解毒祛瘀滋陰方對(duì)強(qiáng)的松治療的MRL/lpr狼瘡鼠肺、脾、腹腔巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的影響

謝冠群 季巾君 范永升

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

解毒祛瘀滋陰方對(duì)強(qiáng)的松治療的MRL/lpr狼瘡鼠肺、脾、腹腔巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的影響

謝冠群 季巾君 范永升

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

[目的]觀察解毒祛瘀滋陰方對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的影響。[方法]MRL/lpr狼瘡鼠分為模型組、強(qiáng)的松組、解毒祛瘀滋陰方組（以下簡(jiǎn)稱：中藥組）以及強(qiáng)的松加中藥組(以下簡(jiǎn)稱：中西藥結(jié)合組)，分別以生理鹽水、強(qiáng)的松、解毒祛瘀滋陰方中藥和強(qiáng)的松加解毒祛瘀滋陰方中藥灌胃4周，收集肺、腹腔、脾臟巨噬細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。[結(jié)果]經(jīng)強(qiáng)的松治療后狼瘡鼠肺巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA和脾巨噬細(xì)胞TLR4蛋白都顯著升高（P＜0.05），而中西藥結(jié)合組則可以顯著降低升高的脾巨噬細(xì)胞TLR4蛋白水平（P＜0.05）。強(qiáng)的松還可以顯著降低肺、腹腔巨噬細(xì)胞MyD88、IFN-α、iNOS mRNA等TLR4下游分子的表達(dá)（P＜0.05），而中西藥結(jié)合組可以顯著升高已經(jīng)降低的肺巨噬細(xì)胞MyD88 mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。[結(jié)論]MRL/lpr狼瘡鼠應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后，巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路發(fā)生改變，解毒祛瘀滋陰方中藥可以降低糖皮質(zhì)激素造成的TLR4蛋白的異常表達(dá)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；MRL/lpr狼瘡鼠；巨噬細(xì)胞；解毒祛瘀滋陰方；糖皮質(zhì)激素；副作用；Toll樣受體

巨噬細(xì)胞是具有防御、調(diào)節(jié)炎癥、誘導(dǎo)免疫等多方面作用的細(xì)胞，其主要功能是清除體內(nèi)衰老損傷或凋亡的細(xì)胞以及免疫復(fù)合物和病原體等抗原性異物，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）的發(fā)病中具有重要的作用，而且作為固有免疫的重要的組成部分，在抵御入侵的病原微生物中具有重要作用。隨著SLE治療水平的提高，患者因疾病本身的死亡率大大降低，但由于糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等造成的感染而導(dǎo)致的死亡卻顯著上升。Toll樣受體（Toll like receptor,TLR）4是識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的主要受體，在感染的發(fā)病中具有重要作用。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)患者免疫功能等方面具有很好的療效，課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方可以減少SLE患者感染的發(fā)生[1]，因此希望通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀滋陰方治療MRL/lpr狼瘡鼠減少感染發(fā)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 8周齡MRL/lpr狼瘡鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（滬）2008-0016]，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)封閉狀態(tài)下飼養(yǎng)[SYXK(浙)2013-0184]，正常飼料自由飲食飲水。

1.2 中藥制備 解毒祛瘀滋陰方（升麻9g、青蒿12g、白花蛇舌草15g、赤芍12g、積雪草15g、干地黃15g、炙鱉甲12g、炒薏仁15g、佛手片9g、生甘草6g）藥材，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供。以水500mL煎煮1h，過(guò)濾藥液，加水500mL，煎煮1h，過(guò)濾藥液，二次的水煎劑混合后，濃縮成0.6g·mL-1生藥。

1.3 主要儀器與試劑 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara，批號(hào)K4707CA），Taq酶（Takara，批號(hào)CKA3901C），醋酸潑尼松片（浙江仙居制藥，批號(hào)151022），TLR4兔抗鼠一抗（Santa sc16240，批號(hào)F0520），羊抗兔二抗（Licor 926-68021，批號(hào)C40325-02）；引物由上海生工合成；PCR儀（德國(guó)，Eppendorf），BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)，BIO-RAD）。

1.4 動(dòng)物分組及處理 按體重隨機(jī)將24只MRL/lpr狼瘡鼠分成4組：模型組、強(qiáng)的松組、解毒祛瘀滋陰方組（以下簡(jiǎn)稱：中藥組）以及強(qiáng)的松加中藥組(以下簡(jiǎn)稱：中西藥結(jié)合組）。各組藥物劑量以體表面換算成人等效劑量，中藥組以0.6g·mL-1生藥濃度，每只小鼠灌胃0.5mL；強(qiáng)的松組以0.2mg·mL-1的強(qiáng)尼松灌胃0.5mL；中西藥結(jié)合組先灌強(qiáng)的松，0.5h后再灌中藥，劑量同上；模型組灌0.5mL生理鹽水。各組共連續(xù)灌胃4周后處死，收集相關(guān)標(biāo)本。

1.5 巨噬細(xì)胞提取及培養(yǎng) 肺巨噬細(xì)胞制備[2]：MRL/lpr狼瘡鼠治療4周后處死，在75%酒精中浸泡2min，打開(kāi)頸部皮膚，找出氣管，并從口中插入頂端磨平的注射器進(jìn)入氣管，結(jié)扎氣管，先將肺中氣體吸凈，再向肺中注入1mL PBS，1min后回吸，重復(fù)3次，收集含巨噬細(xì)胞的液體。腹腔巨噬細(xì)胞制備：肺巨噬細(xì)胞收集完成后，向MRL/lpr鼠腹腔中注射PBS 5mL，輕輕按揉小鼠腹部3min，抽取腹腔液，收集含巨噬細(xì)胞的液體。脾巨噬細(xì)胞制備：腹腔巨噬細(xì)胞收集完成后，打開(kāi)小鼠腹腔，取出脾臟，放入含有PBS的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌注射器吸取PBS，將針尖插入脾中反復(fù)吹打，直至脾臟呈白色，收集含有脾細(xì)胞的液體。將上述3種含巨噬細(xì)胞的液體3000r/min離心5min，去上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。2h后換液，棄去紅細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等未貼壁的細(xì)胞，剩下的貼壁細(xì)胞即巨噬細(xì)胞。

1.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法 收集上述細(xì)胞，加入1mL Trizol充分裂解細(xì)胞后-80℃保存。RT-PCR檢測(cè)TLR4、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor88,MyD88）、TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon,TRIF）、干擾素α（interferon-α,IFN-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis,iNOS）基因的表達(dá)。將上述液體在室溫放置10min后加入氯仿混勻，離心后吸取上清，加入等體積異丙醇，-20℃靜置30min后離心去上清，加入無(wú)水乙醇洗滌后晾干得到RNA，測(cè)定濃度后加入等量RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄及PCR目的基因擴(kuò)增。各引物序列（表1），PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，拍照記錄結(jié)果。通過(guò)軟件計(jì)算各組的灰度值，與Actin比較，得出各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列Tab.1 The genetic sequences of primers

1.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)方法 收集脾臟巨噬細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解，離心后取上清待用。配置SDS-PAGE，將上述樣品煮沸后加樣電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育2h后掃膜儀進(jìn)行掃描拍照。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察 巨噬細(xì)胞1～2h開(kāi)始貼壁，呈扁圓形，5～6h后逐漸伸出偽足，呈三角形或多邊形。24h后臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞成活率＞95%。

2.2 肺、腹腔、脾巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的變化 收集各組巨噬細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示：與模型組比較，強(qiáng)的松組小鼠的肺巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脾和腹腔的巨噬細(xì)胞有升高趨勢(shì)，中藥組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與強(qiáng)的松組比較，肺、脾、腹腔的中西藥結(jié)合組都有一定程度的下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，強(qiáng)的松組、中西藥結(jié)合組的3種巨噬細(xì)胞MyD88 mRNA顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），強(qiáng)的松組的肺、腹腔巨噬細(xì)胞IFN-α mRNA顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與強(qiáng)的松組比較，中西藥結(jié)合組肺巨噬細(xì)胞MyD88 mRNA顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)變化不明顯。詳見(jiàn)表2～4。

2.3 脾巨噬細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)變化 收集各組小鼠脾巨噬細(xì)胞，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，中藥組TLR4的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），強(qiáng)的松組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組比較，中西藥結(jié)合組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

表2 藥物對(duì)MRL/lpr鼠肺巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表2 藥物對(duì)MRL/lpr鼠肺巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05；與強(qiáng)的松組比較，◇P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05;compared with prednisone group,◇P＜0.05.

模型組 中藥組 強(qiáng)的松組 中西藥結(jié)合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.19±0.32 0.43±0.10 0.61±0.16 0.56±0.17 0.67±0.17 0.55±0.09 1.06±0.31 0.31±0.05▲0.76±0.24 0.48±0.13 0.60±0.19 0.48±0.11 2.04±0.50▲0.24±0.07▲0.64±0.16 0.35±0.10▲0.56±0.18 0.38±0.12▲1.82±0.44 0.33±0.08▲◇0.67±0.13 0.41±0.10 0.68±0.09 0.34±0.08▲

表3 藥物對(duì)MRL/lpr鼠脾巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表3 藥物對(duì)MRL/lpr鼠脾巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型組 中藥組 強(qiáng)的松組 中西藥結(jié)合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.43±0.49 0.29±0.02 0.70±0.20 0.44±0.10 0.65±0.19 0.38±0.11 1.07±0.28 0.23±0.04 0.67±0.11 0.42±0.12 0.44±0.09 0.37±0.11 2.21±0.90 0.19±0.02▲0.59±0.14 0.32±0.09 0.49±0.11 0.28±0.05 1.93±0.76 0.21±0.04▲0.64±0.11 0.33±0.07 0.52±0.06 0.28±0.06

3 討論

SLE的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，而治療多以免疫抑制劑為主，雖然疾病得以控制，但感染等副作用凸顯，導(dǎo)致近年來(lái)疾病的死亡原因發(fā)生了很大的變化，疾病本身導(dǎo)致的死亡大大減少，而感染及藥物副作用導(dǎo)致的心血管疾病成為死亡的主因。課題組統(tǒng)計(jì)了12篇有關(guān)SLE死因分析及感染分析的文獻(xiàn)共涉及患者4653 例[3-14]，其中發(fā)生感染1872例，其中革蘭氏陰性細(xì)菌感染337例，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染202例，未區(qū)分種類346例，真菌434例，病毒384例，由以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌感染占SLE所有感染的47.3%，因此課題組認(rèn)為細(xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌的感染是SLE感染的主要因素。課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能，而解毒祛瘀滋陰方可以緩解糖皮質(zhì)激素的作用[15]。因此，課題組進(jìn)一步研究了解毒祛瘀滋陰方減少糖皮質(zhì)激素副作用的作用機(jī)制。

表4 藥物對(duì)MRL/lpr鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表4 藥物對(duì)MRL/lpr鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型組 中藥組 強(qiáng)的松組 中西藥結(jié)合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.81±0.73 0.31±0.05 0.88±0.34 0.58±0.14 0.66±0.12 0.37±0.08 1.36±0.41 0.20±0.03▲0.51±0.17▲0.42±0.11 0.47±0.10 0.31±0.08 2.54±0.67 0.15±0.03▲0.69±0.14 0.36±0.09▲0.46±0.07 0.22±0.06▲2.17±0.52 0.17±0.02▲0.74±0.18 0.36±0.13▲0.44±0.05▲0.17±0.05▲

圖1 各組脾巨噬細(xì)胞TLR4蛋白電泳圖（A）及其統(tǒng)計(jì)（B）Fig.1 The electrophoretogram of TLR4 protein expression in splenic macrophages in each group(A)and its statistical graph(B).

TLR4主要識(shí)別革蘭氏陰性菌的LPS、革蘭氏陽(yáng)性菌的磷壁酸和熱休克蛋白60等，因此TLR4與細(xì)菌等感染密切相關(guān)。未經(jīng)治療的初發(fā)SLE患者的外周血細(xì)胞TLR4 mRNA水平顯著升高[16]，而穩(wěn)定期的SLE患者合并感染與不合并感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞的TLR4的陽(yáng)性率沒(méi)有差異，活動(dòng)期SLE患者合并感染及不合并感染者PBMC的TLR4的陽(yáng)性率也沒(méi)有差異[17]，而正常情況下伴有細(xì)菌感染特別是革蘭氏陰性菌感染的患者TLR4的表達(dá)都有一定程度的升高。應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、來(lái)氟米特、甲氨蝶呤、霉酚酸酯等免疫抑制劑的自身免疫病患者（包括SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、干燥綜合癥等），有TLR4表達(dá)升高的現(xiàn)象[18]，說(shuō)明TLR4的異常不僅與糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的治療有關(guān)，而且與疾病也有密切關(guān)系。這些患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)TLR1/2/4/5/6配體的刺激后，IL-8和TNF-α的分泌比正常組顯著升高，因此自身免疫病患者應(yīng)用免疫抑制劑后，其固有免疫反應(yīng)不是減弱而是增強(qiáng)。但這些患者更容易發(fā)生感染，原因并非固有免疫被抑制，而是功能失調(diào)，同時(shí)這可能與TLR4相關(guān)信號(hào)通路異常有關(guān)。因此，TLR4信號(hào)通路的異常與SLE的發(fā)病、免疫抑制劑的副作用都有密切關(guān)系。

解毒祛瘀滋陰方在之前的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，可以減少糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的SLE患者感染的發(fā)生[1]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀滋陰方可以減輕糖皮質(zhì)激素抑制巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的作用，故本研究希望通過(guò)MRL/lpr狼瘡鼠動(dòng)物模型進(jìn)一步明確解毒祛瘀滋陰方減輕糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的感染副作用的機(jī)制。MRL/ lpr狼瘡鼠應(yīng)用糖皮質(zhì)激素之后，TLR4 mRNA的表達(dá)升高與文獻(xiàn)報(bào)道一致，糖皮質(zhì)激素結(jié)合解毒祛瘀滋陰方治療后TLR4 mRNA的表達(dá)有不同程度的降低，脾巨噬細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)也降低，表明中藥可以調(diào)控糖皮質(zhì)激素造成的TLR4 mRNA和蛋白的異常表達(dá)。由于肺、腹腔巨噬細(xì)胞含量較少，因此只檢測(cè)脾TLR4蛋白的表達(dá)。課題組推測(cè)因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素具有免疫抑制作用，可以降低巨噬細(xì)胞的吞噬作用，而TLR4是識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的LPS的受體，機(jī)體通過(guò)升高TLR4的表達(dá)以降低機(jī)體感染的風(fēng)險(xiǎn)，這相當(dāng)于機(jī)體在糖皮質(zhì)激素作用下的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。同時(shí)TLR4下游信號(hào)通路亦被抑制，如MyD88、TRIF以及發(fā)揮激活炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子IFN-α、IFN-β、iNOS也都有不同程度的降低，這可能就是糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致感染發(fā)生的原因之一。糖皮質(zhì)激素合用中藥后，TLR4的表達(dá)不同程度的降低，而其下游分子未見(jiàn)進(jìn)一步下降，可見(jiàn)中藥可以恢復(fù)糖皮質(zhì)激素對(duì)TLR4分子的異常調(diào)控，但未進(jìn)一步抑制其下游信號(hào)分子，導(dǎo)致免疫抑制進(jìn)一步加重。綜上所述，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后，MRL/lpr狼瘡鼠免疫受到抑制，TLR4信號(hào)通路發(fā)生異常，而合用解毒祛瘀滋陰方中藥后TLR4蛋白的異常表達(dá)得到緩解，而其下游的信號(hào)分子未進(jìn)一步惡化，這可能就是中藥減輕糖皮質(zhì)激素造成感染副作用的作用機(jī)制。

References

[1] 溫成平,范永升,李永偉,等.中西醫(yī)結(jié)合治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的增效減毒作用研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,31 (3):305-309. WEN Chenpin,FAN Yongshen,LI Yongwei,et al.Investigation on the Adding Curative Effect and Reducing Poisonous or Side Effect of Integrated Traditional Chinese and W estern Medcine in Treating Systemic Lupus Erythematosus[J].Journal of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,2007,31(3):305-309.

[2] 張放,李鐵英,康健.糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)及對(duì)LPS反應(yīng)性的研究 [J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2009,29(2):156-159 ZHANG Fang,LI Tieying,KANG Jian.Expression of Toll·like receptor 4 in alveolar macrophages of diabetic rats and response to LPS[J].The Chinese journal of microbiology and immunology,2009,29(2):156-159.

[3] 許潔,趙東寶.系統(tǒng)性紅斑狼瘡142例臨床分析[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2006,8(12):1668-1668. XU Jie,ZHAO Dongbao.Clinical analysis of 142 cases of systemic lupus erythematosus[J].Journal of Chinese physician,2006,8(12):1668-1668.

[4] 王秦,王遷,曾小峰,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡187例死亡病例分析[J].中國(guó)醫(yī)藥,2008,3(10):598-599. WANG Qin,WANG Qian,ZENG Xiaofeng,et al.analysis of 187 death cases of Systemic lupus erythematosus [J].China Medicine,2008,3(10):598-599.

[5] 周文靜,曾婷,楊程德.系統(tǒng)性紅斑狼瘡487例住院患者發(fā)熱的病因及相關(guān)分析[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2008,12(11): 757-761. ZHOU Wenjin,ZENG Ting,YANG Chende.Causes of feverin systemic lupus erythematosus：a retrospective study of 487 hospitalized patients[J].Chinese Journal of Rheumatology,2008,12(11):757-761.

[6] 董光富,葉任高,張曉,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡并發(fā)感染的流行病學(xué)研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(7):755-758. DONG Guangfu,YE Rengao,ZHANG Xiao,et al.Epidemiology of Systemic Lupus Erythematosus Patients with Infection[J].Chinese Journal of Nosocomiology,2004,14(7): 755-758.

[7] 魏巍,呂良敬,郭強(qiáng),等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并肺部院內(nèi)感染的易感因素和細(xì)菌學(xué)分析[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2008,10(4): 539-540. WEI Wei,LV Liangjin,GUO Qiang,et al.Susceptibility Factors and Bacteriological Analysis of Systemic Lupus Erythematosus Complicated with Nosocomial Infection in the Lung[J].Journal of Chinese Physician,2008,10(4):539-540.

[8] 裘昊旻,宣丹旦,鄒和建.系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并感染130例回顧性分析[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2009,13(6):390-393. QIU Haomin,XUAN Dandan,ZOU Hejian.A clinical retrospective study of 130 systemic lupus erythematosus patients complicated with infections[J].Chinese Journal of Rheumatology,2009,13(6):390-393.

[9] 徐剛,劉美琳,余開(kāi)梅.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者醫(yī)院感染的調(diào)查研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2003,7(4):216-219. XU Gang,LIU Meilin,YU Kaimei.A propective study of nosocomial infection in patients with systemic lupus erythematosus[J].Chinese Journal of Rheumatology,2003,7(4): 216-219.

[10]韋明欣,唐紹賢.226例系統(tǒng)性紅斑狼瘡醫(yī)院感染調(diào)查[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,1999,9(4):222-223. WEI Mingxin,TANG Shaoxian.Investigation on nosocomial infection of systemic lupus erythematosus in 226 cases[J].Chinese Journal of Nosocomiology,1999,9(4):222-223.

[11]王衛(wèi)兵,袁福兵,石堯忠.系統(tǒng)性紅斑狼瘡醫(yī)院感染調(diào)查分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,1996,6(4):224-226.

WANG Weibin,YUAN Fubin,SHI Yaozhong.Investigation and Analysis of Nosocomial Infection in Systemic[J]. Chinese Journal of Nosocomiology,1996,6(4):224-226.

[12]董光富,張曉,雷云霞,等.重癥監(jiān)護(hù)病房系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者預(yù)后因素分析[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2009,13(7):463-466. DONG Guangfu,ZHANG xiao,LEI Yunxia,et al.Analysis of prognostic factors of systemic lupus erythematosns pafients admitted to the intensive care unit[J].Chinese Journal of Rheumatology,2009,13(7):463-466.

[13]許德清,陳偉雄,曾凡欽.系統(tǒng)性紅斑狼瘡與感染544例臨床分析[J].臨床皮膚科雜志,2008,37(2):72-75. XU Deqing,CHEN Weixiong,ZENG Fanqin.Infections in systemic lupuserythem atosus：retrospective clinical analysis of 544 case[J].Journal of Clinical Dermatology, 2008,37(2):72-75.

[14]姚冬云,許維梅,郭蘭君,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者醫(yī)院感染調(diào)查[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2005,5(1):180-182. YAO Dongyun,XU Weimei,GUO Lanjun,et al.Investigation of nosocomial infection in patients with systemic lupus erythematosus[J].Chinese Journal of Misdiagnosis, 2005,5(1):180-182.

[15]謝冠群,季巾君,徐莉,等.解毒祛瘀滋陰方對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,32(6):1264-1266. XIE Guanqun,JI Jinjun,XU Li,et al.Effect of Jiedu Quyu Ziyin Recipe on Phagocytosis of Macrophage[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2014, 32(6):1264-1266.

[16]沈小雁,薛峰,陳曉鴻,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單一核細(xì)胞Toll樣受體4及2mRNA表達(dá)研究[J].中華皮膚科雜志,2004,37(10):572-574. SHEN Xiaoyan,XUE Feng,CHEN Xiaohong,et al.Expression of TLR4 and TLR2 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus[J].Chinese Journal of Dermatology,2004,37 (10):572-574.

[17]張梅,鞏路,陳且峰,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2010,14(10):721-722. ZHANG Mei,GONG Lu,CHEN Qiefeng,et al.Expression of Toll-like receptors 2 and 4 in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus[J].Chinese Journal of Rheumatology,2010,14(10): 721-722.

[18]Dunne DW,Shaw A,Bockenstedt LK,et al.Increased TLR4 expression and downstream cytokine production in immunosuppressed adults compared to non-immunosuppressed adults[J].PLoS One,2010,5(6):e11343.

Effects of Jiedu Quyu Ziyin Decoction on TLR4 Signal Pathway in Lung,Spleen and Peritoneal Macrophagocyte of MRL/lpr Lupus Mice Treated by Prednisone

XIE Guanqun,JI Jinjun,FAN Yongsheng College of Basic Medical Sciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)China

[Objective]To observe the effect of Jiedu Quyu Ziyin decoction on TLR4 signaling pathway in macrophages of MRL/lpr lupus mice.[Method]MRL/ lpr lupus mice were divided into four groups:model group,prednisone group,Jiedu Quyu Ziyin decoction group(hereinafter referred to as:Chinese medicine group)and prednisone plus Chinese medicine group(hereinafter referred to as:combination of Chinese and western medicine group).The mice were gavaged with saline,prednisone,Jiedu Quyu Ziyin decoction and prednisone added Jiedu Quyu Ziyin decoction for 4 weeks.Macrophages of lung,peritoneal and spleen were collected and the expression of related genes was detected by RT-PCR.[Result]TLR4 mRNA in lung macrophages,and TLR4 protein in splenic macrophages increased significantly(P＜0.05)after the treatment of prednisone.The increased TLR4 protein in splenic macrophages was significantly decreased by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).Prednisone can significantly reduce the TLR4 downstream molecules such as MyD88, IFN-α,iNOS mRNA expression in lung and peritoneal macrophages(P＜0.05).The decreased MyD88 mRNA in lung macrophages was increased significantly by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).[Conclusion]TLR4 signaling pathway is changed in macrophages after glucocorticoid administration in MRL/lpr lupus mice.Jiedu Quyu Ziyin decoction can reduce the abnormal glucocorticoid-induced TLR4 protein expression.

systemic lupus erythematosus;MRL/lpr lupus mice;macrophagocyte;Jiedu Quyu Ziyin decoction;glucocorticoid;side effect;Toll-like receptor

R331

A

1005-5509（2017）04-0318-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.016

2016-11-25）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81403289）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ14H270003）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201327513）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題（2012ZR01）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院院級(jí)科研基金

Fund projects:NationalNaturalScience Foundation ofChina(81403289);NaturalScience Foundation ofZhejiang Province(LQ14H270003);Scientific Research Projects of Zhejiang Province Education Department(Y201327513);Science Foundation of Zhejiang Chinese Medical University(2012ZR01);Science Foundation of College of Basic Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

范永升，E-mail：fyszjtcm@163.com