龜裂禿馬勃的分子鑒定及生物學(xué)特性

田亞琴 牛玉蓉 +劉宇 +李華敏 +王守現(xiàn)

摘要：以1株野生馬勃屬菌株為研究對象，通過核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析鑒定為龜裂禿馬勃。以菌絲生長速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長勢為指標(biāo)，研究其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，龜裂禿馬勃的最適碳源為淀粉，最適氮源為尿素，最適碳氮比為20 ∶[KG-*3]1，最適溫度為28 ℃，最適生長因子為維生素B6，最適pH值為5.0。

關(guān)鍵詞：龜裂禿馬勃；鑒定；組織分離；生物學(xué)特性

中圖分類號： S646.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0109-03

龜裂禿馬勃（Calvatia utriformis，Handkea utriformis），別稱浮雕禿馬勃、龜裂馬勃，是馬勃菌目馬勃菌科禿馬勃屬真菌[1]。其子實體中等至大型，陀螺形，寬6～10 cm，高8～12 cm，白色，漸變?yōu)榈P色，最后變淺褐色；外包被常龜裂，內(nèi)包被薄，頂部裂成碎片，露出青色的產(chǎn)孢體，基部的不孕體大，并有一橫膜與產(chǎn)孢體分隔開；孢子球形，光滑，青黃色，直徑3.0～4.5 μm，內(nèi)含1個油點；孢絲絲狀，稍分枝，青黃色，易斷。劉波早在1984年報道，龜裂禿馬勃具有止血、消毒、解毒等藥用功效[2]。目前，國內(nèi)對龜裂禿馬勃的研究較少，且多偏向于醫(yī)學(xué)方面。鄧志鵬等概述了馬勃的藥理作用和臨床應(yīng)用，為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)[3]；徐力等探討了大馬勃（C. gigantea）提取液體外抗腫瘤作用[4]；郭玫等對馬勃進行了系統(tǒng)研究，從生藥學(xué)、品質(zhì)評價、化學(xué)成分、藥理研究等方面作了概述[5]。

盡管許多研究表明馬勃具有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值，但是對于馬勃馴化栽培的研究鮮有報道。近年來，筆者從野外采集了1株禿馬勃屬真菌，編號為JZB2115010，對其進行分子鑒定，并以菌絲生長速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長勢為指標(biāo)，開展生物學(xué)特性的研究，以篩選出較佳生長條件，為其人工馴化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1培養(yǎng)基材料

1.1.1綜合PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、大豆蛋白胨5 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、維生素B1 10 mg，加水至1 000 mL。

1.1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂16 g，加水至 1 000 mL。

1.1.3加富培養(yǎng)基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、馬鈴薯200 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂16 g，加水至1 000 mL。

1.2野生菌母種分離

2010年8月25日在北京市房山區(qū)蒲洼林地采集1種禿馬勃屬真菌，組織分離獲得該野生菌的母種。

1.3野生菌株分子鑒定

利用核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的通用引物ITS4和ITS5對分離的野生菌株進行ITS-PCR鑒定[6-9]。

1.4同步菌絲制備

母種純化分離好后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，待菌絲基本長滿培養(yǎng)皿時，用6 mm的打孔器在菌絲邊緣打孔，用接種針挑取菌塊轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)皿的中央，置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，以獲得相同菌齡的菌絲，保證后續(xù)生物學(xué)特性研究的準(zhǔn)確[9]。

1.5野生菌株生物學(xué)特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值的測定，參照文獻(xiàn)[9-11]中的方法。

菌絲日生長速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長勢的測定，參照文獻(xiàn)[9]中的方法。

2結(jié)果與分析

2.1野生菌株的鑒定結(jié)果

用ITS4、ITS5通用引物對野生菌株的DNA進行擴增、測序。將測序結(jié)果提交至GenBank，登錄號為JQ293098.1。BLAST分析表明，野生菌JZB2115010擴增序列與登錄號為EU833659.1、JN411549.1的龜裂禿馬勃（H. utriformis）同源性均達(dá)到99%。因此，結(jié)合圖1子實體形態(tài)可確定分離菌株為龜裂禿馬勃。

2.2.4生長因子對龜裂禿馬勃菌絲生長的影響

由表4可知，不同生長因子對龜裂禿馬勃菌絲生長有一定影響，其中維生素B6處理的菌絲生長速度最快，達(dá)1.45 mm/d，但與維生素C、玉米漿、維生素B2、肌醇處理差異不顯著。在菌絲干質(zhì)量方面，維生素B2的干質(zhì)量最高，達(dá)0.082 0 g，但與肌醇、維生素B6、維生素C處理差異不顯著；對照和維生素B1處理菌絲干質(zhì)量最低，但差異不顯著。在菌絲生長勢方面，維生素B6處理表現(xiàn)最好，菌絲潔白濃密；對照和維生素B1處理表現(xiàn)最差。綜合考慮，龜裂禿馬勃的最適生長因子為維生素B6。

2.2.5溫度對龜裂禿馬勃菌絲生長的影響

2.2.6pH值對龜裂禿馬勃菌絲生長的影響

由表6可知，不同pH值對龜裂禿馬勃菌絲生長影響明顯。龜裂禿馬勃菌絲在pH值為 4.5～8.0范圍內(nèi)均能生長；在pH值為4.5～60時，菌絲潔白，生長勢強；當(dāng)pH值為5.0時，菌絲生長最快，達(dá)1.63 mm/d，pH值為5.5時，長速為 1.60 mm/d，二者差異不顯著；pH值為8.0時，菌絲生長速度最慢，僅為 0.96 mm/d。從菌絲體干質(zhì)量來看，pH值為5.0時，菌絲體干質(zhì)量最高，為0.253 7 g，且與pH值為4.5、5.5、6.0的處理之間差異不顯著；pH值為7.5時菌絲干質(zhì)量最低，僅為0039 9 g，與pH值為8.0的處理差異不顯著。從菌絲生長勢來看，pH值為5.0時菌絲長勢最旺；其次是pH值為4.5、5.5、6.0處理；菌絲在pH值為8.0長勢最弱。因此，綜合以上分析，本試驗選取的最適pH值為5.0。

3討論與結(jié)論

龜裂禿馬勃子實體鮮嫩可食，營養(yǎng)豐富，有益于人體健康，既具有經(jīng)濟價值，又具有藥用價值。因此，對龜裂禿馬勃進行生物學(xué)特性研究，有助于更好地培育龜裂禿馬勃，促進其開發(fā)利用。本研究表明，龜裂禿馬勃最適碳源是淀粉，這一結(jié)果與賀新生等報道的雙環(huán)林地蘑的最適碳源一致[12]，當(dāng)龜裂

禿馬勃以其他成分為碳源時，菌絲可以生長，但長勢不好，其中以乳糖長勢表現(xiàn)最差。在氮源利用方面，龜裂禿馬勃最適氮源是尿素，在黃豆粉上表現(xiàn)最差，該結(jié)果與張國廣等報道的野生小馬勃的最適氮源為黃豆粉和麥麩混合物的結(jié)果不一致[13]，這可能是因為小馬勃和龜裂禿馬勃同屬不同種，故對氮源利用存在差異；此外，本研究結(jié)果與陳芝蘭等報道的黑脈羊肚菌[14]和黃春燕等報道的大球蓋菇[15]的最適氮源相一致。最適碳氮比是20 ∶[KG-*3]1，這與鄒莉等對亞側(cè)耳所報道的適宜碳氮比[10]相一致。最適生長因子是維生素B6，這與丁珊珊等對野生裸蓋菇L-001菌株報道的最適生長因子[16]相一致。最適溫度為28 ℃，這一結(jié)果與張國廣等報道的野生小馬勃的最適溫度[13]相一致，當(dāng)溫度高于36 ℃時龜裂禿馬勃不生長，另外筆者近年來研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)食用菌的最適生長溫度為28 ℃[9，17]。最適pH值為5.0，這一結(jié)果與張國廣等報道野生小馬勃的最適pH值不一致，其最適pH值為5.5[13]，兩者差別不大，可能是由于試驗誤差造成的數(shù)據(jù)不一致，但由此可知馬勃屬大多適宜在較低pH值的環(huán)境下生長。目前，未見其他關(guān)于龜裂禿馬勃最適氮源、碳源、碳氮比及最適生長因子的綜合研究報道，本研究可為龜裂禿馬勃的人工馴化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]彭衛(wèi)紅，甘炳成，譚偉，等. 四川省龍門山區(qū)主要大型野生經(jīng)濟真菌調(diào)查[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，16（1）：36-41.

[2]劉波. 中國藥用真菌[M]. 太原：山西人民出版社，1984.

[3]鄧志鵬，孫隆儒. 中藥馬勃的研究進展[J]. 中藥材，2006，29（9）：996-998.

[4]徐力，許冰. 大馬勃體外抗腫瘤作用初探[J]. 中國醫(yī)藥指南，2011，9（34）：264-265.

[5]郭玫，張揚. 中藥馬勃的研究概況[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，27（1）：60-62.

[6]沙濤，丁驊孫，張漢波，等. 利用松茸ITS特異性引物對松茸分離物進行鑒定[J]. 云南植物研究，2004，26（5）：524-528.

[7]戴溈田，張平. 中國幾種劇毒鵝膏菌的ITS序列分析[J]. 生命科學(xué)研究，2006（3）：110-113.

[8]王曉娥，姚方杰. 塊菌rDNA的ITS序列分析試驗條件的初步研究[J]. 中國食用菌，2006，25（5）：37-39.

[9]王守現(xiàn)，劉宇，許峰，等. 荷葉離褶傘菌株的ITS鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（社會科學(xué)版），2012，28（5）：148-152.

[10]鄒莉，王義，王軼，等. 亞側(cè)耳菌絲生物學(xué)特性研究[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：915-921.[HT][HJ][HT][LM]

[11]蔡丹鳳，陳美元，郭仲杰，等. 茯苓菌株生物學(xué)特性的研究[J]. 中國食用菌，2009，28（1）：23-26.

[12]賀新生，李純?nèi)A，康曉惠. 青藏高原黃綠蜜環(huán)菌純培養(yǎng)菌種的分離培養(yǎng)及分子鑒定雙環(huán)林地蘑菇的生物學(xué)特性和栽培特性[J]. 食用菌學(xué)報，2001，20（3）：23-28.

[13]張國廣，劉振富，張穎，等. 野生小馬勃的鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 中國食用菌，2009，28（6）：30-31，61.

[14]陳芝蘭，張涪平. 黑脈羊肚菌菌絲的生物學(xué)特性[J]. 食用菌，2004，26（6）：6-7.

[15]黃春燕，萬魯長，張柏松，等. 大球蓋菇菌絲生長適宜氮源研究[J]. 中國食用菌，2012，31（6）：18-19，23.

[16]丁珊珊，毛寧. 野生裸蓋菇L-001菌株的生物學(xué)特性[J]. 食用菌，2010，32（1）：24-26.

[17]王守現(xiàn)，劉宇，許峰，等. 野生黃傘JZB2116005菌株的鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35（3）：603-608.