inhibitors，to allysine aldehyde in elastin of human aorta［J］.Drug Metab Dispos，2007，35（10）：1846-1852.

［3］ Oitate M，Hirota T，Takahashi M，Murai T，Miura S，Senoo A，et al.Mechanism for covalent binding of rofecoxib to elastin of rat aorta［J］.J Pharmacol Exp Ther，2007，320（3）：1195-1203.

［4］ Oitate M，Hirota T，Koyama K，Inoue S，Kawai K，Ikeda T.Covalent binding of radioactivity from［14C］rofecoxib，but not［14C］celecoxib or［14C］CS-706，to the arterial elastin of rats［J］.Drug Metab Dispos，2006，34（8）：1417-1422.

［5］ Bragg RA， BrocklehurstS， Gustafsson F，Goodman J，Hickling K，MacFaul PA，et al.Aortic binding of AZD5248：mechanistic insight and reactivity assays to support lead optimization［J］.Chem Res Toxicol，2015，28（10）：1991-1999.

［6］ Maroudas A，Palla G，Gilav E.Racemization of aspartic acid in human articular cartilage［J］.Connect Tissue Res，1992，28（3）：161-169.

［7］ Petersen E，W?gberg F，Angquist KA.Serum concentrations of elastin-derived peptides in patients with specific manifestations of atherosclerotic disease［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2002，24（5）：440-444.

［8］ Moore-Jones D，Perry HM Jr.Radioautographic localization of hydralazine-1-C-14 in arterial walls［J］.Proc Soc Exp Biol Med，1966，122（2）：576-579.

［9］ Ohta K，Yamaguchi JI，Akimoto M，F(xiàn)ukushima K，Suwa T，Awazu S.Retention mechanism of imidazoles in connective tissue.Ⅰ.Binding to elastin［J］.Drug Metab Dispos，1996，24（12）：1291-1297.

［10］ Ohta K，Akimoto M，Kohno Y，F(xiàn)ukushima K，Suwa T，Awazu S.Retention mechanism of imidazoles in connective tissue.Ⅱ.Activation of imidazoles in cupro-ascorbate system for irreversible binding formation with aortic tissuein vitro［J］.Biol Pharm Bull，1998，21（3）：308-310.

［11］ Ohta K，F(xiàn)ukasawa Y，Yamaguchi J，Akimoto M，Kohno Y，F(xiàn)ukushima K，et al.Retention mechanism of imidazoles in connective tissue.Ⅲ.aldehyde adduct formation of a 4（5H）〔or 5（4H）〕-imidazolone productin vitro［J］.Biol Pharm Bull，1998，21（9）：958-963.

［12］ Ohta K，F(xiàn)ukasawa Y，Yamaguchi J，Kohno Y，F(xiàn)ukushima K，Suwa T，et al.Retention mechanism of imidazoles in connective tissue.Ⅳ.Identification of a nucleophilic imidazolone metabolite in rats［J］.Biol Pharm Bull，1998，21（12）：1334-1337.

［13］ Bombardier C，Laine L，Reicin A，Shapiro D，Burgos-Vargas R，Davis B，et al.Comparison of upper gastrointestinal toxicity of rofecoxib and naproxen in patients with rheumatoid arthritis.VIGOR Study Group［J］.N Engl J Med，2000，343（21）：1520-1528.

［14］ Food and Drug Administration.VIOXX?（rofecoxib tablets and oral suspension）［EB/OL］.（2016-05-10）［2017-12-04］.https：//www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2016/021042s033，021052s024lbl.pdf

［15］ Food and Drug Administration.New Pediatric Labeling Information Database-Detai［lEB/OL］.（2017-11-27）［2017-12-04］https：//www.accessdata.fda.gov/scripts/sda/sdDetailNavigation.cfm？sd=labelingdatabase&id=14CE032258461B7DE053564DA8C071F2&rownum=512

［16］ Doyle K，L?nn H，K?ck H，Van de Po?l A，Swallow S，Gardiner P，et al.Discovery of second generation reversible covalent DPP1 inhibitors leading to an oxazepane amidoacetonitrile based clinical candidate（AZD7986）［J］.J Med Chem，2016，59（20）：9457-9472.