柚皮黃酮的提取工藝及紅外光譜分析

余先純 +王向軍

摘要：采用微波聯(lián)合酶法提取柚皮黃酮，探討了微波功率、微波處理時(shí)間、酶解溫度、酶液用量、酶解時(shí)間和緩沖液pH值對(duì)黃酮提取率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。紅外光譜分析顯示，提取物為典型的黃酮類化合物。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在微波功率350 W、微波處理時(shí)間10 min、酶解時(shí)間90 min、酶液用量0.9%（m/m）、酶提取溫度 55 ℃ 和緩沖液pH值4.5的條件下，黃酮的提取率可達(dá)到5.93%。

關(guān)鍵詞：柚皮黃酮；微波處理；酶法；紅外光譜

中圖分類號(hào)： TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0137-03

柚皮是豐富廉價(jià)的果實(shí)廢棄物，其中除了含有豐富的芳香油、果膠、色素外，還有經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等生物類黃酮物質(zhì)[1]，柚皮中的黃酮具有抗氧化、抗菌、抗突變、抗腫瘤等多種作用，廣泛用于醫(yī)藥、食品及美容等行業(yè)[2]。傳統(tǒng)的提取方法多為溶劑提取法，但提取時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品活性及純度低。而酶法提取技術(shù)與微波聯(lián)合提取法在許多方面發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其中酶法提取條件溫和、能耗低、無(wú)污染[3]，但提取速度慢。微波輔助提取是利用微波場(chǎng)的特性和優(yōu)點(diǎn)來(lái)強(qiáng)化天然產(chǎn)物有效物質(zhì)浸出的提取方法。它具有提取效率高、消耗溶劑少、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，采用微波聯(lián)合酶法提取技術(shù)，可以在低溫環(huán)境下加速胞內(nèi)物質(zhì)溶出，節(jié)省提取時(shí)間、加快反應(yīng)速率和提高產(chǎn)率。

目前，關(guān)于利用微波聯(lián)合酶法提取柚皮黃酮的研究報(bào)道還不多見(jiàn)。本研究以柚皮為原料，采用微波聯(lián)合酶法聯(lián)用技術(shù)提取柚皮黃酮，并利用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲取最佳的提取工藝。

1材料與方法

1.1材料

柚皮從水果市場(chǎng)購(gòu)得；纖維素酶，諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品（美國(guó)Sigma公司）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

FH102微型植物試樣粉碎機(jī)（湖北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠）；SHZ-82數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（江蘇科興電器有限公司）；MAS-Ⅱ型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（Varian 2000，中國(guó)）。

1.2方法[HT]

1.2.1柚皮預(yù)處理

用蒸餾水將柚皮洗凈后放入鼓風(fēng)干燥箱，在80 ℃恒溫干燥3 h，再用微型植物試樣粉碎機(jī)破碎至60目。取柚皮粉末3.0 g，按1 ∶[KG-*3]18的料液比后置于常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站，在設(shè)定的功率下處理一段時(shí)間后冷卻至40 ℃，得到預(yù)處理液。

1.2.2柚皮黃酮的提取

在預(yù)處理液中加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，加入200 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液[5]，調(diào)節(jié)pH值后置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，在一定的溫度下提取一定時(shí)間，再冰浴冷卻至常溫，然后減壓、抽濾，得到柚皮黃酮提取液。同時(shí)，采取在無(wú)微波輔助條件下進(jìn)行的對(duì)比試驗(yàn)。

1.2.3柚皮黃酮的分析

樣品總黃酮含量的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。

黃酮提取率按照（1）式計(jì)算：

[JZ（]黃酮提取率=[SX（]總黃銅質(zhì)量桔皮粉質(zhì)量[SX）]×100%。[JZ）][JY]（1）

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

在探索性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以柚皮黃酮的提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，考察微波處理時(shí)間、微波功率、酶解溫度、酶液用量、酶解時(shí)間和緩沖液pH值對(duì)黃酮提取率的影響，以確定提取黃酮的最佳條件。

2.1.1微波處理時(shí)間和功率的影響

在酶解溫度55 ℃、酶液用量0.8%、酶解時(shí)間90 min和緩沖液pH值為4.5條件下，設(shè)置微波功率分別為200、250、300、350 W。由圖1可知，微波功率對(duì)黃酮提取率的影響很大，功率低時(shí)，黃酮提取率較低；隨著功率的升高，黃酮提取率不斷升高，但10 min后，功率為300 W的提取率與350 W的相接近，考慮到生產(chǎn)成本，將功率確定為300 W。同時(shí)，當(dāng)功率為300 W時(shí)，10 min后，黃酮提取率增幅趨緩，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率曲線幾乎接近水平，這是因?yàn)槲⒉訜崮苁褂幸号蓊惖募?xì)胞瞬間膨脹破碎，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)，在提取初期，時(shí)間越長(zhǎng)，胞內(nèi)物質(zhì)釋放物越多[7]，黃酮的提取率也就越高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)釋放物的含量逐步減少，黃酮提取率增加不明顯。故將微波處理時(shí)間確定為10 min。

2.1.2酶解溫度和酶液用量對(duì)提取率的影響

在微波功率300 W、微波處理時(shí)間10 min、酶解時(shí)間90 min和緩沖液pH值為4.5的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置酶解溫度45、50、55、 60 ℃。由圖2可知，相同條件下，酶解溫度為55 ℃時(shí)提取率最高，因此在本試驗(yàn)中選取55 ℃為酶法提取溫度。在55 ℃時(shí)，酶液用量低于0.8%時(shí)，隨著酶液用量的增加，柚皮黃酮提取率明顯增加，當(dāng)酶液用量超過(guò)此值時(shí)，黃酮提取率增加緩慢。

2.1.3緩沖液pH值和酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

選取微波功率[KG*8]300[KG*3]W、微波處理時(shí)間[KG*8]10[KG*3]min、酶解溫度[KG*8]55[KG*3]℃[KG*8]及酶液

用量0.8%，考察不同酶解時(shí)間和緩沖液不同pH值對(duì)黃酮提取率的影響，由圖3可知，在酶解時(shí)間為90 min、緩沖液pH值約為4.5時(shí)，柚皮黃酮提取率較高，而pH值低于或超過(guò) 4.5 后提取率均較小。這可能是由于pH值約為4.5時(shí)酶的活性較好的緣故，因此確定pH值為4.5。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)90 min后再延長(zhǎng)提取時(shí)間，黃酮提取率降低，故選擇90 min作為酶解時(shí)間。

2.2正交試驗(yàn)分析

為了使提取黃酮提取工藝更加科學(xué)和合理，在進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取提取液pH值為4.5，采用L16（45）多因素正交試驗(yàn)對(duì)提取黃酮的微波功率、微波處理時(shí)間、酶解時(shí)間、酶液用量和酶提取溫度5個(gè)有重要影響的因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：影響黃酮提取率的因素順序?yàn)锽>A>D>C>E，工藝的最佳組合為B2A4D2C2E2，即微波功率350 W、微波處理時(shí)間10 min、酶解時(shí)間90 min、酶液用量0.9%和酶提取溫度55 ℃。按上述最優(yōu)條件追加3次試驗(yàn)，提取柚皮黃酮的平均提取率為5.93%。而在其他工藝條件相同，但無(wú)微波的條件下，采用酶法提取法，黃酮的提取率僅為4.24%，酶解時(shí)間240 min。因此，可見(jiàn)微波有利于提高黃酮的提取率及加快提取速度。

2.3紅外光譜分析

由于天然黃酮類化合物母核上常含有烴氧基、甲氧基、異戊烯氧基和羥基等基團(tuán)，其紅外光譜在3 100～3 460 cm-1、1 600～1 640 cm-1，以及1 372、1 242、1 058 cm-1的振動(dòng)峰可代表黃酮類化合物的特征峰。

由圖4可知，柚皮黃酮紅外譜在3 390 cm-1附近有羥基締合形成寬而強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明有大量的酚羥基或糖上的羥基存在；同時(shí)，在2 932、2 862、1 370 cm-1附近有較強(qiáng)的表征2-[CM（23*2]和3-的吸收峰出現(xiàn)，證明飽和碳上的氫較多；而在

1 740 cm-1 附近由酯羰基（C—O）引起的伸縮振動(dòng)峰雖然較弱，但在1 646 cm-1附近仍然有羰基的伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)；此外，在1 646、1 518～1 322 cm-1范圍內(nèi)有若干表征苯環(huán)的吸收峰存在；且在1 320～1 158 cm-1有由羥基的彎曲振動(dòng)引起的吸收峰出現(xiàn)；而在1 246和1 060 cm-1附近也出現(xiàn)了C—O—C 的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；最后，在890～700 cm-1附近還出現(xiàn)了苯環(huán)上取代基位置引起的吸收峰。以上特征峰的出現(xiàn)，均說(shuō)明提取物為典型的黃酮類化合物。

3結(jié)論與討論

采用微波輔助酶法提取柚皮黃酮，微波的使用有利于提高黃酮的提取量和加快提取速度，而酶法的使用可以降低較高溫度對(duì)黃酮生物活性的影響。微波的功率、微波處理時(shí)間、緩沖液的pH值以及提取溫度、時(shí)間和酶液用量等因素均對(duì)黃酮的提取量有較大影響。

在緩沖液pH值為4.5的情況下，經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的提取工藝條件為：微波功率350 W、微波處理時(shí)間10 min、酶解時(shí)間90 min、酶液用量0.9%和酶提取溫度55 ℃，柚皮黃酮的提取率可達(dá)5.93%。

紅外光譜分析顯示，采用本方法所得到的提取物為典型的黃酮類化合物。

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