毛竹組織培養(yǎng)中成熟種子消毒方法

江濤+李晨曦+陳磊+楊兆河+蘇軍+劉伯斌

摘要：成熟毛竹種子污染嚴重和萌發(fā)率低是制約毛竹組織培養(yǎng)發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)氯氣消毒優(yōu)于常規(guī)的次氯酸鈉和高錳酸鉀消毒法。試驗結(jié)果表明，氯氣消毒毛竹種子未污染率、萌發(fā)率分別可達45.60%±2.06%、3330%±5.51%，極顯著高于次氯酸鈉和高錳酸鉀消毒法；并且進一步優(yōu)化試驗條件，經(jīng)過1 d浸種，在0.01 mol/L氯氣濃度下處理7 h，毛竹種子的未污染率、萌發(fā)率分別可達96.23%±0.19%、74.00%±1.89%；且以氯氣消毒的種子能發(fā)育成實生苗和進行愈傷組織的誘導。成熟毛竹種子的氯氣消毒方法，可為今后更好地利用毛竹種子進行組織培養(yǎng)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：氯氣；毛竹；組織培養(yǎng)；未污染率；萌發(fā)率

中圖分類號：S795.705文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0103-03

中國毛竹（Phyllostachys heterocycla cv.pubescens）是一種重要的經(jīng)濟竹種，具有分布廣、種植面積大、蓄積量多等特點，具有重要的生態(tài)功能和經(jīng)濟社會價值[1]。目前，生產(chǎn)上主要采用移母竹的繁殖方式，其生產(chǎn)成本高，繁殖率低，很難滿足造林地需求[2-3]，通過組織培養(yǎng)進行快速繁殖被認為是發(fā)展竹類的新途徑[4]，有利于進一步開展基因工程育種。

毛竹組織培養(yǎng)一直是毛竹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[5]。目前，毛竹組織培養(yǎng)采用的外植體多為種子、鞭筍、冬筍及春筍。以毛竹筍為外植體容易消毒滅菌，但是組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象嚴重，且取材受季節(jié)限制[6-8]。已有報道以成熟種子經(jīng)過愈傷組織成功誘導出不定芽[9]，有研究發(fā)現(xiàn)成熟種子可以在液氮中直接保存[10]，從而能使成熟種子長期保存。以成熟毛竹種子為外植體進行組織培養(yǎng)研究不受季節(jié)限制，是優(yōu)良的組織培養(yǎng)材料[11]。李楠等研究發(fā)現(xiàn)，毛竹種子胚乳易受真菌污染，使得在無菌操作中污染率較高[12-13]，極大地增加工作量，故在無菌操作中控制污染成為毛竹組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵步驟之一[14]。為了解決毛竹種子在組織培養(yǎng)過程中無菌操作難的問題，本研究擬通過對不同的消毒方法進行比較，在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化消毒、萌發(fā)條件，以期解決毛竹種子消毒難和萌發(fā)率低的問題，為今后更好地利用毛竹種子進行組織培養(yǎng)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料[HT]

毛竹種子為福建省林業(yè)科學研究院提供的當年采收的毛竹種子，挑選出飽滿且沒有霉變的種子作為試驗材料。

1.2方法

1.2.1外植體消毒方法

（1）高錳酸鉀消毒法。預處理后毛竹種子浸泡在3%高錳酸鉀溶液中消毒2 h，用無菌水清洗5次，每次7 min，用無菌濾紙吸干水分后，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，15 d后統(tǒng)計未污染率、萌發(fā)率。（2）次氯酸鈉消毒法。預處理后的毛竹種子浸泡在30%次氯酸鈉溶液中消毒40 min，用無菌水清洗5次，每次7 min，用無菌濾紙吸干水分后，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，15 d后統(tǒng)計未污染率、萌發(fā)率。（3）氯氣消毒法。100 mL 10%次氯酸鈉與5 mL 36%濃鹽酸制備氯氣[15]，將去皮后的毛竹種子置入大培養(yǎng)皿中，然后在密閉的容器中，0.01 mol/L的氯氣濃度下消毒5 h后，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計未污染率和萌發(fā)率。

1.2.2毛竹種子浸泡處理

在氯氣消毒方法中，將毛竹種子分別浸在水中0、1、2、3 d后，在0.01 mol/L的氯氣濃度下消毒5 h，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，15 d后統(tǒng)計未污染率和萌發(fā)率。

1.2.3氯氣消毒濃度與時間組合選擇

本試驗選擇3種氯氣濃度，分別為0.005、0.01、0.02 mol/L；選擇1、3、5、7、9 h 5個梯度消毒時間（表1）。將濃度與時間進行組合處理，消毒后的毛竹種子接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計未污染率、萌發(fā)率。

1.2.4赤霉素處理

赤霉素有助于種子萌發(fā)。首先沖洗種子2 h，浸種2 d，200 mg/L赤霉素浸種2 h，然后在密閉的容器中，0.01 mol/L的氯氣濃度下消毒5 h，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計未污染率、萌發(fā)率。

1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基MS，添加蔗糖30 g/L，瓊脂9 g/L，pH值 5.8，121 ℃滅菌20 min。外植體通過以上方法消毒滅菌后，接種于含1 mL MS培養(yǎng)基的2 mL離心管中。由于毛竹種子污染嚴重，為避免種子交叉污染，每個離心管中放入1粒種子，每個試驗3次重復，每個重復使用500粒種子，25 ℃黑暗

培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計未污染率、萌發(fā)率。愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+500 mg/L Pro+500 mg/L Gln+300 mg/L +4 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L ZT，繼代培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L 2，4-D。

1.4數(shù)據(jù)分析

未污染率、萌發(fā)率按如下公式進行計算：未污染率=（未污染數(shù)/總接種數(shù)）×100%；萌發(fā)率=（萌發(fā)數(shù)/總接種數(shù)）×100%。所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2003和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1毛竹種子消毒方法的選擇

在組織培養(yǎng)中，常用消毒試劑有氯化汞、次氯酸鈉、高錳酸鉀，氯化汞由于會對環(huán)境產(chǎn)生影響，而很少使用。氯氣作為一種廣譜的消毒劑，具有很強的滲透和殺菌能力，本研究首先采用毛竹干種子，通過對高錳酸鉀、次氯酸鈉、氯氣3種消毒方法比較，結(jié)果采用高錳酸鉀消毒方法，未污染率、萌發(fā)率分別為（3.23±0.88）%、（2.46±0.57）%；采用次氯酸鈉消毒方法，未污染率、萌發(fā)率分別為（15.17±1.20）%、（23.66±4.58）%；采用氯氣消毒未污染率、萌發(fā)率分別可達（45.60±2.06）%、（33.30±5.51）%（圖1-A），氯氣消毒方法毛竹種子未污染率極顯著高于高錳酸鉀、次氯酸鈉消毒方法，能有效抑制真菌污染，且經(jīng)氯氣消毒的種子能正常萌發(fā)（圖1-B），結(jié)果表明，與次氯酸鈉、高錳酸鉀消毒比較，氯氣消毒是較優(yōu)的毛竹種子消毒方法。

2.2浸泡時間對毛竹種子未污染率、萌發(fā)率的影響

真菌孢子具有特殊的結(jié)構(gòu)，在消毒中很難被殺死，可能是造成毛竹種子消毒困難的原因之一。而在孢子萌發(fā)成營養(yǎng)體后消毒，則可以提高消毒效果。為了提高氯氣消毒毛竹種子的未污染率，本研究將在毛竹種子浸泡在水中0、1、2、3 d后再進行氯氣消毒，發(fā)現(xiàn)浸種1 d后的毛竹種子未污染率、萌發(fā)率分別為（97.27±0.34）%、（65.47±0.57）%（圖2），極顯著高于干種子和浸泡時間為2、3 d的種子，結(jié)果表明，水中浸種毛竹種子1 d可以提高氯氣消毒的效果。

2.3赤霉素處理對毛竹種子未污染率、萌發(fā)率的影響

赤霉素能促進種子萌發(fā)，在農(nóng)林業(yè)中得到廣泛應用。為了提高成熟毛竹種子的萌發(fā)率，本研究將浸種2 d的毛竹種子用200 mg/L赤霉素處理，以未進行赤霉素處理的種子為對照。結(jié)果表明，通過赤霉素處理后的毛竹種子萌發(fā)率可達（70.40±1.88）%，極顯著高于未經(jīng)過赤霉素處理的毛竹種子；未進行赤霉素處理的種子污染率稍有提高，但差異不顯著（圖[CM（24*3]3）。表明毛竹成熟種子組織培養(yǎng)過程中，可采用赤霉素

處理促進毛竹種子萌發(fā)。

2.4氯氣不同濃度和消毒時間對毛竹種子未污染率、萌發(fā)率的影響[HT]

浸種后再進行氯氣消毒可能會對毛竹種子造成傷害，從而影響萌發(fā)率。本研究對氯氣不同濃度和消毒時間進行進一步優(yōu)化，試驗結(jié)果（圖4）表明，在0.005[KG*3]mol/L的氯氣濃度

下，隨著消毒時間延長，未污染率提高，而萌發(fā)率沒有顯著變化，經(jīng)過9 h

[JP2]消毒未污染率、萌發(fā)率分別達到（18.00±163）%、（4423±[JP]2.56）%；在0.01 mol/L氯氣濃度下，隨著消毒時間延長，未污染率提高，最高可達（98.23±0.78）%，隨著氯氣處理時間的延長，萌發(fā)率先上升后下降，經(jīng)過7 h消毒未污染率、萌發(fā)率分別達到（96.23±0.19）%、（7400±189）%，延長消毒時間至9 h，未污染率沒有顯著性提高，但是萌發(fā)率急劇下降至30%左右；當進一步增加氯氣濃度，在 3 h 未污染率、萌發(fā)率達最高，分別為（86.00±1.89）%、（62.90±2.70）%，但進一步延長消毒時間，萌發(fā)率極顯著下降，在消毒9 h時，萌發(fā)率僅為（5.00±125）%，表明增加氯氣濃度、延長氯氣消毒時間會提高未污染率，同時也會抑制種子萌發(fā)。結(jié)果采用001 mol/L濃度的氯氣，處理7 h，是最適當?shù)南窘M合方法。

2.5氯氣消毒的毛竹種子成功誘導愈傷組織和無菌苗

氯氣消毒的毛竹種子能正常萌發(fā)，為驗證氯氣消毒會不會影響后期愈傷組織誘導和對實生苗產(chǎn)生影響，本研究進一步將所獲得萌發(fā)的毛竹種子接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，25 d后發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的毛竹種子在根和下胚軸部分膨大，產(chǎn)生致密淡黃色的愈傷組織（圖5-A），經(jīng)過50 d的進一步繼代培養(yǎng)，能成功誘導出顏色淡黃、疏松的胚性愈傷組織（圖5-B），進一步繼代誘導30 d可以發(fā)現(xiàn)有類似體胚的組織形成（圖5-C）。然后在接下來的4個月的繼代培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)胚狀體分化出不定芽。除此之外，將萌發(fā)的種子直接接種MS培養(yǎng)基，可以形成正常的實生無菌苗（圖5-D）并且可以進行擴繁。表明氯氣消毒法不會對后續(xù)的愈傷組織誘導和實生苗的培養(yǎng)造成影響。

3結(jié)論與討論

毛竹種子表面和胚乳中伴生著真菌[6]，毛竹組織培養(yǎng)中，種子消毒是關(guān)鍵的第一步。在常規(guī)消毒方法中，氯化汞為劇毒物質(zhì)，會對環(huán)境產(chǎn)生一定危害[14]，乙醇和次氯酸鈉消毒法被認為是毛竹外植體消毒的主要方法，但是效果欠佳[15]。本研究首先通過次氯酸鈉和鹽酸制備產(chǎn)生氯氣與常規(guī)次氯酸鈉和高錳酸鉀的消毒方法比較，結(jié)果氯氣消毒效果顯著高于[JP2]次氯酸鈉、高錳酸鉀，未污染率、萌發(fā)率分別可以達到（4560±[JP]2.06）%、（33.30±5.51）%，這可能是由于氯氣具有很強的滲透能力[16]，能殺死隱藏于毛竹種子腹縫溝中的真

菌，從而提高其殺菌效果。經(jīng)過1[KG*3]d的浸種，再使用氯氣處理，未污染率、萌發(fā)率分別可達（97.27±0.34）%、（6547±0.57）%，

極大提高了毛竹種子未污染率、萌發(fā)率?？赡芙?jīng)過 1 d 浸種，真菌孢子在合適的溫濕度條件下開始萌發(fā)成營養(yǎng)體[17]而增強氯氣消毒效果。為了進一步提高毛竹種子萌發(fā)率，優(yōu)化氯氣濃度和消毒時間，0.01 mol/L的氯氣濃度下，經(jīng)過7 h處理，未污染率、萌發(fā)率分別可達（9623±0.19）%、（74.00±1.89）%，再次提高毛竹種子的萌發(fā)率，遠高于李楠等的研究結(jié)果[12，15]，并且還可使用赤霉素處理進一步提高萌發(fā)率，經(jīng)過氯氣消毒后的成熟毛竹種子可以成功誘導出愈傷組織和實生苗。本研究解決了毛竹種子在組織培養(yǎng)過程中污染嚴重和萌發(fā)率低的問題，為今后毛竹高效再生體系的建立和基因工程研究奠定了基礎(chǔ)。

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